Ang propionic acid (PPA), isang antifungal agent at karaniwang dietary additive, ay naipakita na nagdudulot ng abnormal na neurodevelopment sa mga daga na may kasamang gastrointestinal dysfunction, na maaaring sanhi ng gut dysbiosis. May iminungkahing ugnayan sa pagitan ng dietary PPA exposure at gut microbiota dysbiosis, ngunit hindi pa direktang sinisiyasat. Dito, sinisiyasat namin ang mga pagbabagong nauugnay sa PPA sa komposisyon ng gut microbiota na maaaring humantong sa dysbiosis. Ang mga gut microbiome ng mga daga na pinakain ng hindi ginagamot na diyeta (n=9) at isang PPA-enriched diet (n=13) ay sinundan gamit ang long-range metagenomic sequencing upang masuri ang mga pagkakaiba sa microbial composition at bacterial metabolic pathways. Ang dietary PPA ay nauugnay sa pagtaas ng kasaganaan ng mga makabuluhang taxa, kabilang ang ilang Bacteroides, Prevotella, at Ruminococcus species, na ang mga miyembro ay dating nasangkot sa produksyon ng PPA. Ang mga microbiome ng mga daga na nalantad sa PPA ay mayroon ding mas maraming pathway na nauugnay sa lipid metabolism at steroid hormone biosynthesis. Ipinapahiwatig ng aming mga resulta na maaaring baguhin ng PPA ang gut microbiota at ang mga kaugnay na metabolic pathway nito. Itinatampok ng mga naobserbahang pagbabagong ito na ang mga preservative na inuri bilang ligtas kainin ay maaaring makaimpluwensya sa komposisyon ng gut microbiota at, kaugnay nito, sa kalusugan ng tao. Sa mga ito, ang P, G o S ay pinipili depende sa antas ng klasipikasyon na sinusuri. Upang mabawasan ang epekto ng mga maling positibong klasipikasyon, isang minimum na relative abundance threshold na 1e-4 (1/10,000 reads) ang ginamit. Bago ang statistical analysis, ang mga relative abundance na iniulat ni Bracken (fraction_total_reads) ay binago gamit ang centered log-ratio (CLR) transformation (Aitchison, 1982). Ang CLR method ay pinili para sa data transformation dahil ito ay scale-invariant at sapat para sa mga non-sparse datasets (Gloor et al., 2017). Ang CLR transformation ay gumagamit ng natural logarithm. Ang count data na iniulat ni Bracken ay na-normalize gamit ang relative log expression (RLE) (Anders at Huber, 2010). Ang mga figure ay nabuo gamit ang kombinasyon ng matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 at sequential logarithms (Gloor et al., 2017). 0.12.2 at mga instantanotasyon v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Ang ratio ng Bacillus/Bacteroidetes ay kinalkula para sa bawat sample gamit ang normalized bacterial counts. Ang mga halagang iniulat sa mga talahanayan ay nira-round off sa 4 na decimal place. Ang Simpson diversity index ay kinalkula gamit ang alpha_diversity.py script na ibinigay sa KrakenTools v. 1.2 package (Lu et al., 2022). Ang ulat ni Bracken ay ibinigay sa script at ang Simpson index na "Si" ay ibinigay para sa parameter na -an. Ang mga makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan ay tinukoy bilang mean CLR differences ≥ 1 o ≤ -1. Ang mean CLR difference na ±1 ay nagpapahiwatig ng 2.7-fold na pagtaas sa kasaganaan ng isang uri ng sample. Ang tanda (+/-) ay nagpapahiwatig kung ang taxon ay mas sagana sa PPA sample at sa control sample, ayon sa pagkakabanggit. Ang kahalagahan ay natukoy gamit ang Mann-Whitney U test (Virtanen et al., 2020). Ginamit ang Statsmodels v. 0.14 (Benjamini at Hochberg, 1995; Seabold at Perktold, 2010), at ang pamamaraang Benjamini-Hochberg ay inilapat upang itama ang maraming pagsubok. Isang naayos na p-value na ≤ 0.05 ang ginamit bilang threshold para sa pagtukoy ng kahalagahang pang-istatistika.
Ang microbiome ng tao ay madalas na tinutukoy bilang "ang huling organo ng katawan" at gumaganap ng isang mahalagang papel sa kalusugan ng tao (Baquero at Nombela, 2012). Sa partikular, ang gut microbiome ay kinikilala dahil sa impluwensya at papel nito sa buong sistema sa maraming mahahalagang tungkulin. Ang mga commensal bacteria ay sagana sa bituka, sumasakop sa maraming ecological niches, gumagamit ng mga sustansya, at nakikipagkumpitensya sa mga potensyal na pathogen (Jandhyala et al., 2015). Ang magkakaibang bacterial component ng gut microbiota ay may kakayahang gumawa ng mga mahahalagang sustansya tulad ng mga bitamina at nagtataguyod ng panunaw (Rowland et al., 2018). Ang mga bacterial metabolite ay naipakita rin na nakakaimpluwensya sa pag-unlad ng tissue at nagpapahusay sa metabolic at immune pathways (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Ang komposisyon ng human gut microbiome ay lubhang magkakaiba at nakadepende sa genetic at environmental factors tulad ng diyeta, kasarian, mga gamot, at katayuan sa kalusugan (Kumbhare et al., 2019).
Ang diyeta ng ina ay isang kritikal na bahagi ng pag-unlad ng sanggol at bagong silang at isang maaaring pinagmumulan ng mga compound na maaaring makaimpluwensya sa pag-unlad (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Isa sa mga compound na interesante ay ang propionic acid (PPA), isang short-chain fatty acid by-product na nakuha mula sa bacterial fermentation at isang food additive (den Besten et al., 2013). Ang PPA ay may mga antibacterial at antifungal na katangian at samakatuwid ay ginagamit bilang isang food preservative at sa mga industriyal na aplikasyon upang mapigilan ang paglaki ng amag at bacteria (Wemmenhove et al., 2016). Ang PPA ay may iba't ibang epekto sa iba't ibang tisyu. Sa atay, ang PPA ay may mga anti-inflammatory effect sa pamamagitan ng pag-apekto sa cytokine expression sa macrophages (Kawasoe et al., 2022). Ang regulatory effect na ito ay naobserbahan din sa iba pang mga immune cell, na humahantong sa downregulation ng pamamaga (Haase et al., 2021). Gayunpaman, ang kabaligtaran na epekto ay naobserbahan sa utak. Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang pagkakalantad sa PPA ay nagdudulot ng pag-uugaling parang autism sa mga daga (El-Ansary et al., 2012). Ipinakita ng ibang mga pag-aaral na ang PPA ay maaaring magdulot ng gliosis at mag-activate ng mga pro-inflammatory pathway sa utak (Abdelli et al., 2019). Dahil ang PPA ay isang mahinang asido, maaari itong kumalat sa pamamagitan ng intestinal epithelium papunta sa daluyan ng dugo at sa gayon ay tumawid sa mga restrictive barrier kabilang ang blood-brain barrier pati na rin ang inunan (Stinson et al., 2019), na nagbibigay-diin sa kahalagahan ng PPA bilang isang regulatory metabolite na ginawa ng bacteria. Bagama't ang potensyal na papel ng PPA bilang isang risk factor para sa autism ay kasalukuyang iniimbestigahan, ang mga epekto nito sa mga indibidwal na may autism ay maaaring lumampas pa sa pag-induce ng neural differentiation.
