Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta para sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga estilo at JavaScript.
Hindi tulad ng mga vertebrate, ang mga insekto ay malawakang pinaniniwalaang kulang sa mga sex steroid hormone na may kinikilingan sa lalaki. Sa Anopheles gambiae, ang ecdysone steroid na 20-hydroxyecdysone (20E) ay tila umunlad upang kontrolin ang paglaki ng itlog kapag na-synthesize ng mga babae2 at upang magdulot ng isang refractory period ng pagsasama kapag inililipat sa sekswal ng mga lalaki3. Dahil ang paglaki ng itlog at pagsasama ay mahahalagang katangian ng reproduktibo, ang pag-unawa kung paano isinasama ng mga babaeng lamok na Anopheles ang mga hormonal signal na ito ay maaaring mapadali ang disenyo ng mga bagong programa sa pagkontrol ng malaria. Dito, ipinapakita namin na ang mga reproductive function na ito ay kinokontrol ng mga natatanging sex steroid sa pamamagitan ng isang kumplikadong network ng mga ecdysteroid-activating/inactivating enzymes. Natukoy namin ang isang male-specific oxidized ecdysone, 3-dehydro-20E (3D20E), na nagpoprotekta sa pagiging magulang sa pamamagitan ng pagsasara ng sekswal na pagtanggap ng babae kasunod ng sekswal na paglilipat at pag-activate sa pamamagitan ng dephosphorylation. Kapansin-pansin, ang 3D20E transfer ay nag-udyok din sa pagpapahayag ng mga reproductive gene na nagpapanatili ng paglaki ng itlog sa panahon ng impeksyon ng Plasmodium, na tinitiyak ang kalusugan ng mga nahawaang babae. Ang 20E na nagmula sa babae ay hindi nagdudulot ng sekswal na... tugon, ngunit nagpapahintulot sa mga indibidwal na nagpapares na mangitlog pagkatapos mapigilan ang mga 20E-inhibiting kinase. Ang pagtukoy sa male-specific insect steroid hormone na ito at ang papel nito sa pag-regulate ng sexual receptivity ng babae, fertility at interaksyon sa Plasmodium ay nagmumungkahi ng potensyal na mabawasan ang tagumpay sa reproduksyon ng mga lamok na naghahatid ng malaria.
Tumataas muli ang mga kaso at pagkamatay ng malarya4 dahil sa malawakang resistensya ng mga lamok na Anopheles sa insecticide, ang tanging tagapagdala ng mga parasito ng malaria sa tao. Ang biyolohiya ng pagsasama ng mga lamok na ito ay isang partikular na kaakit-akit na target para sa mga nobelang interbensyon sa pagkontrol ng malaria dahil ang mga babae ay minsan lamang mag-asawa5; ang paggawa ng single mating event na ito na sterile ay magkakaroon ng malaking potensyal na mabawasan ang populasyon ng lamok sa bukid.
Ang mga babae ay nagiging hindi na kayang makipagtalik matapos makatanggap ng mga high-titer steroid hormones mula sa mga lalaki. Ipinakita ng mga pag-aaral na ang sanhi ng kahirapan sa karagdagang pag-aasawa ay ang 20-hydroxyecdysone (20E), isang steroid hormone na mas kilala bilang regulator ng molting cycle sa larval stage. Ang kakayahan ng mga lalaki na mag-synthesize at maglipat ng 20E ay partikular na umunlad sa mga species ng Anopheles na bahagi ng subgenus Cellia7, na ipinamamahagi sa Africa at kinabibilangan ng mga pinaka-mapanganib na vector ng malaria, kabilang ang Anopheles gambiae. Ito ay lalong kapansin-pansin dahil sa mga species na ito, ang mga babae ay gumagawa rin ng 20E pagkatapos ng bawat pagkain ng dugo, at ang 20E ang nagtutulak sa oogenesis cycle (tingnan ang ref. 8). Gayunpaman, kakaunti ang nalalaman tungkol sa paraan kung paano isinasama ng mga babae ang mga signal mula sa dalawang magkaibang pinagmumulan ng ecdysone (male transfer at blood feeding induction) nang hindi isinasakripisyo ang kanilang sariling kakayahang mag-asawa. Sa katunayan, kung ang 20E na ginawa ng mga babae ay nagpapalitaw ng sexual intolerance, hahantong ito sa pagkabaog sa mga indibidwal na nagpapakain ng birhen, isang napakakaraniwang pag-uugali sa mga lamok na ito5.
