Ang mga immunomodulatory metabolite ay isang pangunahing katangian ng tumor microenvironment (TME), ngunit maliban sa ilang eksepsiyon, ang kanilang mga pagkakakilanlan ay nananatiling hindi pa lubos na kilala. Dito, sinuri namin ang mga tumor at T cell mula sa mga tumor at ascites ng mga pasyenteng may high-grade serous carcinoma (HGSC) upang ipakita ang metabolome ng iba't ibang TME compartments na ito. Ang mga ascite at tumor cell ay may malawak na pagkakaiba sa metabolite. Kung ikukumpara sa ascites, ang mga tumor-infiltrating T cell ay lubos na mayaman sa 1-methylnicotinamide (MNA). Bagama't mataas ang antas ng MNA sa mga T cell, ang ekspresyon ng nicotinamide N-methyltransferase (isang enzyme na nagpapabilis sa paglipat ng mga methyl group mula sa S-adenosylmethionine patungo sa nicotinamide) ay limitado sa mga fibroblast at tumor cell. Sa functional na aspeto, hinihikayat ng MNA ang mga T cell na ilabas ang tumor-promotering cytokine tumor necrosis factor alpha. Samakatuwid, ang TME-derived MNA ay nakakatulong sa immune regulation ng mga T cell at kumakatawan sa isang potensyal na target na immunotherapy para sa paggamot ng kanser sa tao.
Ang mga metabolite na nagmula sa tumor ay maaaring magkaroon ng malalim na epekto sa pagpigil sa resistensya laban sa tumor, at parami nang parami ang ebidensya na nagpapakita na maaari rin silang magsilbing pangunahing puwersang nagtutulak para sa paglala ng sakit (1). Bukod sa epekto ng Warburg, sinimulan na ng mga kamakailang pag-aaral na kilalanin ang metabolic state ng mga tumor cell at ang kaugnayan nito sa immune state ng tumor microenvironment (TME). Ipinakita ng mga pag-aaral sa mga modelo ng daga at mga human T cell na ang glutamine metabolism (2), oxidative metabolism (3) at glucose metabolism (4) ay maaaring kumilos nang nakapag-iisa sa iba't ibang subgroup ng immune cell. Maraming metabolite sa mga pathway na ito ang pumipigil sa anti-tumor function ng mga T cell. Napatunayan na ang pagharang sa coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) ay maaaring makapinsala sa paglaganap ng mga T cell, at ang pagtaas ng BH4 sa katawan ay maaaring mapahusay ang anti-tumor immune response na namamagitan sa CD4 at CD8. Bilang karagdagan, ang immunosuppressive effect ng kynurenine ay maaaring mailigtas sa pamamagitan ng pagbibigay ng BH4 (5). Sa isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant glioblastoma, ang pagtatago ng enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) ay pumipigil sa pag-activate, paglaganap, at aktibidad ng cytolysis ng T cell (6). Kamakailan lamang, ipinakita na ang methylglyoxal, isang by-product ng glycolysis, ay nalilikha ng mga suppressor cell na nagmula sa myeloid, at ang paglipat ng methylglyoxal sa T cell ay maaaring pumigil sa function ng effector T cell. Sa paggamot, ang neutralization ng methylglyoxal ay maaaring malampasan ang aktibidad ng mga myeloid-derived suppressor cell (MDSC) at synergistically na mapahusay ang checkpoint blockade therapy sa mga modelo ng daga (7). Ang mga pag-aaral na ito ay sama-samang binibigyang-diin ang pangunahing papel ng mga metabolite na nagmula sa TME sa pag-regulate ng function at aktibidad ng T cell.
Malawakang naiulat ang T cell dysfunction sa kanser sa obaryo (8). Ito ay bahagyang dahil sa mga metabolic characteristics na likas sa hypoxia at abnormal na tumor vasculature (9), na nagreresulta sa conversion ng glucose at tryptophan sa mga by-product tulad ng lactic acid at kynurenine. Ang labis na extracellular lactate ay nagbabawas sa produksyon ng interferon-γ (IFN-γ) at nagtutulak sa pagkakaiba-iba ng myelosuppressive subgroups (10, 11). Ang pagkonsumo ng tryptophan ay direktang pumipigil sa paglaganap ng T cell at pumipigil sa T cell receptor signaling (12-14). Sa kabila ng mga obserbasyong ito, maraming trabaho na nakapalibot sa immune metabolism ang isinagawa sa in vitro T cell culture gamit ang optimized media, o limitado sa mga homologous mouse model in vivo, na alinman sa mga ito ay hindi ganap na sumasalamin sa heterogeneity ng mga kanser sa tao at Physiological macro at micro environment.
Ang isang karaniwang katangian ng kanser sa obaryo ay ang pagkalat ng peritoneal at ang paglitaw ng mga ascite. Ang akumulasyon ng cell fluid sa ascites ay nauugnay sa paglala ng sakit at mahinang prognosis (15). Ayon sa mga ulat, ang natatanging kompartamento na ito ay hypoxic, may mataas na antas ng vascular endothelial growth factor (VEGF) at indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), at na-infiltrate ng mga T regulatory cell at myeloid inhibitory cell (15-18). Ang metabolic environment ng ascites ay maaaring naiiba sa mismong tumor, kaya ang reprogramming ng mga T cell sa peritoneal space ay hindi malinaw. Bilang karagdagan, ang mga pangunahing pagkakaiba at heterogeneity sa pagitan ng mga ascite at metabolite na nasa tumor environment ay maaaring makahadlang sa paglusot ng mga immune cell at ang kanilang function sa mga tumor, at kailangan ng karagdagang pananaliksik.
Upang malutas ang mga problemang ito, nagdisenyo kami ng isang sensitibong paghihiwalay ng selula at likidong chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) na pamamaraan upang pag-aralan ang iba't ibang uri ng selula (kabilang ang mga CD4+ at CD8+ T cell) pati na rin sa loob at sa pagitan ng mga tumor. Ang mga metabolite nito ay sumasaklaw sa mga selula sa parehong ascites at kapaligiran ng tumor ng pasyente. Ginagamit namin ang pamamaraang ito kasabay ng high-dimensional flow cytometry at single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) upang magbigay ng isang lubos na natukoy na larawan ng metabolic status ng mga pangunahing populasyon na ito. Ang pamamaraang ito ay nagpakita ng isang makabuluhang pagtaas sa antas ng 1-methylnicotinamide (MNA) sa mga tumor T cell, at ipinakita ng mga in vitro na eksperimento na ang immunomodulatory effect ng MNA sa function ng T cell ay dati nang hindi alam. Sa pangkalahatan, ipinapakita ng pamamaraang ito ang magkaparehong metabolic interaction sa pagitan ng mga tumor at mga immune cell, at nagbibigay ng mga natatanging pananaw sa mga immune regulation metabolite, na maaaring maging kapaki-pakinabang para sa paggamot ng mga T cell-based ovarian cancer immunotherapy.
Gumamit kami ng high-dimensional flow cytometry upang sabay na masukat ang glucose uptake [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) at mitochondrial activity [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ay magkatabing tipikal na mga marker na nagpapakilala sa mga immune cell at populasyon ng tumor cell (Table S2 at Figure S1A). Ipinakita ng pagsusuring ito na kumpara sa mga T cell, ang ascites at tumor cell ay may mas mataas na antas ng glucose uptake, ngunit may mas maliit na pagkakaiba sa mitochondrial activity. Ang average na glucose uptake ng mga tumor cell [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ay tatlo hanggang apat na beses kaysa sa mga T cell, at ang average na glucose uptake ng mga CD4 + T cell ay 1.2 beses kaysa sa mga CD8 + T cell, na nagpapahiwatig na ang Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) ay may iba't ibang metabolic requirements kahit na sa parehong TME (Figure 1A). Sa kabaligtaran, ang aktibidad ng mitochondrial sa mga selula ng tumor ay katulad ng sa mga CD4 + T cell, at ang aktibidad ng mitochondrial ng parehong uri ng selula ay mas mataas kaysa sa mga CD8 + T cell (Larawan 1B). Sa pangkalahatan, ipinapakita ng mga resultang ito ang antas ng metabolismo. Ang aktibidad ng metabolismo ng mga selula ng tumor ay mas mataas kaysa sa mga CD4 + T cell, at ang aktibidad ng metabolismo ng mga CD4 + T cell ay mas mataas kaysa sa mga CD8 + T cell. Sa kabila ng mga epektong ito sa iba't ibang uri ng selula, walang pare-parehong pagkakaiba sa katayuan ng metabolismo ng mga CD4 + at CD8 + T cell o sa kanilang relatibong proporsyon sa ascites kumpara sa mga tumor (Larawan 1C). Sa kabaligtaran, sa bahagi ng CD45-cell, ang proporsyon ng mga EpCAM+ cell sa tumor ay tumaas kumpara sa ascites (Larawan 1D). Naobserbahan din namin ang isang malinaw na pagkakaiba sa metabolismo sa pagitan ng mga bahagi ng EpCAM+ at EpCAM-cell. Ang mga EpCAM+ (tumor) cell ay may mas mataas na glucose uptake at mitochondrial activity kaysa sa mga EpCAM-cell, na mas mataas kaysa sa metabolic activity ng mga fibroblast sa mga tumor cell sa TME (Larawan 1, E at F).