Ang mga sintomas ng gastrointestinal tulad ng pagtatae at paninigas ng dumi ay karaniwan sa mga pasyenteng may mga neurodevelopmental disorder (Cao et al., 2021). Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang microbiome ng mga pasyenteng may autism spectrum disorders (ASD) ay naiiba sa mga malulusog na indibidwal, na nagmumungkahi ng pagkakaroon ng gut microbiota dysbiosis (Finegold et al., 2010). Katulad nito, ang mga katangian ng microbiome ng mga pasyenteng may mga inflammatory bowel disease, labis na katabaan, Alzheimer's disease, atbp. ay naiiba rin sa mga malulusog na indibidwal (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Gayunpaman, hanggang sa kasalukuyan, walang naitatatag na sanhing ugnayan sa pagitan ng gut microbiome at mga sakit o sintomas sa neurological (Yap et al., 2021), bagama't maraming uri ng bacteria ang pinaniniwalaang may papel sa ilan sa mga estado ng sakit na ito. Halimbawa, ang Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio at iba pang genera ay mas sagana sa microbiota ng mga pasyenteng may autism (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Kapansin-pansin, ang mga miyembrong species ng ilan sa mga generang ito ay kilalang nagtataglay ng mga gene na nauugnay sa produksyon ng PPA (Reichardt et al., 2014; Yun at Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur at Dürre, 2023). Dahil sa mga antimicrobial na katangian ng PPA, ang pagpapataas ng kasaganaan nito ay maaaring maging kapaki-pakinabang para sa paglaki ng mga bacteria na gumagawa ng PPA (Jacobson et al., 2018). Kaya, ang isang kapaligirang mayaman sa PFA ay maaaring humantong sa mga pagbabago sa gut microbiota, kabilang ang mga gastrointestinal pathogen, na maaaring mga potensyal na salik na humahantong sa mga sintomas ng gastrointestinal.
Isang pangunahing tanong sa pananaliksik sa microbiome ay kung ang mga pagkakaiba sa komposisyon ng microbial ay isang sanhi o sintomas ng mga pinagbabatayang sakit. Ang unang hakbang tungo sa paglilinaw ng masalimuot na ugnayan sa pagitan ng diyeta, gut microbiome, at mga sakit sa neurological ay ang pagtatasa ng mga epekto ng diyeta sa komposisyon ng microbial. Para dito, gumamit kami ng mahabang-nabasang metagenomic sequencing upang ihambing ang mga gut microbiome ng mga supling ng mga daga na pinakain ng diyeta na mayaman sa PPA o kulang sa PPA. Ang mga supling ay pinakain ng parehong diyeta gaya ng kanilang mga ina. Nagpalagay kami na ang isang diyeta na mayaman sa PPA ay magreresulta sa mga pagbabago sa komposisyon ng microbial sa bituka at mga functional pathway ng microbial, lalo na ang mga nauugnay sa metabolismo ng PPA at/o produksyon ng PPA.
Gumamit ang pag-aaral na ito ng mga transgenic na daga na FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) na labis na nagpapahayag ng berdeng fluorescent protein (GFP) sa ilalim ng kontrol ng glia-specific GFAP promoter kasunod ng mga alituntunin ng University of Central Florida Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) (Animal Use Permit Number: PROTO202000002). Pagkatapos mawalay sa suso, ang mga daga ay isa-isang inilagay sa mga kulungan na may 1-5 daga ng bawat kasarian bawat kulungan. Ang mga daga ay pinakain nang ad libitum ng alinman sa isang purified control diet (modified open-label standard diet, 16 kcal% fat) o isang sodium propionate-supplemented diet (modified open-label standard diet, 16 kcal% fat, na naglalaman ng 5,000 ppm sodium propionate). Ang dami ng sodium propionate na ginamit ay katumbas ng 5,000 mg PFA/kg kabuuang timbang ng pagkain. Ito ang pinakamataas na konsentrasyon ng PPA na inaprubahan para gamitin bilang isang food preservative. Upang maghanda para sa pag-aaral na ito, ang mga magulang na daga ay pinakain sa parehong diyeta sa loob ng 4 na linggo bago ang pag-aasawa at ipinagpatuloy sa buong pagbubuntis ng ina. Ang mga supling na daga [22 daga, 9 na kontrol (6 na lalaki, 3 babae) at 13 PPA (4 na lalaki, 9 na babae)] ay inalis sa suso at pagkatapos ay ipinagpatuloy sa parehong diyeta tulad ng mga ina sa loob ng 5 buwan. Ang mga supling na daga ay isinakripisyo sa edad na 5 buwan at ang kanilang mga dumi sa bituka ay kinolekta at unang iniimbak sa 1.5 ml na mga microcentrifuge tube sa -20°C at pagkatapos ay inilipat sa isang -80°C na freezer hanggang sa maubos ang host DNA at makuha ang mga microbial nucleic acid.
Ang Host DNA ay tinanggal ayon sa isang binagong protocol (Charalampous et al., 2019). Sa madaling salita, ang mga nilalaman ng dumi ay inilipat sa 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) at itinago nang naka-freeze. Iproseso ang maximum na 1-2 fecal pellets bawat extraction. Ang mga nilalaman ng dumi ay mekanikal na hinalo gamit ang isang plastik na halo sa loob ng tubo upang bumuo ng slurry. I-centrifuge ang mga sample sa 10,000 RCF sa loob ng 5 minuto o hanggang sa ma-pellet ang mga sample, pagkatapos ay sipsipin ang supernatant at muling i-suspend ang pellet sa 250 µl 1× PBS. Magdagdag ng 250 µl 4.4% saponin solution (TCI, product number S0019) sa sample bilang detergent upang paluwagin ang mga eukaryotic cell membrane. Ang mga sample ay dahan-dahang hinalo hanggang sa lumambot at in-incubate sa temperatura ng silid sa loob ng 10 minuto. Susunod, upang sirain ang mga eukaryotic cell, 350 μl na nuclease-free na tubig ang idinagdag sa sample, in-incubate sa loob ng 30 segundo, at pagkatapos ay idinagdag ang 12 μl na 5 M NaCl. Ang mga sample ay isinailalim sa centrifuge sa 6000 RCF sa loob ng 5 minuto. Sipsipin ang supernatant at muling i-suspend ang pellet sa 100 μl 1X PBS. Upang matanggal ang host DNA, magdagdag ng 100 μl na HL-SAN buffer (12.8568 g NaCl, 4 ml na 1M MgCl2, 36 ml na nuclease-free na tubig) at 10 μl na HL-SAN enzyme (ArticZymes P/N 70910-202). Ang mga sample ay pinaghalo nang mabuti sa pamamagitan ng pipetting at in-incubate sa 37 °C sa loob ng 30 minuto sa 800 rpm sa isang Eppendorf™ ThermoMixer C. Pagkatapos ng incubation, isinailalim sa centrifuge sa 6000 RCF sa loob ng 3 minuto at hinugasan nang dalawang beses gamit ang 800 µl at 1000 µl 1X PBS. Panghuli, muling i-suspend ang pellet sa 100 µl 1X PBS.