(A at B) Median fluorescence intensity (MFI) ng glucose uptake (2-NBDG) (A) at mitochondrial activity ng mga CD4 + T cell (MitoTracker dark red) (B) Mga representatibong graph (kaliwa) at mga nakatala na datos (Kanan), mga CD8 + T cell at mga EpCAM + CD45-tumor cell mula sa ascites at tumor. (C) Ang ratio ng mga CD4 + at CD8 + cell (ng mga CD3 + T cell) sa ascites at tumor. (D) Proporsyon ng mga EpCAM + tumor cell sa ascites at tumor (CD45−). (E at F) EpCAM + CD45-tumor at EpCAM-CD45-matrix glucose uptake (2-NBDG) (E) at mitochondrial activity (MitoTracker dark red) (F) mga representatibong graph (kaliwa) at mga nakatala na datos (Kanan) Mga ascites at tumor cell. (G) Mga representatibong graph ng ekspresyon ng CD25, CD137 at PD1 sa pamamagitan ng flow cytometry. (H at I) Ekspresyon ng CD25, CD137 at PD1 sa mga CD4 + T cell (H) at CD8 + T cell (I). (J at K) Mga phenotype ng naive, central memory (Tcm), effector (Teff) at effector memory (Tem) batay sa ekspresyon ng CCR7 at CD45RO. Mga representatibong larawan (kaliwa) at tabular data (kanan) ng mga CD4 + T cell (J) at CD8 + T cell (K) sa mga ascite at tumor. Ang mga P value ay tinutukoy ng paired t-test (*P<0.05, **P<0.01 at ***P<0.001). Ang linya ay kumakatawan sa mga magkatugmang pasyente (n = 6). FMO, fluorescence minus one; MFI, median fluorescence intensity.
Ang karagdagang pagsusuri ay nagpakita ng iba pang mahahalagang pagkakaiba sa pagitan ng mataas na nalutas na katayuan ng phenotypic ng T cell. Ang activated (Figure 1, G hanggang I) at effector memory (Figure 1, J at K) sa mga tumor ay mas madalas kaysa sa ascites (proporsyon ng CD3 + T cells). Katulad nito, ang pagsusuri sa phenotype sa pamamagitan ng pagpapahayag ng mga activation marker (CD25 at CD137) at depletion marker [programmed cell death protein 1 (PD1)] ay nagpakita na kahit na ang mga metabolic characteristic ng mga populasyon na ito ay magkakaiba (Figure S1, B hanggang E), walang makabuluhang metabolic difference ang palaging naobserbahan sa pagitan ng mga naive, effector o memory subset (Figure S1, F hanggang I). Ang mga resultang ito ay nakumpirma sa pamamagitan ng paggamit ng mga machine learning methods upang awtomatikong magtalaga ng mga cell phenotype (21), na higit pang nagpakita ng pagkakaroon ng isang malaking bilang ng mga bone marrow cells (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) sa ascites ng pasyente (Figure S2A). Sa lahat ng natukoy na uri ng selula, ang populasyon ng myeloid cell na ito ay nagpakita ng pinakamataas na glucose uptake at mitochondrial activity (Figure S2, B hanggang G). Itinatampok ng mga resultang ito ang malakas na pagkakaiba sa metabolismo sa pagitan ng maraming uri ng selula na matatagpuan sa ascites at tumor sa mga pasyenteng may HGSC.
Ang pangunahing hamon sa pag-unawa sa mga katangiang metabonomiko ng TIL ay ang pangangailangang ihiwalay ang mga sample ng T cell na may sapat na kadalisayan, kalidad, at dami mula sa mga tumor. Ipinakita ng mga kamakailang pag-aaral na ang mga pamamaraan ng pag-uuri at pagpapayaman ng bead batay sa flow cytometry ay maaaring humantong sa mga pagbabago sa mga profile ng cellular metabolite (22-24). Upang malampasan ang problemang ito, in-optimize namin ang pamamaraan ng pagpapayaman ng bead upang ihiwalay at ihiwalay ang TIL mula sa kanser sa obaryo ng tao na kinuha sa pamamagitan ng operasyon bago ang pagsusuri gamit ang LC-MS/MS (tingnan ang Mga Materyales at Paraan; Larawan 2A). Upang masuri ang pangkalahatang epekto ng protocol na ito sa mga pagbabago sa metabolite, inihambing namin ang mga profile ng metabolite ng mga T cell na na-activate ng malulusog na donor pagkatapos ng hakbang sa paghihiwalay ng bead sa itaas sa mga cell na hindi pinaghiwalay ng bead ngunit nanatili sa yelo. Natuklasan ng pagsusuring ito sa pagkontrol ng kalidad na mayroong mataas na ugnayan sa pagitan ng dalawang kondisyong ito (r = 0.77), at ang teknikal na pag-uulit ng grupo ng 86 na metabolite ay may mataas na pag-uulit (Larawan 2B). Samakatuwid, ang mga pamamaraang ito ay maaaring magsagawa ng tumpak na pagsusuri ng metabolite sa mga selulang sumasailalim sa pagpapayaman ng uri ng selula, kaya nagbibigay ng unang platapormang may mataas na resolusyon para sa pagtukoy ng mga partikular na metabolite sa HGSC, sa gayon ay nagbibigay-daan sa mga tao na magkaroon ng mas malalim na pag-unawa sa espesipisidad ng selula. Programa sa metabolismo ng sekswal.
(A) Eskematikong diagram ng pagpapayaman ng magnetic bead. Bago ang pagsusuri gamit ang LC-MS/MS, ang mga selula ay sasailalim sa tatlong magkakasunod na round ng pagpapayaman ng magnetic bead o mananatili sa yelo. (B) Ang epekto ng uri ng pagpapayaman sa kasaganaan ng mga metabolite. Ang average ng tatlong sukat para sa bawat uri ng pagpapayaman ± SE. Ang kulay abong linya ay kumakatawan sa isang 1:1 na relasyon. Ang intra-class correlation (ICC) ng mga paulit-ulit na sukat na ipinapakita sa axis label. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Eskematikong diagram ng daloy ng trabaho ng pagsusuri ng metabolite ng pasyente. Ang mga ascite o tumor ay kinokolekta mula sa mga pasyente at cryopreserved. Ang isang maliit na bahagi ng bawat sample ay sinuri sa pamamagitan ng flow cytometry, habang ang natitirang mga sample ay sumailalim sa tatlong round ng pagpapayaman para sa mga selulang CD4+, CD8+ at CD45-. Ang mga fraction ng selulang ito ay sinuri gamit ang LC-MS/MS. (D) Heat map ng standardized metabolite abundance. Ang dendrogram ay kumakatawan sa Ward's clustering ng mga distansyang Euclidean sa pagitan ng mga sample. (E) Pagsusuri ng pangunahing bahagi (principal component analysis o PCA) ng mapa ng metabolite ng sample, na nagpapakita ng tatlong replika ng bawat sample, ang mga sample mula sa iisang pasyente ay pinagdurugtong ng isang linya. (F) Ang PCA ng profile ng metabolite ng sample na nakakondisyon sa pasyente (ibig sabihin, gamit ang bahagyang kalabisan); ang uri ng sample ay limitado ng convex hull. PC1, pangunahing bahagi 1; PC2, pangunahing bahagi 2.
Susunod, ginamit namin ang pamamaraang ito ng pagpapayaman upang suriin ang 99 na metabolite sa mga fraction ng CD4+, CD8+ at CD45-cell sa mga pangunahing ascite at tumor ng anim na pasyente ng HGSC (Larawan 2C, Larawan S3A at Talahanayan S3 at S4). Ang populasyon na pinag-aaralan ay bumubuo ng 2% hanggang 70% ng orihinal na malaking sample ng mga buhay na selula, at ang proporsyon ng mga selula ay lubhang nag-iiba sa pagitan ng mga pasyente. Matapos paghiwalayin ang mga beads, ang pinayaman na fraction na pinag-aaralan (CD4+, CD8+ o CD45-) ay bumubuo ng higit sa 85% ng lahat ng buhay na selula sa sample sa karaniwan. Ang pamamaraang ito ng pagpapayaman ay nagbibigay-daan sa amin na suriin ang mga populasyon ng selula mula sa metabolismo ng tisyu ng tumor ng tao, na imposibleng gawin mula sa malalaking sample. Gamit ang protocol na ito, natukoy namin na ang l-kynurenine at adenosine, ang dalawang mahusay na nailalarawan na immunosuppressive metabolite na ito ay mataas sa mga tumor T cell o mga tumor cell (Larawan S3, B at C). Samakatuwid, ipinapakita ng mga resultang ito ang katapatan at kakayahan ng aming teknolohiya sa paghihiwalay ng selula at mass spectrometry na makahanap ng mga biologically important metabolite sa mga tisyu ng pasyente.
Ipinakita rin ng aming pagsusuri ang isang malakas na metabolic separation ng mga uri ng cell sa loob at sa pagitan ng mga pasyente (Figure 2D at Figure S4A). Sa partikular, kumpara sa ibang mga pasyente, ang pasyente 70 ay nagpakita ng iba't ibang metabolic characteristics (Figure 2E at Figure S4B), na nagpapahiwatig na maaaring mayroong malaking metabolic heterogeneity sa pagitan ng mga pasyente. Mahalagang tandaan na kumpara sa ibang mga pasyente (1.2 hanggang 2 litro; Table S1), ang kabuuang dami ng ascites na nakolekta sa pasyente 70 (80 ml) ay mas maliit. Ang kontrol ng inter-patient heterogeneity sa panahon ng principal component analysis (halimbawa, gamit ang partial redundancy analysis) ay nagpapakita ng mga pare-parehong pagbabago sa pagitan ng mga uri ng cell, at ang mga uri ng cell at/o microenvironment ay malinaw na pinagsama-sama ayon sa metabolite profile (Figure 2F). Ang pagsusuri ng mga single metabolite ay nagbigay-diin sa mga epektong ito at nagpakita ng mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng mga uri ng cell at microenvironment. Mahalagang tandaan na ang pinakamatinding pagkakaiba na naobserbahan ay ang MNA, na karaniwang pinayaman sa mga CD45- cell at sa mga CD4+ at CD8+ cell na pumapasok sa tumor (Figure 3A). Para sa mga CD4+ cells, ang epektong ito ay pinakahalata, at ang MNA sa mga CD8+ cells ay tila malakas ding naaapektuhan ng kapaligiran. Gayunpaman, hindi ito mahalaga, dahil tatlo lamang sa anim na pasyente ang maaaring masuri para sa mga marka ng tumor CD8+. Bukod sa MNA, sa iba't ibang uri ng mga cells sa ascites at tumors, ang iba pang mga metabolite na hindi gaanong nailalarawan sa TIL ay magkakaiba rin ang yaman (Mga Larawan S3 at S4). Samakatuwid, ang mga datos na ito ay nagpapakita ng isang promising set ng mga immunomodulatory metabolite para sa karagdagang pananaliksik.
(A) Normalisadong nilalaman ng MNA sa mga selulang CD4+, CD8+ at CD45- mula sa ascites at tumor. Ipinapakita ng box plot ang median (line), interquartile range (frame hinge) at data range, hanggang 1.5 beses ang interquartile range (frame whisker). Gaya ng inilarawan sa Patient Materials and Methods, gamitin ang limma value ng pasyente upang matukoy ang P value (*P<0.05 at **P<0.01). (B) Schematic diagram ng metabolismo ng MNA (60). Mga Metabolite: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Mga Enzyme (berde): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE ng scRNA-seq ng ascites (kulay abo) at tumor (pula; n = 3 pasyente). (D) Ekspresyon ng NNMT sa iba't ibang populasyon ng cell na natukoy gamit ang scRNA-seq. (E) Ekspresyon ng NNMT at AOX1 sa SK-OV-3, human embryonic kidney (HEK) 293T, mga T cell at mga MNA-treated T cell. Ang nakatiklop na ekspresyon ay ipinapakita kaugnay ng SK-OV-3. Ang pattern ng ekspresyon na may SEM ay ipinapakita (n = 6 malulusog na donor). Ang mga halaga ng Ct na higit sa 35 ay itinuturing na hindi matukoy (UD). (F) Ekspresyon ng SLC22A1 at SLC22A2 sa SK-OV-3, HEK293T, mga T cell at mga T cell na ginamot gamit ang 8mM MNA. Ang nakatiklop na ekspresyon ay ipinapakita kaugnay ng SK-OV-3. Ang pattern ng ekspresyon gamit ang SEM ay ipinapakita (n = 6 na malulusog na donor). Ang mga halaga ng Ct na higit sa 35 ay itinuturing na hindi matukoy (UD). (G) Nilalaman ng Cell MNA sa mga na-activate na malulusog na donor T cell pagkatapos ng 72 oras na inkubasyon gamit ang MNA. Ang pattern ng ekspresyon gamit ang SEM ay ipinapakita (n = 4 na malulusog na donor).
Ang MNA ay nalilikha sa pamamagitan ng paglilipat ng methyl group mula sa S-adenosyl-1-methionine (SAM) patungo sa nicotinamide (NA) sa pamamagitan ng nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Figure 3B). Ang NNMT ay labis na naipapahayag sa iba't ibang uri ng kanser sa tao at nauugnay sa paglaganap, pagsalakay, at metastasis (25-27). Upang mas maunawaan ang pinagmulan ng MNA sa mga T cell sa TME, ginamit namin ang scRNA-seq upang makilala ang ekspresyon ng NNMT sa iba't ibang uri ng cell sa mga ascite at tumor ng tatlong pasyenteng may HGSC (Table S5). Ang pagsusuri sa humigit-kumulang 6,500 cell ay nagpakita na sa mga ascite at tumor environment, ang ekspresyon ng NNMT ay limitado lamang sa mga populasyon ng fibroblast at tumor cell (Figure 3, C at D). Mahalagang tandaan na walang malinaw na ekspresyon ng NNMT sa anumang populasyon na nagpapahayag ng PTPRC (CD45 +) (Figure 3D at Figure S5A), na nagpapahiwatig na ang MNA na nakita sa metabolite spectrum ay ipinakilala na sa mga T cell. Ang ekspresyon ng aldehyde oxidase 1 (AOX1) ay nagko-convert ng MNA sa 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) o 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR; Figure 3B) ay limitado rin sa populasyon ng mga fibroblast na nagpapahayag ng COL1A1 (Figure S5A), na magkakasamang nagpapahiwatig na ang mga T cell ay kulang sa kakayahan ng kumbensyonal na metabolismo ng MNA. Ang pattern ng ekspresyon ng mga gene na nauugnay sa MNA ay napatunayan gamit ang pangalawang independiyenteng hanay ng datos ng cell mula sa mga ascite mula sa mga pasyenteng may HGSC (Figure S5B; n = 6) (16). Bilang karagdagan, ang pagsusuri ng quantitative polymerase chain reaction (qPCR) ng malulusog na donor T cell na ginagamot ng MNA ay nagpakita na kumpara sa mga control SK-OV-3 ovarian tumor cells, ang NNMT o AOX1 ay halos hindi naipahayag (Figure 3E). Ang mga hindi inaasahang resultang ito ay nagpapahiwatig na ang MNA ay maaaring ilabas mula sa mga fibroblast o tumor patungo sa mga katabing T cell sa TME.
Bagama't kabilang sa mga kandidato ang pamilya ng mga organic cation transporter 1 hanggang 3 (OCT1, OCT2 at OCT3) na naka-encode ng pamilyang soluble carrier 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 at SLC22A3), ang mga potensyal na transporter ng MNA ay hindi pa rin natutukoy (28). Ang QPCR ng mRNA mula sa malulusog na donor T cell ay nagpakita ng mababang antas ng ekspresyon ng SLC22A1 ngunit hindi matukoy na antas ng SLC22A2, na nagkumpirma na ito ay naiulat na dati sa literatura (Larawan 3F) (29). Sa kabaligtaran, ang SK-OV-3 ovarian tumor cell line ay nagpahayag ng mataas na antas ng parehong transporter (Larawan 3F).
Upang masubukan ang posibilidad ng kakayahang sumipsip ng mga dayuhang MNA ang mga T cell na malulusog na donor T cell, ang malulusog na donor T cell ay kinultura sa loob ng 72 oras sa presensya ng iba't ibang konsentrasyon ng MNA. Sa kawalan ng exogenous MNA, ang nilalaman ng MNA sa selula ay hindi matukoy (Larawan 3G). Gayunpaman, ang mga na-activate na T cell na ginamitan ng exogenous MNA ay nagpakita ng pagtaas ng nilalaman ng MNA sa mga selula na nakadepende sa dosis, hanggang 6 mM MNA (Larawan 3G). Ang resultang ito ay nagpapahiwatig na sa kabila ng mababang antas ng ekspresyon ng transporter at kawalan ng pangunahing enzyme na responsable para sa intracellular MNA metabolism, maaari pa ring sumipsip ang TIL ng MNA.