Ang kabuuang bacterial DNA ay inihiwalay gamit ang New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Ang karaniwang pamamaraan ng pagpapatakbo na kasama ng kit ay bahagyang binago. I-incubate at panatilihin ang nuclease-free na tubig sa 60°C bago ang operasyon para sa pangwakas na elution. Magdagdag ng 10 µl Proteinase K at 3 µl RNase A sa bawat sample. Pagkatapos ay idagdag ang 100 µl Cell Lysis Buffer at haluing dahan-dahan. Ang mga sample ay ini-incubate sa isang Eppendorf™ ThermoMixer C sa 56°C at 1400 rpm nang hindi bababa sa 1 oras at hanggang 3 oras. Ang mga incubated na sample ay sinentrifuga sa 12,000 RCF sa loob ng 3 minuto at ang supernatant mula sa bawat sample ay inilipat sa isang hiwalay na 1.5 mL microcentrifuge tube na naglalaman ng 400 µL ng binding solution. Ang mga tubo ay pagkatapos ay pina-pulse vortexed sa loob ng 5-10 segundo na may 1 segundong pagitan. Ilipat ang buong likidong nilalaman ng bawat sample (humigit-kumulang 600–700 µL) sa isang filter cartridge na inilagay sa isang flow-through collection tube. Ang mga tubo ay sinentrifuga sa 1,000 RCF sa loob ng 3 minuto upang payagan ang paunang pagbubuklod ng DNA at pagkatapos ay sinentrifuga sa 12,000 RCF sa loob ng 1 minuto upang maalis ang natitirang likido. Ang sample column ay inilipat sa isang bagong collection tube at pagkatapos ay hinugasan nang dalawang beses. Para sa unang paghuhugas, magdagdag ng 500 µL ng wash buffer sa bawat tubo. Baligtarin ang tubo nang 3-5 beses at pagkatapos ay sinentrifuga sa 12,000 RCF sa loob ng 1 minuto. Itapon ang likido mula sa collection tube at ibalik ang filter cartridge sa parehong collection tube. Para sa pangalawang paghuhugas, magdagdag ng 500 µL ng wash buffer sa filter nang hindi binabaligtad. Ang mga sample ay sinentrifuga sa 12,000 RCF sa loob ng 1 minuto. Ilipat ang pansala sa isang 1.5 mL na LoBind® tube at magdagdag ng 100 µL ng pre-warmed nuclease-free na tubig. Ang mga pansala ay in-incubate sa temperatura ng silid sa loob ng 1 minuto at pagkatapos ay sinentrifuga sa 12,000 RCF sa loob ng 1 minuto. Ang na-elute na DNA ay iniimbak sa -80°C.
Ang konsentrasyon ng DNA ay tinantiya gamit ang isang Qubit™ 4.0 Fluorometer. Ang DNA ay inihanda gamit ang Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (Cat. No. Q33231) ayon sa mga tagubilin ng gumawa. Ang distribusyon ng haba ng fragment ng DNA ay sinukat gamit ang isang Aglient™ 4150 o 4200 TapeStation. Ang DNA ay inihanda gamit ang Agilent™ Genomic DNA Reagents (Cat. No. 5067-5366) at Genomic DNA ScreenTape (Cat. No. 5067-5365). Ang paghahanda ng library ay isinagawa gamit ang Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) ayon sa mga tagubilin ng gumawa. Ang DNA ay sinundan gamit ang isang ONT GridION™ Mk1 sequencer na may Min106D flow cell (R 9.4.1). Ang mga setting ng sequencing ay: mataas na katumpakan ng base calling, minimum na q value na 9, barcode setup, at barcode trim. Ang mga sample ay sinuri sa sequence sa loob ng 72 oras, pagkatapos nito ay isinumite ang base call data para sa karagdagang pagproseso at pagsusuri.
Isinagawa ang pagproseso ng bioinformatics gamit ang mga naunang inilarawang pamamaraan (Greenman et al., 2024). Ang mga FASTQ file na nakuha mula sa sequencing ay hinati sa mga direktoryo para sa bawat sample. Bago ang pagsusuri ng bioinformatics, ang datos ay pinoproseso gamit ang sumusunod na pipeline: una, ang mga FASTQ file ng mga sample ay pinagsama sa isang FASTQ file. Pagkatapos, ang mga read na mas maikli sa 1000 bp ay sinala gamit ang Filtlong v. 0.2.1, kung saan ang tanging parameter na binago ay –min_length 1000 (Wick, 2024). Bago ang karagdagang pag-filter, ang kalidad ng pagbasa ay kinokontrol gamit ang NanoPlot v. 1.41.3 gamit ang mga sumusunod na parameter: –fastq –plots dot –N50 -o
Para sa klasipikasyon ng taxonomy, ang mga read at assembled contig ay inuri gamit ang Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Bumuo ng mga ulat at nag-output ng mga file para sa mga read at assembly, ayon sa pagkakabanggit. Gamitin ang opsyong –use-names upang suriin ang mga read at assembly. Ang mga opsyong –gzip-compressed at –paired ay tinukoy para sa mga read segment. Ang relatibong kasaganaan ng taxa sa mga metagenomes ay tinantya gamit ang Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Una kaming lumikha ng isang kmer database na naglalaman ng 1000 base gamit ang bracken-build na may mga sumusunod na parameter: -d
Ang anotasyon ng gene at pagtatantya ng relatibong kasaganaan ay isinagawa gamit ang isang binagong bersyon ng protocol na inilarawan nina Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Una, ang mga contig na mas maikli sa 500 bp ay tinanggal mula sa lahat ng mga assembly gamit ang SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Ang mga napiling assembly ay pinagsama sa isang pan-metagenome. Ang mga open reading frame (ORF) ay kinilala gamit ang Prodigal v. 1.0.1 (isang parallel na bersyon ng Prodigal v. 2.6.3) na may mga sumusunod na parameter: -d
Ang mga gene ay unang pinagsama-sama ayon sa Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ortholog (KO) identifiers na itinalaga ng eggNOG upang ihambing ang mga gene pathway abundance. Ang mga gene na walang knockout o mga gene na may maraming knockout ay tinanggal bago ang pagsusuri. Ang average na abundance ng bawat KO bawat sample ay kinalkula at isinagawa ang statistical analysis. Ang mga PPA metabolism gene ay tinukoy bilang anumang gene na binigyan ng row na ko00640 sa column na KEGG_Pathway, na nagpapahiwatig ng isang papel sa propionate metabolism ayon sa KEGG. Ang mga gene na natukoy na nauugnay sa produksyon ng PPA ay nakalista sa Supplementary Table 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Ang mga permutation test ay isinagawa upang matukoy ang mga PPA metabolism at production gene na mas marami sa bawat uri ng sample. Isang libong permutation ang isinagawa para sa bawat gene na sinuri. Isang p-value na 0.05 ang ginamit bilang cutoff upang matukoy ang statistical significance. Ang mga functional annotation ay itinalaga sa mga indibidwal na gene sa loob ng isang cluster batay sa mga annotation ng mga kinatawan na gene sa loob ng cluster. Ang mga taxa na nauugnay sa metabolismo ng PPA at/o produksyon ng PPA ay maaaring matukoy sa pamamagitan ng pagtutugma ng mga contig ID sa mga output file ng Kraken2 na may parehong mga contig ID na pinanatili sa panahon ng functional annotation gamit ang eggNOG. Ang pagsubok sa kahalagahan ay isinagawa gamit ang Mann-Whitney U test na inilarawan dati. Ang pagwawasto para sa maraming pagsubok ay isinagawa gamit ang pamamaraang Benjamini-Hochberg. Ang p-value na ≤ 0.05 ay ginamit bilang cutoff upang matukoy ang kahalagahang pang-istatistika.
Ang pagkakaiba-iba ng gut microbiome ng mga daga ay tinasa gamit ang Simpson diversity index. Walang naobserbahang makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng mga sample ng control at PPA sa mga tuntunin ng pagkakaiba-iba ng genus at species (p-value para sa genus: 0.18, p-value para sa species: 0.16) (Figure 1). Pagkatapos ay inihambing ang komposisyon ng microbial gamit ang principal component analysis (PCA). Ipinapakita ng Figure 2 ang kumpol-kumpol ng mga sample ayon sa kanilang phyla, na nagpapahiwatig na may mga pagkakaiba sa komposisyon ng species ng mga microbiome sa pagitan ng mga sample ng PPA at control. Ang kumpol-kumpol na ito ay hindi gaanong kapansin-pansin sa antas ng genus, na nagmumungkahi na ang PPA ay nakakaapekto sa ilang bacteria (Karagdagang Fig. 1).
Pigura 1. Alpha diversity ng genera at komposisyon ng species ng mouse gut microbiome. Mga box plot na nagpapakita ng mga Simpson diversity indices ng genera (A) at species (B) sa PPA at mga control sample. Ang kahalagahan ay natukoy gamit ang Mann-Whitney U test, at ang multiple correction ay isinagawa gamit ang Benjamini-Hochberg procedure. ns, ang p-value ay hindi makabuluhan (p>0.05).
Pigura 2. Mga resulta ng pagsusuri ng pangunahing bahagi ng komposisyon ng microbiome ng bituka ng daga sa antas ng uri. Ipinapakita ng plot ng pagsusuri ng pangunahing bahagi ang distribusyon ng mga sample sa kanilang unang dalawang pangunahing bahagi. Ipinapahiwatig ng mga kulay ang uri ng sample: Ang mga daga na nalantad sa PPA ay lila at ang mga daga na kontrol ay dilaw. Ang mga pangunahing bahagi 1 at 2 ay naka-plot sa x-axis at y-axis, ayon sa pagkakabanggit, at ipinapahayag bilang kanilang ipinaliwanag na variance ratio.
Gamit ang datos ng RLE transformed count, isang makabuluhang pagbaba sa median Bacteroidetes/Bacilli ratio ang naobserbahan sa mga daga na may kontrol at PPA (control: 9.66, PPA: 3.02; p-value = 0.0011). Ang pagkakaibang ito ay dahil sa mas mataas na kasaganaan ng Bacteroidetes sa mga daga na may PPA kumpara sa mga kontrol, bagama't hindi makabuluhan ang pagkakaiba (control mean CLR: 5.51, PPA mean CLR: 6.62; p-value = 0.054), habang ang kasaganaan ng Bacteroidetes ay magkatulad (control mean CLR: 7.76, PPA mean CLR: 7.60; p-value = 0.18).
Ang pagsusuri sa kasaganaan ng mga taxonomic member ng gut microbiome ay nagsiwalat na ang 1 phylum at 77 species ay may malaking pagkakaiba sa pagitan ng mga sample ng PPA at control (Karagdagang Talahanayan 2). Ang kasaganaan ng 59 species sa mga sample ng PPA ay mas mataas nang malaki kaysa sa mga sample ng control, habang ang kasaganaan ng 16 na species lamang sa mga sample ng control ay mas mataas kaysa sa mga sample ng PPA (Larawan 3).
Pigura 3. Pagkakaiba-iba ng kasaganaan ng taxa sa gut microbiome ng PPA at control mice. Ang mga bulkan plot ay nagpapakita ng mga pagkakaiba sa kasaganaan ng genera (A) o species (B) sa pagitan ng mga sample ng PPA at control. Ang mga kulay abong tuldok ay nagpapahiwatig ng walang makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan ng taxa. Ang mga may kulay na tuldok ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan (p-value ≤ 0.05). Ang nangungunang 20 taxa na may pinakamalaking pagkakaiba sa kasaganaan sa pagitan ng mga uri ng sample ay ipinapakita sa pula at mapusyaw na asul (mga sample ng kontrol at PPA), ayon sa pagkakabanggit. Ang mga dilaw at lilang tuldok ay hindi bababa sa 2.7 beses na mas sagana sa mga sample ng kontrol o PPA kaysa sa mga kontrol. Ang mga itim na tuldok ay kumakatawan sa mga taxa na may makabuluhang magkakaibang kasaganaan, na may mean na pagkakaiba sa CLR sa pagitan ng -1 at 1. Ang mga P value ay kinalkula gamit ang Mann-Whitney U test at itinama para sa maraming pagsubok gamit ang pamamaraang Benjamini-Hochberg. Ang mga naka-bold na mean na pagkakaiba sa CLR ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan.
Matapos suriin ang komposisyon ng mikrobyo sa bituka, nagsagawa kami ng functional annotation ng microbiome. Matapos salain ang mga gene na mababa ang kalidad, isang kabuuang 378,355 natatanging gene ang natukoy sa lahat ng sample. Ang nabagong kasaganaan ng mga gene na ito ay ginamit para sa principal component analysis (PCA), at ang mga resulta ay nagpakita ng mataas na antas ng clustering ng mga uri ng sample batay sa kanilang mga functional profile (Figure 4).
Pigura 4. Mga resulta ng PCA gamit ang functional profile ng microbiome ng bituka ng daga. Ipinapakita ng PCA plot ang distribusyon ng mga sample sa kanilang unang dalawang pangunahing bahagi. Ipinapahiwatig ng mga kulay ang uri ng sample: Ang mga daga na nalantad sa PPA ay lila at ang mga control mice ay dilaw. Ang mga pangunahing bahagi 1 at 2 ay naka-plot sa x-axis at y-axis, ayon sa pagkakabanggit, at ipinapahayag bilang kanilang ipinaliwanag na variance ratio.