Ang spectrum ng mga metabolite sa mga T cell ng mga pasyente at mga eksperimento sa pagsipsip ng MNA in vitro ay nagpapataas ng posibilidad na ang mga cancer-associated fibroblast (CAF) ay naglalabas ng MNA at ang mga tumor cell ay maaaring mag-regulate sa phenotype at function ng TIL. Upang matukoy ang epekto ng MNA sa mga T cell, ang malulusog na donor T cell ay na-activate in vitro sa presensya o kawalan ng MNA, at ang kanilang paglaganap at produksyon ng cytokine ay sinuri. Pagkatapos ng 7 araw ng pagdaragdag ng MNA sa pinakamataas na dosis, ang bilang ng pagdoble ng populasyon ay katamtamang nabawasan, habang ang vigor ay napanatili sa lahat ng dosis (Figure 4A). Bilang karagdagan, ang paggamot ng exogenous MNA ay nagresulta sa pagtaas sa proporsyon ng mga CD4 + at CD8 + T cell na nagpapahayag ng tumor necrosis factor-α (TNFα; Figure 4B). Sa kabaligtaran, ang intracellular production ng IFN-γ ay makabuluhang nabawasan sa mga CD4 + T cell, ngunit hindi sa mga CD8 + T cell, at walang makabuluhang pagbabago sa interleukin 2 (IL-2; Figure 4, C at D). Samakatuwid, ang enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ng mga supernatant mula sa mga MNA-treated T cell culture na ito ay nagpakita ng malaking pagtaas sa TNFα, pagbaba sa IFN-γ, at walang pagbabago sa IL-2 (Larawan 4, E hanggang G). Ang pagbaba ng IFN-γ ay nagpapahiwatig na ang MNA ay maaaring gumanap ng papel sa pagpigil sa anti-tumor activity ng mga T cell. Upang gayahin ang epekto ng MNA sa T cell-mediated cytotoxicity, ang mga chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) cells na nagta-target sa folate receptor α at CAR-T (GFP) na kinokontrol ng green fluorescent protein (GFP) -CAR-T) cells ay nalilikha ng malulusog na donor peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Ang mga CAR-T cell ay kinultura sa loob ng 24 na oras sa presensya ng MNA, at pagkatapos ay co-cultured sa mga human SK-OV-3 ovarian tumor cells na nagpapahayag ng folate receptor α sa isang effector to target ratio na 10:1. Ang paggamot gamit ang MNA ay nagresulta sa isang makabuluhang pagbaba sa aktibidad ng pagpatay ng mga selulang FRα-CAR-T, na katulad ng mga selulang FRα-CAR-T na ginamot gamit ang adenosine (Larawan 4H).
(A) Kabuuang bilang ng mabubuhay na selula at pagdoble ng populasyon (PD) nang direkta mula sa kultura noong ika-7 araw. Ang bar graph ay kumakatawan sa mean + SEM ng anim na malulusog na donor. Kinakatawan ang datos mula sa hindi bababa sa n = 3 independiyenteng eksperimento. (B hanggang D) Ang CD3/CD28 at IL-2 ay ginamit upang i-activate ang mga T cell sa kani-kanilang konsentrasyon ng MNA sa loob ng 7 araw. Bago ang pagsusuri, ang mga selula ay pinasigla gamit ang PMA/ionomycin na may GolgiStop sa loob ng 4 na oras. Ekspresyon ng TNFα (B) sa mga T cell. Halimbawang larawan (kaliwa) at tabular na datos (kanan) ng ekspresyon ng TNFα sa mga buhay na selula. Ekspresyon ng IFN-γ (C) at IL-2 (D) sa mga T cell. Ang ekspresyon ng mga cytokine ay sinukat sa pamamagitan ng flow cytometry. Ang bar graph ay kumakatawan sa mean (n = 6 malulusog na donor) + SEM. Gumamit ng one-way analysis of variance at repeated measures (*P<0.05 at **P<0.01) upang matukoy ang P value. Kinakatawan ang datos mula sa hindi bababa sa n = 3 independiyenteng eksperimento. (E hanggang G) Ginamit ang CD3/CD28 at IL-2 upang i-activate ang mga T cell sa kani-kanilang konsentrasyon ng MNA sa loob ng 7 araw. Ang medium ay kinolekta bago at pagkatapos ng 4 na oras ng PMA/ionomycin stimulation. Ang mga konsentrasyon ng TNFα (E), IFN-γ (F) at IL-2 (G) ay sinukat gamit ang ELISA. Ang bar graph ay kumakatawan sa mean (n = 5 malulusog na donor) + SEM. Ang P value ay tinutukoy gamit ang one-way analysis of variance at paulit-ulit na pagsukat (*P<0.05). Ang tuldok-tuldok na linya ay nagpapahiwatig ng limitasyon ng pagtuklas. (H) Cell lysis assay. Ang mga FRα-CAR-T o GFP-CAR-T cell ay inayos gamit ang adenosine (250μM) o MNA (10 mM) sa loob ng 24 na oras, o hindi ginagamot (Ctrl). Ang porsyento ng pagpatay sa mga SK-OV-3 cell ay sinukat. Ang P value ay tinukoy gamit ang Welch t test (*P<0.5 at **P<0.01).
Upang magkaroon ng mekanismong pag-unawa sa regulasyon ng ekspresyon ng TNFα na umaasa sa MNA, sinuri ang mga pagbabago sa TNFα mRNA ng mga T cell na ginagamot ng MNA (Larawan 5A). Ang malulusog na donor T cell na ginagamot ng MNA ay nagpakita ng dalawang beses na pagtaas sa mga antas ng transkripsyon ng TNFα, na nagpapahiwatig na ang MNA ay nakasalalay sa regulasyon ng transkripsyon ng TNFα. Upang siyasatin ang posibleng mekanismo ng regulasyon na ito, dalawang kilalang transcription factor na nagreregula sa TNFα, lalo na ang activated T cell nuclear factor (NFAT) at specific protein 1 (Sp1), ay sinuri bilang tugon sa pagbubuklod ng MNA sa proximal TNFα promoter (30). Ang TNFα promoter ay naglalaman ng 6 na natukoy na NFAT binding sites at 2 Sp1 binding sites, na nagsasapawan sa isang site [-55 base pairs (bp) mula sa 5'cap] (30). Ipinakita ng Chromatin immunoprecipitation (ChIP) na kapag ginagamot ng MNA, ang pagbubuklod ng Sp1 sa TNFα promoter ay tumaas nang tatlong beses. Ang pagsasama ng NFAT ay tumaas din at lumalapit sa kahalagahan (Larawan 5B). Ipinapahiwatig ng mga datos na ito na kinokontrol ng MNA ang ekspresyon ng TNFα sa pamamagitan ng transkripsyon ng Sp1, at sa mas mababang antas ang ekspresyon ng NFAT.
(A) Kung ikukumpara sa mga T cell na kinultura nang walang MNA, ang pagbabago ng ekspresyon ng TNFα sa mga T cell na ginamot gamit ang MNA. Ang pattern ng ekspresyon gamit ang SEM ay ipinapakita (n = 5 malulusog na donor). Kinakatawan ang datos mula sa hindi bababa sa n = 3 independiyenteng eksperimento. (B) Ang TNFα promoter ng mga T cell na ginamot gamit o walang 8 mM MNA pagkatapos ng NFAT at Sp1 ay pinagsama sa (Ctrl) at PMA/ionomycin stimulation sa loob ng 4 na oras. Ang Immunoglobulin G (IgG) at H3 ay ginamit bilang negatibo at positibong kontrol para sa immunoprecipitation, ayon sa pagkakabanggit. Ang quantification ng ChIP ay nagpakita na ang pagbubuklod ng Sp1 at NFAT sa TNFα promoter sa mga cell na ginamot gamit ang MNA ay tumaas nang ilang beses kumpara sa kontrol. Kinakatawan ang datos mula sa hindi bababa sa n = 3 independiyenteng eksperimento. Ang P value ay natukoy sa pamamagitan ng maraming t-test (*** P <0.01). (C) Kung ikukumpara sa mga ascite ng HGSC, ang mga T cell (hindi cytotoxic) ay nagpakita ng pagtaas ng ekspresyon ng TNF sa tumor. Ang mga kulay ay kumakatawan sa iba't ibang pasyente. Ang mga ipinakitang selula ay random na kinuhanan ng sample hanggang 300 at ini-jitter upang limitahan ang overdrawing (** Padj = 0.0076). (D) Iminumungkahing modelo ng MNA para sa kanser sa obaryo. Ang MNA ay nalilikha sa mga selula ng tumor at fibroblast sa TME at kinukuha ng mga T cell. Pinapataas ng MNA ang pagbubuklod ng Sp1 sa TNFα promoter, na humahantong sa pagtaas ng TNFα transcription at produksyon ng TNFα cytokine. Nagdudulot din ang MNA ng pagbaba sa IFN-γ. Ang pagpigil sa tungkulin ng T cell ay humahantong sa pagbawas ng kakayahang pumatay at pagbilis ng paglaki ng tumor.
Ayon sa mga ulat, ang TNFα ay may mga epektong anti-tumor at anti-tumor na umaasa sa harap at likod, ngunit mayroon itong kilalang papel sa pagtataguyod ng paglaki at metastasis ng kanser sa obaryo (31-33). Ayon sa mga ulat, ang konsentrasyon ng TNFα sa ascites at mga tisyu ng tumor sa mga pasyenteng may kanser sa obaryo ay mas mataas kaysa sa mga benign na tisyu (34-36). Sa mga tuntunin ng mekanismo, maaaring i-regulate ng TNFα ang pag-activate, paggana at paglaganap ng mga puting selula ng dugo, at baguhin ang phenotype ng mga selula ng kanser (37, 38). Kasabay ng mga natuklasang ito, ipinakita ng pagsusuri ng differential gene expression na ang TNF ay makabuluhang tumaas sa mga T cell sa mga tisyu ng tumor kumpara sa ascites (Larawan 5C). Ang pagtaas sa ekspresyon ng TNF ay makikita lamang sa mga populasyon ng T cell na may non-cytotoxic phenotype (Larawan S5A). Sa buod, sinusuportahan ng mga datos na ito ang pananaw na ang MNA ay may dalawahang immunosuppressive at tumor promoting effect sa HGSC.