Sumunod naming sinuri ang kasaganaan ng mga KEGG knockout sa iba't ibang uri ng sample. Isang kabuuang 3648 natatanging knockout ang natukoy, kung saan 196 ang mas marami sa mga control sample at 106 ang mas marami sa mga PPA sample (Larawan 5). Isang kabuuang 145 gene ang nakita sa mga control sample at 61 gene sa mga PPA sample, na may makabuluhang magkakaibang kasaganaan. Ang mga pathway na may kaugnayan sa metabolismo ng lipid at aminosugar ay mas mayaman sa mga PPA sample (Karagdagang Talahanayan 3). Ang mga pathway na may kaugnayan sa metabolismo ng nitrogen at mga sistema ng sulfur relay ay mas mayaman sa mga control sample (Karagdagang Talahanayan 3). Ang kasaganaan ng mga gene na may kaugnayan sa metabolismo ng aminosugar/nucleotide (ko:K21279) at metabolismo ng inositol phosphate (ko:K07291) ay mas mataas sa mga PPA sample (Larawan 5). Ang mga control sample ay may mas maraming gene na may kaugnayan sa metabolismo ng benzoate (ko:K22270), metabolismo ng nitrogen (ko:K00368), at glycolysis/gluconeogenesis (ko:K00131) (Larawan 5).
Larawan 5. Pagkakaiba-iba ng kasaganaan ng KOs sa gut microbiome ng PPA at control mice. Inilalarawan ng volcano plot ang mga pagkakaiba sa kasaganaan ng mga functional group (KOs). Ang mga kulay abong tuldok ay nagpapahiwatig ng mga KO na ang kasaganaan ay hindi makabuluhang naiiba sa pagitan ng mga uri ng sample (p-value > 0.05). Ang mga may kulay na tuldok ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan (p-value ≤ 0.05). Ang 20 KOs na may pinakamalaking pagkakaiba sa kasaganaan sa pagitan ng mga uri ng sample ay ipinapakita sa pula at mapusyaw na asul, na tumutugma sa mga sample ng control at PPA, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga dilaw at lilang tuldok ay nagpapahiwatig ng mga KO na hindi bababa sa 2.7 beses na mas sagana sa mga sample ng control at PPA, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga itim na tuldok ay nagpapahiwatig ng mga KO na may makabuluhang magkakaibang kasaganaan, na may mean na pagkakaiba sa CLR sa pagitan ng -1 at 1. Ang mga P value ay kinalkula gamit ang Mann-Whitney U test at inayos para sa maraming paghahambing gamit ang Benjamini-Hochberg procedure. Ang NaN ay nagpapahiwatig na ang KO ay hindi kabilang sa isang pathway sa KEGG. Ang mga naka-bold na mean na halaga ng pagkakaiba sa CLR ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan. Para sa detalyadong impormasyon tungkol sa mga landas kung saan kabilang ang mga nakalistang KO, tingnan ang Karagdagang Talahanayan 3.
Sa mga gene na may anotasyon, 1601 gene ang may makabuluhang magkakaibang kasaganaan sa pagitan ng mga uri ng sample (p ≤ 0.05), kung saan ang bawat gene ay hindi bababa sa 2.7 beses na mas marami. Sa mga gene na ito, 4 na gene ang mas marami sa mga control sample at 1597 gene ang mas marami sa mga sample ng PPA. Dahil ang PPA ay may mga antimicrobial na katangian, sinuri namin ang kasaganaan ng metabolismo at mga production gene ng PPA sa pagitan ng mga uri ng sample. Sa 1332 gene na may kaugnayan sa metabolismo ng PPA, 27 gene ang mas marami sa mga control sample at 12 gene ang mas marami sa mga sample ng PPA. Sa 223 gene na may kaugnayan sa produksyon ng PPA, 1 gene ang mas marami sa mga sample ng PPA. Ipinapakita pa ng Figure 6A ang mas mataas na kasaganaan ng mga gene na kasangkot sa metabolismo ng PPA, na may mas mataas na kasaganaan sa mga control sample at malalaking effect size, habang itinatampok ng Figure 6B ang mga indibidwal na gene na may mas mataas na kasaganaan na naobserbahan sa mga sample ng PPA.
Larawan 6. Pagkakaiba-ibang kasaganaan ng mga gene na may kaugnayan sa PPA sa microbiome ng bituka ng daga. Inilalarawan ng mga plot ng bulkan ang mga pagkakaiba sa kasaganaan ng mga gene na nauugnay sa metabolismo ng PPA (A) at produksyon ng PPA (B). Ang mga kulay-abong tuldok ay nagpapahiwatig ng mga gene na ang kasaganaan ay hindi makabuluhang naiiba sa pagitan ng mga uri ng sample (p-value > 0.05). Ang mga may kulay na tuldok ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan (p-value ≤ 0.05). Ang 20 gene na may pinakamalaking pagkakaiba sa kasaganaan ay ipinapakita sa pula at mapusyaw na asul (mga sample ng kontrol at PPA), ayon sa pagkakabanggit. Ang kasaganaan ng mga dilaw at lilang tuldok ay hindi bababa sa 2.7 beses na mas malaki sa mga sample ng kontrol at PPA kaysa sa mga sample ng kontrol. Ang mga itim na tuldok ay kumakatawan sa mga gene na may makabuluhang magkakaibang kasaganaan, na may mean na pagkakaiba sa CLR sa pagitan ng -1 at 1. Ang mga P value ay kinalkula gamit ang Mann-Whitney U test at itinuwid para sa maraming paghahambing gamit ang pamamaraang Benjamini-Hochberg. Ang mga gene ay tumutugma sa mga kinatawan na gene sa non-redundant gene catalog. Ang mga pangalan ng gene ay binubuo ng simbolo ng KEGG na nagsasaad ng isang KO gene. Ang mga naka-bold na mean na pagkakaiba sa CLR ay nagpapahiwatig ng makabuluhang magkakaibang kasaganaan. Ang gitling (-) ay nagpapahiwatig na walang simbolo para sa gene sa KEGG database.
Ang mga taxa na may mga gene na may kaugnayan sa metabolismo at/o produksyon ng PPA ay kinilala sa pamamagitan ng pagtutugma ng taxonomic identity ng mga contig sa contig ID ng gene. Sa antas ng genus, 130 genera ang natagpuang may mga gene na may kaugnayan sa metabolismo ng PPA at 61 genera ang natagpuang may mga gene na may kaugnayan sa produksyon ng PPA (Karagdagang Talahanayan 4). Gayunpaman, walang genera ang nagpakita ng mga makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan (p > 0.05).
Sa antas ng uri, 144 na uri ng bakterya ang natagpuang may mga gene na nauugnay sa metabolismo ng PPA at 68 na uri ng bakterya ang natagpuang may mga gene na nauugnay sa produksyon ng PPA (Karagdagang Talahanayan 5). Sa mga metabolizer ng PPA, walong bakterya ang nagpakita ng makabuluhang pagtaas sa kasaganaan sa pagitan ng mga uri ng sample, at lahat ay nagpakita ng makabuluhang pagbabago sa epekto (Karagdagang Talahanayan 6). Lahat ng natukoy na mga metabolizer ng PPA na may makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan ay mas marami sa mga sample ng PPA. Ang klasipikasyon sa antas ng uri ay nagsiwalat ng mga kinatawan ng genera na hindi gaanong naiiba sa pagitan ng mga uri ng sample, kabilang ang ilang uri ng Bacteroides at Ruminococcus, pati na rin ang Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus, at Alcaligenes polymorpha. Sa mga bakteryang gumagawa ng PPA, apat na bakterya ang nagpakita ng makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan sa pagitan ng mga uri ng sample. Kabilang sa mga uri na may makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan ang Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis, at Ruminococcus bovis.
Sa pag-aaral na ito, sinuri namin ang mga epekto ng pagkakalantad sa PPA sa gut microbiota ng mga daga. Ang PPA ay maaaring magdulot ng iba't ibang tugon sa bacteria dahil ito ay ginawa ng ilang partikular na species, ginagamit bilang pinagkukunan ng pagkain ng ibang species, o may mga antimicrobial effect. Samakatuwid, ang pagdaragdag nito sa kapaligiran ng bituka sa pamamagitan ng dietary supplementation ay maaaring magkaroon ng iba't ibang epekto depende sa tolerance, susceptibility, at kakayahang gamitin ito bilang pinagkukunan ng sustansya. Ang mga sensitibong bacterial species ay maaaring alisin at palitan ng mga mas lumalaban sa PPA o kayang gamitin ito bilang pinagkukunan ng pagkain, na humahantong sa mga pagbabago sa komposisyon ng gut microbiota. Ang aming mga resulta ay nagpakita ng mga makabuluhang pagkakaiba sa komposisyon ng microbial ngunit walang epekto sa pangkalahatang pagkakaiba-iba ng microbial. Ang pinakamalaking epekto ay naobserbahan sa antas ng species, na may mahigit 70 taxa na makabuluhang magkaiba sa kasaganaan sa pagitan ng PPA at mga control sample (Supplementary Table 2). Ang karagdagang pagsusuri sa komposisyon ng mga sample na nalantad sa PPA ay nagpakita ng mas malaking heterogeneity ng mga microbial species kumpara sa mga hindi nalantad na sample, na nagmumungkahi na ang PPA ay maaaring mapahusay ang mga katangian ng paglaki ng bacteria at limitahan ang mga populasyon ng bacteria na maaaring mabuhay sa mga kapaligirang mayaman sa PPA. Kaya, ang PPA ay maaaring pumipili ng mga pagbabago sa halip na magdulot ng malawakang pagkagambala sa pagkakaiba-iba ng gut microbiota.
Ang mga food preservative tulad ng PPA ay dati nang naipakita na nagbabago sa kasaganaan ng mga bahagi ng gut microbiome nang hindi naaapektuhan ang pangkalahatang pagkakaiba-iba (Nagpal et al., 2021). Dito, naobserbahan namin ang mga pinakakapansin-pansing pagkakaiba sa pagitan ng mga species ng Bacteroidetes sa loob ng phylum na Bacteroidetes (dating kilala bilang Bacteroidetes), na lubos na pinayaman sa mga daga na nalantad sa PPA. Ang pagtaas ng kasaganaan ng mga species ng Bacteroides ay nauugnay sa pagtaas ng pagkasira ng mucus, na maaaring magpataas ng panganib ng impeksyon at magdulot ng pamamaga (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Natuklasan sa isang pag-aaral na ang mga bagong silang na lalaking daga na ginagamot ng Bacteroides fragilis ay nagpakita ng mga sosyal na pag-uugali na nakapagpapaalaala sa autism spectrum disorder (ASD) (Carmel et al., 2023), at ipinakita ng iba pang mga pag-aaral na ang mga species ng Bacteroides ay maaaring baguhin ang aktibidad ng immune system at humantong sa autoimmune inflammatory cardiomyopathy (Gil-Cruz et al., 2019). Ang mga uri na kabilang sa genera na Ruminococcus, Prevotella, at Parabacteroides ay tumaas din nang malaki sa mga daga na nalantad sa PPA (Coretti et al., 2018). Ang ilang uri ng Ruminococcus ay nauugnay sa mga sakit tulad ng Crohn's disease sa pamamagitan ng produksyon ng mga proinflammatory cytokine (Henke et al., 2019), habang ang mga uri ng Prevotella tulad ng Prevotella humani ay nauugnay sa mga sakit na metabolic tulad ng hypertension at insulin sensitivity (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Panghuli, natuklasan namin na ang ratio ng Bacteroidetes (dating kilala bilang Firmicutes) sa Bacteroidetes ay mas mababa nang malaki sa mga daga na nalantad sa PPA kaysa sa mga kontrol na daga dahil sa mas mataas na kabuuang kasaganaan ng mga uri ng Bacteroidetes. Ang ratio na ito ay naipakita na dati bilang isang mahalagang tagapagpahiwatig ng homeostasis ng bituka, at ang mga kaguluhan sa ratio na ito ay naiugnay sa iba't ibang estado ng sakit (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), kabilang ang mga nagpapaalab na sakit sa bituka (Stojanov et al., 2020). Sa pangkalahatan, ang mga species ng phylum na Bacteroidetes ay tila pinakamatinding naapektuhan ng mataas na dietary PPA. Maaaring ito ay dahil sa mas mataas na tolerance sa PPA o sa kakayahang gamitin ang PPA bilang pinagkukunan ng enerhiya, na ipinakita na totoo para sa kahit isang species, ang Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Bilang kahalili, ang pagkakalantad sa PPA ng ina ay maaaring mapahusay ang pag-unlad ng fetus sa pamamagitan ng paggawa sa bituka ng mga supling ng daga na mas madaling kapitan ng kolonisasyon ng Bacteroidetes; gayunpaman, ang disenyo ng aming pag-aaral ay hindi nagpahintulot sa naturang pagtatasa.