Ang fluorescent labeling batay sa flow cytometry ay naging pangunahing pamamaraan para sa pag-aaral ng metabolismo ng TIL. Ipinakita ng mga pag-aaral na ito na kumpara sa peripheral blood lymphocytes o T cells mula sa mga secondary lymphoid organ, ang murine at human TIL ay may mas mataas na tendensiyang sumipsip ng glucose (4, 39) at ang unti-unting pagkawala ng mitochondrial function (19, 40). Bagama't naobserbahan namin ang mga katulad na resulta sa pag-aaral na ito, ang pangunahing pag-unlad ay ang paghahambing ng metabolismo ng mga tumor cells at TIL mula sa parehong inalis na tissue ng tumor. Kasabay ng ilan sa mga naunang ulat na ito, ang mga tumor (CD45-EpCAM +) cells mula sa ascites at tumors ay may mas mataas na glucose uptake kaysa sa mga CD8 + at CD4 + T cells, na sumusuporta na ang mataas na glucose uptake ng mga tumor cells ay maaaring ihambing sa mga T cells. Ang konsepto ng T cell competition. TME. Gayunpaman, ang mitochondrial activity ng mga tumor cells ay mas mataas kaysa sa mga CD8 + T cells, ngunit ang mitochondrial activity ay katulad ng sa mga CD4 + T cells. Pinatitibay ng mga resultang ito ang umuusbong na tema na ang oxidative metabolism ay mahalaga para sa mga tumor cells (41, 42). Iminumungkahi rin nila na ang mga CD8 + T cell ay maaaring mas madaling kapitan ng oxidative dysfunction kaysa sa mga CD4 + T cell, o na ang mga CD4 + T cell ay maaaring gumamit ng mga pinagmumulan ng carbon maliban sa glucose upang mapanatili ang aktibidad ng mitochondrial (43, 44). Dapat tandaan na wala kaming naobserbahang pagkakaiba sa glucose uptake o mitochondrial activity sa pagitan ng mga CD4 + T effector, T effector memory at T central memory cell sa ascites. Katulad nito, ang differentiation state ng mga CD8 + T cell sa mga tumor ay walang kinalaman sa mga pagbabago sa glucose uptake, na nagpapakita ng makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng mga T cell na kinultura in vitro at human TIL in vivo (22). Ang mga obserbasyong ito ay nakumpirma rin sa pamamagitan ng paggamit ng unbiased automatic cell population allocation, na lalong nagsiwalat na ang mga CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + cell na may mas mataas na glucose uptake at mitochondrial activity kaysa sa mga tumor cell ay laganap ngunit may Metabolic active cell population. Ang populasyon na ito ay maaaring kumakatawan sa putative subpopulation ng mga myeloid suppressor cell o plasmacytoid dendritic cell na natukoy sa scRNA-seq analysis. Bagama't naiulat na ang parehong ito sa mga tumor sa obaryo ng tao [45], kailangan pa rin ang mga ito. Ang karagdagang pag-aaral ay ang paglalarawan sa myeloid subpopulation na ito.
Bagama't maaaring linawin ng mga pamamaraan batay sa flow cytometry ang pangkalahatang pagkakaiba sa glucose at oxidative metabolism sa pagitan ng mga uri ng cell, ang mga tiyak na metabolite na ginawa ng glucose o iba pang pinagmumulan ng carbon para sa mitochondrial metabolism sa TME ay hindi pa natutukoy. Ang pagtatalaga ng presensya o kawalan ng mga metabolite sa isang partikular na TIL subset ay nangangailangan ng paglilinis ng populasyon ng cell mula sa tinanggal na tissue. Samakatuwid, ang aming pamamaraan ng pagpapayaman ng cell na sinamahan ng mass spectrometry ay maaaring magbigay ng mga pananaw sa mga metabolite na may iba't ibang yaman sa mga T cell at populasyon ng tumor cell sa pagtutugma ng mga sample ng pasyente. Bagama't ang pamamaraang ito ay may mga bentahe kaysa sa fluorescence-activated cell sorting, ang ilang mga library ng metabolite ay maaaring maapektuhan dahil sa likas na katatagan at/o mabilis na turnover rate (22). Gayunpaman, natukoy ng aming pamamaraan ang dalawang kinikilalang immunosuppressive metabolite, ang adenosine at kynurenine, dahil malaki ang pagkakaiba-iba ng mga ito sa pagitan ng mga uri ng sample.
Ang aming metabonomic analysis ng mga tumor at TIL subtypes ay nagbibigay ng mas maraming kaalaman sa papel ng mga metabolite sa ovarian TME. Una, gamit ang flow cytometry, natukoy namin na walang pagkakaiba sa mitochondrial activity sa pagitan ng mga tumor at CD4 + T cells. Gayunpaman, ang LC-MS/MS analysis ay nagpakita ng mga makabuluhang pagbabago sa kasaganaan ng mga metabolite sa mga populasyon na ito, na nagpapahiwatig na ang mga konklusyon tungkol sa metabolismo ng TIL at ang pangkalahatang metabolic activity nito ay nangangailangan ng maingat na interpretasyon. Pangalawa, ang MNA ang metabolite na may pinakamalaking pagkakaiba sa pagitan ng mga CD45-cells at T cells sa ascites, hindi sa mga tumor. Samakatuwid, ang compartmentalization at lokasyon ng tumor ay maaaring may iba't ibang epekto sa metabolismo ng TIL, na nagpapakita ng posibleng heterogeneity sa isang partikular na microenvironment. Pangatlo, ang ekspresyon ng MNA-producing enzyme na NNMT ay pangunahing limitado sa CAF, na mga tumor cells sa mas mababang lawak, ngunit ang mga nakikitang antas ng MNA ay naoobserbahan sa mga tumor-derived T cells. Ang overexpression ng NNMT sa ovarian CAF ay may kilalang epekto sa pagpapalaganap ng kanser, bahagyang dahil sa pagsulong ng metabolismo ng CAF, pagsalakay ng tumor at metastasis (27). Bagama't katamtaman ang pangkalahatang antas ng TIL, ang ekspresyon ng NNMT sa CAF ay malapit na nauugnay sa Cancer Genome Atlas (TCGA) mesenchymal subtype, na nauugnay sa mahinang prognosis (27, 46, 47). Panghuli, ang ekspresyon ng enzyme na AOX1 na responsable para sa pagkasira ng MNA ay limitado rin sa populasyon ng CAF, na nagpapahiwatig na ang mga T cell ay walang kakayahang i-metabolize ang MNA. Sinusuportahan ng mga resultang ito ang ideya na bagama't kailangan ng karagdagang pag-aaral upang mapatunayan ang natuklasang ito, ang mataas na antas ng MNA sa mga T cell ay maaaring magpahiwatig ng pagkakaroon ng isang immunosuppressive na CAF microenvironment.
Dahil sa mababang antas ng ekspresyon ng mga MNA transporter at sa hindi matukoy na antas ng mga pangunahing protina na kasangkot sa metabolismo ng MNA, ang presensya ng MNA sa mga T cell ay hindi inaasahan. Hindi matukoy ang NNMT o AOX1 sa pamamagitan ng scRNA-seq analysis at targeted qPCR ng dalawang independent cohort. Ipinapahiwatig ng mga resultang ito na ang MNA ay hindi na-synthesize ng mga T cell, ngunit nasisipsip mula sa nakapalibot na TME. Ipinapakita ng mga in vitro na eksperimento na ang mga T cell ay may posibilidad na mag-ipon ng exogenous MNA.
Ipinakita ng aming mga in vitro na pag-aaral na ang exogenous MNA ay nagdudulot ng ekspresyon ng TNFα sa mga T cell at nagpapahusay sa pagbubuklod ng Sp1 sa TNFα promoter. Bagama't ang TNFα ay may parehong anti-tumor at anti-tumor na mga tungkulin, sa kanser sa obaryo, ang TNFα ay maaaring magsulong ng paglaki ng kanser sa obaryo (31-33). Ang neutralisasyon ng TNFα sa ovarian tumor cell culture o ang pag-aalis ng TNFα signal sa mga modelo ng daga ay maaaring mapabuti ang produksyon ng inflammatory cytokine na pinamagitan ng TNFα at mapigilan ang paglaki ng tumor (32, 35). Samakatuwid, sa kasong ito, ang TME-derived MNA ay maaaring kumilos bilang isang pro-inflammatory metabolite sa pamamagitan ng isang mekanismo na umaasa sa TNFα sa pamamagitan ng autocrine loop, sa gayon ay nagtataguyod ng paglitaw at pagkalat ng kanser sa obaryo (31). Batay sa posibilidad na ito, ang TNFα blockade ay pinag-aaralan bilang isang potensyal na therapeutic agent para sa kanser sa obaryo (37, 48, 49). Bilang karagdagan, pinipigilan ng MNA ang cytotoxicity ng mga CAR-T cell sa mga ovarian tumor cell, na nagbibigay ng karagdagang ebidensya para sa MNA-mediated immune suppression. Sa kabuuan, ang mga resultang ito ay nagmumungkahi ng isang modelo kung saan ang mga tumor at mga selula ng CAF ay naglalabas ng MNA sa extracellular TME. Sa pamamagitan ng (i) pagpapasigla ng paglaki ng kanser sa obaryo na dulot ng TNF at (ii) pagsugpo sa aktibidad na cytotoxic ng T cell na dulot ng MNA, maaaring magkaroon ito ng dalawahang epekto ng tumor (Larawan 5D).