Ang pagtatasa ng nilalaman ng metagenomic ay nagpakita ng mga makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan ng mga gene na nauugnay sa metabolismo at produksyon ng PPA, kung saan ang mga daga na nalantad sa PPA ay nagpapakita ng mas mataas na kasaganaan ng mga gene na responsable para sa produksyon ng PPA, samantalang ang mga daga na hindi nalantad sa PPA ay nagpakita ng mas mataas na kasaganaan ng mga gene na responsable para sa metabolismo ng PAA (Larawan 6). Ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang epekto ng PPA sa komposisyon ng microbial ay maaaring hindi lamang dahil sa paggamit nito, kung hindi man, ang kasaganaan ng mga gene na nauugnay sa metabolismo ng PPA ay dapat sana ay nagpakita ng mas mataas na kasaganaan sa gut microbiome ng mga daga na nalantad sa PPA. Ang isang paliwanag ay ang PPA ay namamagitan sa kasaganaan ng bacteria pangunahin sa pamamagitan ng mga antimicrobial effect nito sa halip na sa pamamagitan ng paggamit nito ng bacteria bilang isang nutrient. Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na pinipigilan ng PPA ang paglaki ng Salmonella Typhimurium sa isang paraan na nakadepende sa dosis (Jacobson et al., 2018). Ang pagkakalantad sa mas mataas na konsentrasyon ng PPA ay maaaring pumili para sa bacteria na lumalaban sa mga antimicrobial properties nito at maaaring hindi kinakailangang ma-metabolize o makagawa nito. Halimbawa, maraming species ng Parabacteroides ang nagpakita ng mas mataas na kasaganaan sa mga sample ng PPA, ngunit walang mga gene na nauugnay sa metabolismo o produksyon ng PPA ang natukoy (Mga Supplementary Tables 2, 4, at 5). Bukod pa rito, ang produksyon ng PPA bilang isang byproduct ng fermentation ay malawak na ipinamamahagi sa iba't ibang bacteria (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Ang mas mataas na bacterial diversity ay maaaring dahilan ng mas mataas na kasaganaan ng mga gene na may kaugnayan sa metabolismo ng PPA sa mga control sample (Averina et al., 2020). Bukod pa rito, 27 (2.14%) lamang ng 1332 gene ang hinulaang mga gene na eksklusibong nauugnay sa metabolismo ng PPA. Maraming gene na nauugnay sa metabolismo ng PPA ang kasangkot din sa iba pang metabolic pathways. Ipinapakita pa nito na ang kasaganaan ng mga gene na kasangkot sa metabolismo ng PPA ay mas mataas sa mga control sample; ang mga gene na ito ay maaaring gumana sa mga pathway na hindi nagreresulta sa paggamit o pagbuo ng PPA bilang isang byproduct. Sa kasong ito, isang gene lamang na nauugnay sa pagbuo ng PPA ang nagpakita ng mga makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan sa pagitan ng mga uri ng sample. Kabaligtaran sa mga gene na nauugnay sa metabolismo ng PPA, ang mga marker gene para sa produksyon ng PPA ay napili dahil direktang kasangkot ang mga ito sa bacterial pathway para sa produksyon ng PPA. Sa mga daga na nalantad sa PPA, lahat ng species ay natagpuang may makabuluhang pagtaas ng kasaganaan at kapasidad na gumawa ng PPA. Sinusuportahan nito ang hula na pipiliin ng mga PPA ang mga prodyuser ng PPA at samakatuwid ay hinuhulaan na tataas ang kapasidad ng produksyon ng PPA. Gayunpaman, ang kasaganaan ng gene ay hindi kinakailangang may kaugnayan sa ekspresyon ng gene; kaya naman, bagama't mas mataas ang kasaganaan ng mga gene na nauugnay sa metabolismo ng PPA sa mga control sample, maaaring iba ang rate ng ekspresyon (Shi et al., 2014). Upang kumpirmahin ang kaugnayan sa pagitan ng paglaganap ng mga gene na gumagawa ng PPA at produksyon ng PPA, kinakailangan ang mga pag-aaral sa ekspresyon ng mga gene na kasangkot sa produksyon ng PPA.
Ang functional annotation ng PPA at control metagenomes ay nagpakita ng ilang pagkakaiba. Ang pagsusuri ng PCA sa nilalaman ng gene ay nagpakita ng mga hiwalay na kumpol sa pagitan ng mga sample ng PPA at control (Larawan 5). Ang within-sample clustering ay nagpakita na ang nilalaman ng control gene ay mas magkakaiba, habang ang mga sample ng PPA ay magkakasamang nagkumpol. Ang clustering ayon sa nilalaman ng gene ay maihahambing sa clustering ayon sa komposisyon ng species. Samakatuwid, ang mga pagkakaiba sa kasaganaan ng pathway ay naaayon sa mga pagbabago sa kasaganaan ng mga partikular na species at strain sa loob ng mga ito. Sa mga sample ng PPA, dalawang pathway na may mas mataas na kasaganaan ay nauugnay sa aminosugar/nucleotide sugar metabolism (ko:K21279) at maraming pathway ng lipid metabolism (ko:K00647, ko:K03801; Supplementary Table 3). Ang mga gene na nauugnay sa ko:K21279 ay kilalang nauugnay sa genus na Bacteroides, isa sa mga genera na may mas mataas na bilang ng mga species sa mga sample ng PPA. Ang enzyme na ito ay maaaring umiwas sa immune response sa pamamagitan ng pagpapahayag ng capsular polysaccharides (Wang et al., 2008). Ito ay maaaring dahilan ng pagtaas ng Bacteroidetes na naobserbahan sa mga daga na nalantad sa PPA. Kinukumpleto nito ang pagtaas ng synthesis ng fatty acid na naobserbahan sa PPA microbiome. Ginagamit ng bacteria ang FASIIko:K00647 (fabB) pathway upang makagawa ng mga fatty acid, na maaaring makaimpluwensya sa mga metabolic pathway ng host (Yao at Rock, 2015; Johnson et al., 2020), at ang mga pagbabago sa metabolismo ng lipid ay maaaring may papel sa neurodevelopment (Yu et al., 2020). Ang isa pang pathway na nagpapakita ng pagtaas ng kasaganaan sa mga sample ng PPA ay ang steroid hormone biosynthesis (ko:K12343). Mayroong lumalaking ebidensya na mayroong kabaligtaran na relasyon sa pagitan ng kakayahan ng gut microbiota na makaimpluwensya sa mga antas ng hormone at maimpluwensyahan ng mga hormone, kung kaya't ang mataas na antas ng steroid ay maaaring magkaroon ng mga kahihinatnan sa kalusugan (Tetel et al., 2018).
Ang pag-aaral na ito ay may mga limitasyon at konsiderasyon. Isang mahalagang pagkakaiba ay hindi kami nagsagawa ng mga pisyolohikal na pagtatasa sa mga hayop. Samakatuwid, hindi posibleng direktang maghinuha kung ang mga pagbabago sa microbiome ay nauugnay sa anumang sakit. Isa pang konsiderasyon ay ang mga daga sa pag-aaral na ito ay pinakain ng parehong diyeta gaya ng kanilang mga ina. Maaaring matukoy ng mga pag-aaral sa hinaharap kung ang paglipat mula sa diyeta na mayaman sa PPA patungo sa diyeta na walang PPA ay nagpapabuti sa mga epekto nito sa microbiome. Ang isang limitasyon ng aming pag-aaral, tulad ng marami pang iba, ay ang limitadong laki ng sample. Bagama't maaaring makabuo ng mga wastong konklusyon, ang mas malaking laki ng sample ay magbibigay ng mas malaking istatistikal na kapangyarihan kapag sinusuri ang mga resulta. Maingat din kami sa pagbuo ng mga konklusyon tungkol sa kaugnayan sa pagitan ng mga pagbabago sa gut microbiome at anumang sakit (Yap et al., 2021). Ang mga nakakalitong salik kabilang ang edad, kasarian, at diyeta ay maaaring makaimpluwensya nang malaki sa komposisyon ng mga mikroorganismo. Ang mga salik na ito ay maaaring magpaliwanag sa mga hindi pagkakapare-pareho na naobserbahan sa literatura tungkol sa kaugnayan ng gut microbiome sa mga kumplikadong sakit (Johnson et al., 2019; Lagod at Naser, 2023). Halimbawa, ang mga miyembro ng genus na Bacteroidetes ay naipakita na tumaas o bumaba sa mga hayop at tao na may ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Katulad nito, ang mga pag-aaral sa komposisyon ng bituka sa mga pasyenteng may mga sakit sa pamamaga ng bituka ay nakatuklas ng parehong pagtaas at pagbaba sa parehong taxa (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Upang limitahan ang epekto ng bias sa kasarian, sinubukan naming tiyakin ang pantay na representasyon ng mga kasarian upang ang mga pagkakaiba ay malamang na dulot ng diyeta. Ang isang hamon ng functional annotation ay ang pag-alis ng mga redundant na sequence ng gene. Ang aming paraan ng gene clustering ay nangangailangan ng 95% sequence identity at 85% length similarity, pati na rin ang 90% alignment coverage upang maalis ang false clustering. Gayunpaman, sa ilang mga kaso, naobserbahan namin ang mga COG na may parehong mga anotasyon (hal., MUT) (Fig. 6). Kinakailangan ang mga karagdagang pag-aaral upang matukoy kung ang mga ortholog na ito ay magkakaiba, nauugnay sa mga partikular na genera, o kung ito ay isang limitasyon ng pamamaraan ng gene clustering. Ang isa pang limitasyon ng functional annotation ay ang potensyal na maling pag-uuri; ang bacterial gene na mmdA ay isang kilalang enzyme na kasangkot sa propionate synthesis, ngunit hindi ito iniuugnay ng KEGG sa propionate metabolic pathway. Sa kabaligtaran, ang scpB at mmcD ortholog ay magkaugnay. Ang malaking bilang ng mga gene na walang itinalagang knockout ay maaaring magresulta sa kawalan ng kakayahang matukoy ang mga gene na nauugnay sa PPA kapag tinatasa ang kasaganaan ng gene. Ang mga pag-aaral sa hinaharap ay makikinabang sa metatranscriptome analysis, na maaaring magbigay ng mas malalim na pag-unawa sa mga functional na katangian ng gut microbiota at mag-uugnay sa gene expression sa mga potensyal na downstream effect. Para sa mga pag-aaral na kinasasangkutan ng mga partikular na neurodevelopmental disorder o mga inflammatory bowel disease, kinakailangan ang mga physiological at behavioral assessment ng mga hayop upang iugnay ang mga pagbabago sa komposisyon ng microbiome sa mga karamdamang ito. Ang mga karagdagang pag-aaral na naglilipat ng gut microbiome sa mga daga na walang germ ay magiging kapaki-pakinabang din upang matukoy kung ang microbiome ay isang driver o katangian ng sakit.