Bilang konklusyon, sa pamamagitan ng paglalapat ng kombinasyon ng mabilis na pagpapayaman ng selula, single-cell sequencing at metabolic profiling, isiniwalat ng pag-aaral na ito ang napakalaking pagkakaiba ng immunometabolomic sa pagitan ng mga tumor at ascites cell sa mga pasyenteng may HGSC. Ipinakita ng komprehensibong pagsusuring ito na may mga pagkakaiba sa glucose uptake at mitochondrial activity sa pagitan ng mga T cell, at kinilala ang MNA bilang isang non-cell autonomous immune regulatory metabolite. Ang mga datos na ito ay may epekto sa kung paano nakakaapekto ang TME sa metabolismo ng T cell sa mga kanser ng tao. Bagama't naiulat na ang direktang kompetisyon para sa mga sustansya sa pagitan ng mga T cell at mga cancer cell, ang mga metabolite ay maaari ring kumilos bilang mga hindi direktang regulator upang isulong ang paglala ng tumor at posibleng sugpuin ang mga endogenous immune response. Ang karagdagang paglalarawan ng functional role ng mga regulatory metabolite na ito ay maaaring magbukas ng mga alternatibong estratehiya para sa pagpapahusay ng anti-tumor immune response.
Ang mga ispesimen at klinikal na datos ng pasyente ay nakuha sa pamamagitan ng BC cancer tumor tissue repository na sertipikado ng Canadian Tissue Repository Network. Ayon sa protocol na inaprubahan ng BC Cancer Research Ethics Committee at ng University of British Columbia (H07-00463), lahat ng ispesimen at klinikal na datos ng mga pasyente ay nakakuha ng nakasulat na pahintulot o pormal na tinalikuran ang kanilang pahintulot. Ang mga sample ay nakaimbak sa sertipikadong BioBank (BRC-00290). Ang mga detalyadong katangian ng pasyente ay ipinapakita sa Mga Talahanayan S1 at S5. Para sa cryopreservation, isang scalpel ang ginagamit upang mekanikal na mabulok ang sample ng tumor ng pasyente at pagkatapos ay itulak ito sa isang 100-micron filter upang makakuha ng isang single cell suspension. Ang ascites ng pasyente ay sinentrifuga sa 1500 rpm sa loob ng 10 minuto sa 4°C upang i-pellet ang mga cell at alisin ang supernatant. Ang mga selulang nakuha mula sa tumor at ascites ay na-cryopreserve sa 50% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) at 10% dimethyl sulfoxide. Ang mga napreserbang single cell suspension na ito ay tinunaw at ginamit para sa metabolomics at metabolite determination na ilalarawan sa ibaba.
Ang kumpletong medium ay binubuo ng 0.22 μm na sinala 50:50 na sinuportahan ng RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) na sinuportahan ng 10% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) solution (Thermo Fisher Scientific) at 50 μMB-mercaptoethanol. Ang AimV (Invitrogen) ay sinuportahan ng 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) at 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Ang flow cytometer staining buffer ay binubuo ng 0.22μm na sinala phosphate buffered saline (PBS; Invitrogen) na sinuportahan ng 3% heat-inactivated AB human serum (Sigma). Ang cell enrichment buffer ay binubuo ng 0.22μm na sinalang PBS at dinagdagan ng 0.5% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich).
Sa 37°C na kumpletong medium, ang mga selula ay kinulayan ng 10 nM MT DR at 100 μM 2-NBDG sa loob ng 30 minuto. Susunod, ang mga selula ay kinulayan ng viability dye eF506 sa 4°C sa loob ng 15 minuto. Muling i-suspend ang mga selula sa FC Block (eBioscience) at Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), palabnawin sa flow cytometer staining buffer (ayon sa mga tagubilin ng tagagawa), at i-incubate sa loob ng 10 minuto sa temperatura ng silid. Kulayan ang mga selula gamit ang isang set ng mga antibodies (Table S2) sa flow cytometry staining buffer sa 4°C sa loob ng 20 minuto. Muling i-suspend ang mga selula sa flow cytometry staining buffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) bago ang pagsusuri. Gamitin ang SpectroFlo at FlowJo V10 upang suriin ang datos ng bilang ng selula, at gamitin ang GraphPad Prism 8 upang likhain ang datos. Ang median fluorescence intensity (MFI) ng 2-NBDG at MT DR ay ni-log-normalize, at pagkatapos ay ginamit ang isang paired t test para sa statistical analysis upang maisaalang-alang ang mga magkatugmang pasyente. Alisin ang lahat ng populasyon na may mas mababa sa 40 kaganapan mula sa pagsusuri; maglagay ng MFI value na 1 para sa anumang negatibong value bago magsagawa ng statistical analysis at data visualization.
Upang madagdagan ang manu-manong gating strategy ng nabanggit na process panel, ginamit namin ang buong anotasyon ng shape restriction tree (FAUST) (21) upang awtomatikong magtalaga ng mga cell sa populasyon pagkatapos alisin ang mga patay na cell sa FlowJo. Manu-mano naming pinamamahalaan ang output upang pagsamahin ang mga populasyon na tila hindi naitalaga nang tama (pinagsasama ang PD1+ sa mga PD1-tumor cell) at mga napanatiling populasyon. Ang bawat sample ay naglalaman ng average na higit sa 2% na mga cell, para sa kabuuang 11 populasyon.
Ginamit ang Ficoll gradient density centrifugation upang paghiwalayin ang PBMC mula sa mga produktong naghihiwalay ng leukocyte (STEMCELL Technologies). Ang mga CD8 + T cell ay inihiwalay mula sa PBMC gamit ang CD8 MicroBeads (Miltenyi) at pinalawak sa kumpletong medium gamit ang TransAct (Miltenyi) sa loob ng 2 linggo ayon sa mga tagubilin ng tagagawa. Ang mga cell ay hinayaan na tumayo nang 5 araw sa kumpletong medium na naglalaman ng IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), at pagkatapos ay muling pinasigla gamit ang TransAct. Sa ika-7 araw, ayon sa mga tagubilin ng tagagawa, ang human CD45 MicroBeads (Miltenyi) ay ginamit upang pagyamanin ang mga cell sa tatlong magkakasunod na round. Ang mga cell ay pinaghiwalay para sa flow cytometry analysis (tulad ng inilarawan sa itaas), at isang milyong cell ang pinaghiwalay nang tatlong beses para sa LC-MS/MS analysis. Ang mga sample ay pinoproseso ng LC-MS/MS gaya ng inilarawan sa ibaba. Tinantya namin ang nawawalang halaga ng metabolite na may ion number na 1,000. Ang bawat sample ay niraranggo ayon sa kabuuang ion number (TIC), kino-convert nang logarithmically at awtomatikong niraranggo sa MetaboAnalystR bago ang pagsusuri.
Ang single cell suspension ng bawat pasyente ay tinunaw at sinala sa pamamagitan ng 40 μm filter patungo sa kumpletong medium (gaya ng inilarawan sa itaas). Ayon sa protocol ng tagagawa, tatlong magkakasunod na round ng positibong pagpili sa pamamagitan ng magnetic bead separation gamit ang MicroBeads (Miltenyi) ang ginamit upang pagyamanin ang mga sample para sa mga CD8+, CD4+ at CD45- cells (sa yelo). Sa madaling salita, ang mga cell ay muling isinasabit sa cell enrichment buffer (gaya ng inilarawan sa itaas) at binilang. Ang mga cell ay in-incubate kasama ng human CD8 beads, human CD4 beads o human CD45 beads (Miltenyi) sa 4°C sa loob ng 15 minuto, at pagkatapos ay hinugasan gamit ang cell enrichment buffer. Ang sample ay pinadaan sa LS column (Miltenyi), at ang mga positibo at negatibong fraction ay kinokolekta. Upang mabawasan ang tagal at ma-maximize ang hakbang ng cell recovery, ang CD8-fraction ay ginagamit para sa ikalawang round ng CD4+ enrichment, at ang CD4-fraction ay ginagamit para sa kasunod na CD45-enrichment. Panatilihin ang solusyon sa yelo sa buong proseso ng paghihiwalay.