Bilang buod, ipinakita namin na ang dietary PPA ay gumaganap bilang isang salik sa pagbabago ng komposisyon ng gut microbiota. Ang PPA ay isang preservative na inaprubahan ng FDA na malawakang matatagpuan sa iba't ibang pagkain na, kapag matagal na nalantad, ay maaaring humantong sa pagkagambala sa normal na gut flora. Nakakita kami ng mga pagbabago sa kasaganaan ng ilang bacteria, na nagmumungkahi na ang PPA ay maaaring makaimpluwensya sa komposisyon ng gut microbiota. Ang mga pagbabago sa microbiota ay maaaring humantong sa mga pagbabago sa antas ng ilang metabolic pathway, na maaaring humantong sa mga pagbabago sa physiological na may kaugnayan sa kalusugan ng host. Kinakailangan ang mga karagdagang pag-aaral upang matukoy kung ang mga epekto ng dietary PPA sa komposisyon ng microbial ay maaaring humantong sa dysbiosis o iba pang mga sakit. Ang pag-aaral na ito ay naglalatag ng pundasyon para sa mga pag-aaral sa hinaharap kung paano maaaring makaapekto ang mga epekto ng PPA sa komposisyon ng bituka sa kalusugan ng tao.
Ang mga dataset na ipinakita sa pag-aaral na ito ay makukuha sa mga online repository. Ang pangalan ng repository at accession number ay: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Ang pag-aaral na ito tungkol sa hayop ay inaprubahan ng University of Central Florida Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) (Animal Use Permit Number: PROTO202000002). Ang pag-aaral na ito ay sumusunod sa mga lokal na batas, regulasyon, at mga kinakailangan ng institusyon.
NG: Konseptwalisasyon, Pag-uuri ng Datos, Pormal na Pagsusuri, Imbestigasyon, Metodolohiya, Software, Biswalisasyon, Pagsulat (orihinal na burador), Pagsulat (pagsusuri at pag-eedit). LA: Konseptwalisasyon, Pag-uuri ng Datos, Metodolohiya, Mga Mapagkukunan, Pagsulat (pagsusuri at pag-eedit). SH: Pormal na pagsusuri, Software, Pagsulat (pagsusuri at pag-eedit). SA: Imbestigasyon, Pagsulat (pagsusuri at pag-eedit). Punong Hukom: Imbestigasyon, Pagsulat (pagsusuri at pag-eedit). SN: Konseptwalisasyon, Pangangasiwa ng Proyekto, Mga Mapagkukunan, Superbisyon, Pagsulat (pagsusuri at pag-eedit). TA: Konseptwalisasyon, Pangangasiwa ng Proyekto, Superbisyon, Pagsulat (pagsusuri at pag-eedit).
Ipinahayag ng mga may-akda na wala silang natanggap na suportang pinansyal para sa pananaliksik, pagiging may-akda, at/o paglalathala ng artikulong ito.
Ipinapahayag ng mga may-akda na ang pananaliksik ay isinagawa nang walang anumang ugnayang pangkomersyo o pinansyal na maaaring bigyang-kahulugan bilang isang potensyal na salungatan ng interes. Hindi naaangkop.
Ang lahat ng opinyon na ipinahayag sa artikulong ito ay pawang sa mga may-akda lamang at hindi kinakailangang sumasalamin sa mga pananaw ng kanilang mga institusyon, tagapaglathala, editor, o tagasuri. Anumang mga produktong sinusuri sa artikulong ito, o anumang mga pahayag na ginawa ng kanilang mga tagagawa, ay hindi ginagarantiyahan o ineendorso ng tagapaglathala.
Ang karagdagang materyal para sa artikulong ito ay matatagpuan online: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Ang propionic acid ay nagdudulot ng gliosis at neuroinflammation sa pamamagitan ng pag-regulate ng PTEN/AKT pathway sa mga autism spectrum disorder. Mga ulat pang-agham 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Pagsusuring istatistikal ng datos ng komposisyon. JR Stat Soc Ser B Method. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Ang ratio ng Firmicutes/Bacteroidetes bilang isang panganib na kadahilanan para sa kanser sa suso. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Pagsusuri ng differential expression ng datos ng bilang ng sequence. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Fecal microbiota at ang metabolome sa mga batang may autism at pervasive developmental disorder na hindi tinukoy sa ibang paraan. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Mga katangian ng bacterial neurometabolic ng intestinal microbiota sa mga batang may autism spectrum disorder. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Ang microbiome bilang isang organo ng tao. Clinical Microbiology and Infection 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Mga bagong pananaw sa pisyolohiya ng bakteryang gumagawa ng propionic acid: Anaerotignum propionicum at Anaerotignum neopropionicum (dating Clostridium propionicum at Clostridium neopropionicum). Mga Mikroorganismo 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Nutrisyon ng ina at pag-unlad ng sanggol. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., at Hochberg, J. (1995). Pagkontrol sa false-positive rate: Isang praktikal at mahusay na pamamaraan sa multiple testing. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Oras ng pag-post: Abril-18-2025