Upang ihanda ang mga sample para sa pagsusuri ng metabolite, ang mga cell ay hinugasan nang isang beses gamit ang malamig na solusyon ng asin, at 1 ml ng 80% methanol ang idinagdag sa bawat sample, pagkatapos ay ini-vortex at ini-snap habang nagyelo sa liquid nitrogen. Ang mga sample ay isinailalim sa tatlong freeze-thaw cycle at sinentrifuga sa 14,000 rpm sa loob ng 15 minuto sa 4°C. Ang supernatant na naglalaman ng mga metabolite ay pinasingaw hanggang sa matuyo. Ang mga metabolite ay muling tinunaw sa 50 μl ng 0.03% formic acid, ini-vortex upang ihalo, at pagkatapos ay sinentrifuga upang alisin ang mga debris.
I-extract ang mga metabolite gaya ng inilarawan sa itaas. Ilipat ang supernatant sa isang high performance liquid chromatography bottle para sa metabolomics research. Gumamit ng random treatment protocol upang gamutin ang bawat sample gamit ang parehong bilang ng mga cell upang maiwasan ang mga batch effects. Nagsagawa kami ng qualitative assessment ng mga global metabolite na naunang inilathala sa AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Ang chromatographic analysis at peak area integration ay isinagawa gamit ang MultiQuant version 2.1 software (Applied Biosystems SCIEX).
Isang ion count na 1000 ang ginamit upang tantyahin ang nawawalang halaga ng metabolite, at ang TIC ng bawat sample ay ginamit upang kalkulahin ang normalized peak area ng bawat natukoy na metabolite upang itama ang mga pagbabagong dulot ng instrumental analysis mula sa pagproseso ng sample. Matapos ma-normalize ang TIC, ang MetaboAnalystR(51) (default parameter) ay ginagamit para sa logarithmic conversion at automatic norm line scaling. Ginamit namin ang PCA na may vegan R package upang magsagawa ng exploratory analysis ng mga pagkakaiba ng metabolome sa pagitan ng mga uri ng sample, at ginamit ang partial redundancy analysis upang suriin ang mga pasyente. Gamitin ang Ward method upang bumuo ng heat map dendrogram upang i-cluster ang Euclidean distance sa pagitan ng mga sample. Ginamit namin ang limma (52) sa standardized metabolite abundance upang matukoy ang mga differentially abundant metabolites sa buong uri ng cell at microenvironment. Upang gawing simple ang paliwanag, ginagamit namin ang group mean parameter upang tukuyin ang modelo, at isinasaalang-alang ang mga uri ng cell sa microenvironment bilang bawat grupo (n = 6 na grupo); para sa significance test, nagsagawa kami ng tatlong paulit-ulit na pagsukat para sa bawat metabolite. Upang maiwasan ang maling replikasyon, isinama ang pasyente bilang isang balakid sa disenyo ng limma. Upang masuri ang mga pagkakaiba sa mga metabolite sa pagitan ng iba't ibang pasyente, inayos namin ang limma model kasama ang mga pasyente sa isang nakapirming paraan. Iniulat namin ang kahalagahan ng paunang tinukoy na contrast sa pagitan ng uri ng cell at ng microenvironment ng Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg correction).
Pagkatapos ng pagpapayaman ng vigor gamit ang Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viability), isinagawa ang single-cell transcriptome sequencing sa kabuuang live frozen ascites at tumor samples gamit ang 10x 5′gene expression protocol. Limang kaso na may magkatugmang tumor at ascites ang sinuri, bagama't ang mababang viability mula sa isang tumor sample ay pumigil sa pagsasama nito. Upang makamit ang maraming seleksyon ng mga pasyente, pinagsama namin ang mga sample ng bawat pasyente sa mga lane ng 10x chromium controller, at sinuri nang hiwalay ang mga ascites at tumor sites. Pagkatapos ng sequencing [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; isang average na 73,488 at 41,378 na pagbasa bawat cell para sa tumor at ascites ayon sa pagkakabanggit]], ginamit namin ang CellSNP at Vireo (53) (batay sa CellSNP bilang Ang karaniwang human SNP (VCF) na ibinigay ng GRCh38 ay binibigyan ng pagkakakilanlan ng donor. Ginagamit namin ang SNPRelate upang mahinuha ang pinakamalapit na pagkakakilanlan (IBS) ng katayuan ng genotype (IBS) ng pasyente, hindi kasama ang mga hindi nakatalagang selula at mga selulang kinilala bilang mga duplex at pagtutugma ng mga donor sa pagitan ng mga ascite at mga sample ng tumor (54). Batay sa gawaing ito, pinanatili namin ang tatlong kaso na may masaganang representasyon ng selula sa tumor at ascites para sa downstream analysis. Matapos magsagawa ng mass filtration step sa scater (55) at scran (56) BioConductor packaging, nagbunga ito ng 6975 na selula (2792 at 4183 na selula mula sa tumor at ascites, ayon sa pagkakabanggit) para sa pagsusuri. Ginagamit namin ang Louvain clustering ng igraph (57) ng shared nearest neighbor network (SNN) batay sa distansya ng Jaccard sa mga selula ng cluster sa pamamagitan ng expression. Manu-manong nilagyan ng anotasyon ang mga kumpol ayon sa mga posibleng uri ng selula batay sa ekspresyon ng gene ng marker at isinalarawan gamit ang t-SNE. Ang mga cytotoxic T cell ay binibigyang kahulugan ng ekspresyon ng CD8A at GZMA, hindi kasama ang mga subcluster na may mababang ekspresyon ng ribosomal protein. Na-access namin ang nailathalang datos nina Izar et al. (16), kabilang ang kanilang t-SNE embedding, na kayang kontrolin ang overlap ng ekspresyon sa pagitan ng mga marker ng immune cell at ekspresyon ng NNMT.
Ang mga PBMC ay pinaghiwalay mula sa mga produktong naghihiwalay ng leukocyte (STEMCELL Technologies) sa pamamagitan ng Ficoll gradient density centrifugation. Ang mga CD3 + cell ay inihiwalay mula sa PBMC gamit ang mga CD3 beads (Miltenyi). Sa presensya o kawalan ng MNA, ang mga CD3+ cell ay na-activate gamit ang plate-bound CD3 (5μg/ml), soluble CD28 (3μg/ml) at IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Sa huling araw ng paglawak, ang viability (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) at proliferation (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ay sinuri sa pamamagitan ng flow cytometry. Suriin ang tungkulin ng effector sa pamamagitan ng pagpapasigla sa mga selula gamit ang PMA (20 ng/ml) at ionomycin (1μg/ml) gamit ang GolgiStop sa loob ng 4 na oras, at i-monitor ang CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) at TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Pasiglahin ang mga selula ng qPCR at ChIP gamit ang PMA (20 ng/ml) at ionomycin (1μg/ml) sa loob ng 4 na oras. Ang supernatant ng ELISA ay kinolekta bago at pagkatapos ng pagpapasigla gamit ang PMA (20 ng/ml) at ionomycin (1 μg/ml) sa loob ng 4 na oras.
Sundin ang protocol ng tagagawa upang ihiwalay ang RNA gamit ang RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Gamitin ang QIAshredder (QIAGEN) upang i-homogenize ang sample. Gumamit ng high-capacity RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) upang i-synthesize ang complementary DNA (cDNA). Gamitin ang TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) upang masukat ang gene expression (ayon sa protocol ng tagagawa) gamit ang mga sumusunod na probe: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] at Hs01010726_m1 (SLC22A2). Ang mga sample ay pinatakbo gamit ang StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) sa MicroAmp fast optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems) na may MicroAmp optical film. Anumang Ct value na lumampas sa 35 ay itinuturing na lampas sa detection threshold at minarkahan bilang hindi na matutukoy.
Isagawa ang ChIP gaya ng naunang inilarawan (58). Sa madaling salita, ang mga selula ay ginamot gamit ang formaldehyde (pinal na konsentrasyon na 1.42%) at in-incubate sa temperatura ng silid sa loob ng 10 minuto. Gumamit ng supplemented swelling buffer (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl at 0.1% NP-40) sa yelo sa loob ng 10 minuto, pagkatapos ay muling i-suspend sa immunoprecipitation buffer gaya ng inilarawan (58). Ang sample ay pagkatapos ay sonicated gamit ang mga sumusunod na cycle: 10 cycle (20 1-segundong pulses) at isang static na oras na 40 segundo. I-incubate ang ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) at SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) antibodies kasama ang sample sa 4°CC shake magdamag. I-incubate ang protein A beads (Thermo Fisher Scientific) gamit ang sample sa 4°C na may banayad na pag-alog sa loob ng 1 oras, pagkatapos ay gamitin ang chelex beads (Bio-Rad) upang pagyamanin ang DNA, at gamitin ang proteinase K (Thermo Fisher) para sa pagtunaw ng protina. Ang TNFα promoter ay na-detect sa pamamagitan ng PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; sa kabaligtaran, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp na produkto). Ang mga imahe ay ginawa ng Image Lab (Bio-Rad) at kinalkula gamit ang ImageJ software.
Ang supernatant ng cell culture ay kinolekta gaya ng inilarawan sa itaas. Ang pagtukoy ay isinagawa ayon sa mga pamamaraan ng tagagawa tulad ng human TNFα ELISA kit (Invitrogen), human IL-2 ELISA kit (Invitrogen) at human IFN-γ ELISA kit (Abcam). Ayon sa protocol ng tagagawa, ang supernatant ay diluted 1:100 upang matukoy ang TNFα at IL-2, at 1:3 upang matukoy ang IFN-γ. Gamitin ang EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) upang sukatin ang absorbance sa 450 nm.
Ang mga PBMC ay pinaghiwalay mula sa mga produktong naghihiwalay ng leukocyte (STEMCELL Technologies) sa pamamagitan ng Ficoll gradient density centrifugation. Ang mga CD3 + cell ay inihiwalay mula sa PBMC gamit ang mga CD3 beads (Miltenyi). Sa presensya o kawalan ng MNA, ang mga CD3+ cell ay in-activate gamit ang plate-bound CD3 (5μg/ml), soluble CD28 (3μg/ml) at IL-2 (300 U/ml; Proleukin) sa loob ng 3 araw. Pagkatapos ng 3 araw, ang mga cell ay kinolekta at hinugasan gamit ang 0.9% saline, at ang pellet ay snap frozen. Ang bilang ng cell ay isinagawa sa pamamagitan ng flow cytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) gamit ang 123count eBeads.
I-extract ang mga metabolite gaya ng inilarawan sa itaas. Ang pinatuyong extract ay muling binuo sa konsentrasyon na 4000 cell equivalents/μl. Suriin ang sample sa pamamagitan ng reversed-phase chromatography (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) at CORTECS T3 column (2.1×150 mm, particle size 1.6-μm, pore size 120-Å; #186008500, Waters). Polar mass spectrometer (6470, Agilent), kung saan ang electrospray ionization ay gumagana sa positive mode. Ang mobile phase A ay 0.1% formic acid (sa H2O), ang mobile phase B ay 90% acetonitrile, 0.1% formic acid. Ang LC gradient ay 0 hanggang 2 minuto para sa 100% A, 2 hanggang 7.1 minuto para sa 99% B, at 7.1 hanggang 8 minuto para sa 99% B. Pagkatapos ay muling i-equilibrate ang column sa mobile phase A sa flow rate na 0.6 ml/min sa loob ng 3 minuto. . Ang flow rate ay 0.4ml/min, at ang column chamber ay pinainit sa 50°C. Gamitin ang pure chemical standard ng MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) upang maitatag ang retention time (RT) at transformation (RT = 0.882 minuto, transformation 1 = 137→94.1, transformation 2 = 137→92, Conversion 3 = 137→78). Kapag ang lahat ng tatlong transition ay naganap sa tamang retention time, ang transition 1 ay ginagamit para sa quantification upang matiyak ang specificity. Ang standard curve ng MNA (Toronto Research Chemical Company) ay nabuo sa pamamagitan ng anim na serial dilutions ng stock solution (1 mg/ml) upang makakuha ng mga standard na 0.1, 1.0, 10 at 100 ng/ml at 1.0 at 10μg/ml ayon sa pagkakabanggit na likido. Ang detection limit ay 1 ng/ml, at ang linear response ay nasa pagitan ng 10 ng/ml at 10μg/ml. Ang bawat iniksyon ng dalawang microliters ng sample at standard ay ginagamit para sa LC/MS analysis, at isang mixed quality control sample ang isinasagawa tuwing walong iniksyon upang matiyak ang katatagan ng analysis platform. Ang mga MNA responses ng lahat ng MNA-treated cell samples ay nasa loob ng linear range ng assay. Ang data analysis ay ginawa gamit ang MassHunter quantitative analysis software (v9.0, Agilent).
Ang ikalawang henerasyon ng αFR-CAR construct ay kinuha mula kay Song et al. (59). Sa madaling salita, ang construct ay naglalaman ng mga sumusunod na nilalaman: CD8a leader sequence, human αFR-specific single-chain variable fragment, CD8a hinge at transmembrane region, CD27 intracellular domain at CD3z intracellular domain. Ang kumpletong CAR sequence ay na-synthesize ng GenScript, at pagkatapos ay na-clone sa ikalawang henerasyon ng lentiviral expression vector sa itaas ng GFP expression cassette na ginamit upang suriin ang transduction efficiency.
Ang Lentivirus ay nalilikha sa pamamagitan ng transfection ng mga HEK293T cells [American Type Culture Collection (ATCC); pinalaki sa Dulbecco's modified Eagle medium na naglalaman ng 10% fetal bovine serum (FBS) at 1% PenStrep, at ginamit ang CAR-GFP vector at ang packaging plasmids (psPAX2 at pMD2.G, Addgene) ay gumagamit ng lipofection amine (Sigma-Aldrich). Ang supernatant na naglalaman ng virus ay kinolekta 48 at 72 oras pagkatapos ng transfection, sinala, at kinonsentra sa pamamagitan ng ultracentrifugation. Itabi ang concentrated viral supernatant sa -80°C hanggang sa transduction.
Ang mga PBMC ay pinaghihiwalay mula sa malulusog na donor leukocyte separation products (STEMCELL Technologies) sa pamamagitan ng Ficoll gradient density centrifugation. Gumamit ng positive selection CD8 microbeads (Miltenyi) upang ihiwalay ang mga CD8+ cell mula sa PBMC. Pasiglahin ang mga T cell gamit ang TransAct (Miltenyi) at sa TexMACS medium [Miltenyi; dinagdagan ng 3% heat-inactivated human serum, 1% PenStrep at IL-2 (300 U/ml)]. Dalawampu't apat na oras pagkatapos ng stimulation, ang mga T cell ay na-transduce gamit ang lentivirus (10 μl concentrated virus supernatant bawat 106 na cell). 1 hanggang 3 araw pagkatapos ng transduction sa Cytek Aurora (sa FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), suriin ang ekspresyon ng GFP ng mga cell upang maipakita ang transduction efficiency na hindi bababa sa 30%.
Ang mga CAR-T cell ay kinultura sa loob ng 24 na oras sa Immunocult (STEMCELL Technologies; sinuportahan ng 1% PenStrep) sa ilalim ng mga sumusunod na kondisyon: hindi ginamot, ginamot gamit ang 250 μM adenosine o 10 mM MNA. Pagkatapos ng pretreatment, ang mga CAR-T cell ay hinugasan gamit ang PBS at pinagsama sa 20,000 SK-OV-3 cells [ATCC; sa McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) na sinuportahan ng 10% FBS at 1% PenStrep sa 10: Ang effector to target ratio na 1 ay pinalakas nang triplicate sa sinuportahan na Immunocult medium. Ang mga SK-OV-3 cells at SK-OV-3 cells na sinipsip gamit ang digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) ay ginamit bilang negatibo at positibong kontrol, ayon sa pagkakabanggit. Pagkatapos ng 24 na oras ng co-cultivation, kinolekta ang supernatant at ang lactate dehydrogenase (LDH) ay sinukat ayon sa mga tagubilin ng gumawa (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Ang LDH supernatant ay diluted 1:50 sa LDH buffer. Ang porsyento ng pagpatay ay sinukat gamit ang sumusunod na pormula: porsyento ng pagpatay = porsyento ng pagwawasto / maximum killing rate x 100%, kung saan ang porsyento ng pagwawasto = co-culture-T cells lamang, at maximum killing rate = positive control-negative control.
Gaya ng inilarawan sa teksto o mga materyales at pamamaraan, gamitin ang GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0 para sa pagsusuring istatistika. Kung maraming sample ang kinolekta mula sa iisang pasyente (tulad ng ascites at tumor), gumagamit kami ng paired t test o isinasama ang pasyente bilang isang random effect sa isang linear o generalized model kung naaangkop. Para sa pagsusuring metabolomics, ang importance test ay isinasagawa nang tatlong beses.
Para sa mga karagdagang materyales para sa artikulong ito, pakitingnan ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ito ay isang artikulong maaaring gamitin sa bukas na pag-access na ipinamamahagi sa ilalim ng mga tuntunin ng Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, na nagpapahintulot sa paggamit, pamamahagi, at pagpaparami sa anumang midyum, hangga't ang pangwakas na paggamit ay hindi para sa komersyal na pakinabang at ang premise ay tama ang orihinal na akda. Sanggunian.
Paalala: Hinihiling lang namin sa iyo na ibigay ang iyong email address upang malaman ng taong irerekomenda mo sa pahina na gusto mong makita nila ang email at hindi ito spam. Hindi kami kukuha ng anumang email address.
Ang tanong na ito ay ginagamit upang subukan kung ikaw ay isang bisita at maiwasan ang awtomatikong pagpapadala ng spam.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi Jones), De Bellardini (GBerardi Jones) Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Ang MNA ay nakakatulong sa pagsugpo sa immune system ng mga T cell at kumakatawan sa isang potensyal na target na immunotherapy para sa paggamot ng kanser sa tao.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (GBerardi Jones), De Bellardini (GBerardi Jones) Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Ang MNA ay nakakatulong sa pagsugpo sa immune system ng mga T cell at kumakatawan sa isang potensyal na target na immunotherapy para sa paggamot ng kanser sa tao.
©2021 American Association for the Advancement of Science. lahat ng karapatan ay nakalaan. Ang AAAS ay partner ng HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef at COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.