Ang isang posibleng paliwanag ay ang mga lalaking A. gambiae ay naglilipat ng isang binagong male-specific ecdysone, na nagpapagana ng signaling cascade sa reproductive tract ng babae, na nagreresulta sa mating instability. Gayunpaman, bagama't ang mga vertebrate ay may maraming steroid hormones, tulad ng estrogen at androgen (sinuri sa ref. 9), sa aming kaalaman, ang mga androgenic-biased steroid ay hindi pa natutukoy sa mga insekto.
Sinimulan naming tukuyin ang repertoire ng mga steroid hormone sa male male accessory gland (MAG) ng sexually mature na A. gambiae sa paghahanap ng mga posibleng modifying steroid. Gamit ang high performance liquid chromatography na sinamahan ng tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) sa halip na ang hindi gaanong espesipikong pamamaraan na ginamit noon, natukoy namin ang ecdysone (E) at 20E sa tissue na ito, na nagpapatunay sa nakaraang resulta. Gayunpaman, ang sample ay pinangungunahan ng oxidized phosphorylated steroids, na naaayon sa formula na 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Figure 1). Kabilang sa iba pang mga anyo ang 3-dehydro-20E (3D20E) at 20E-22-phosphate (20E22P). Ang HPLC-MS/MS signal intensity ng 3D20E22P ay dalawang order ng magnitude na mas mataas kaysa sa dephosphorylated form nito, ang 3D20E, at tatlong order ng magnitude na mas mataas kaysa sa E at 20E (Figure 1). Bagama't sa iba pang mga bahagi ng katawan at ang ibabang bahagi ng reproduktibo (LRT; Extended Data Fig. 1a). Sinuri rin namin ang mga ecdysteroid sa mga bagong sarado (<1 araw ang edad) na lalaki at babae at natuklasan lamang ang 3D20E at 3D20E22P sa MAG; ang E, 20E at 20E22P ay naroroon sa parehong kasarian (Extended Data Fig. 1b). Ipinahihiwatig ng mga datos na ito na ang mga lalaking nasa hustong gulang na A. gambiae ay gumagawa ng mataas na titer ng mga modifying hormone sa kanilang mga MAG na hindi na-synthesize ng mga babae.
Ang MAG at babaeng LRT (kabilang ang atria, seminal vesicles, at parovarium) ay hiniwalay mula sa mga lalaking birhen na 4-araw na gulang (4-araw na gulang) at mga babaeng birhen at mga babaeng pinag-asawa (0.5, 3, at 12 hpm). Ang Ecdysone sa mga tisyung ito ay sinuri gamit ang HPLC-MS/MS (mean ± sem; unpaired t-test, two-sided, false discovery rate (FDR) corrected; NS, hindi makabuluhan; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: 3 oras vs. 0.5 oras, P = 0.035; 12 oras vs. 3 oras, P = 0.0015; 12 oras vs. 0.5 oras, P = 0.030. 3D20E22P: 3 oras vs. 0.5 oras, P = 0.25; 12 oras vs. 3 oras, P = 0.0032; 12 oras vs. 0.5 oras, P = 0.015). Ang datos ay mula sa tatlong biyolohikal na replika. Ang peak area para sa bawat ecdysone na pinag-aaralan ay kinalkula at na-normalize ng bilang ng mga lamok. Ang Ecdysone ay kinakatawan ng kulay tulad ng sumusunod: E, berde; 20E, kahel; 20E22P, lila; 3D20E, asul; 3D20E22P, rosas. Pinapataas ng inset ang iskala sa y-axis upang ipakita ang mas mababang antas ng ecdysone.
Upang siyasatin kung ang 3D20E22P at 3D20E ay nailipat habang nagsasama, aming pinag-aralan ang mga babaeng LRT sa iba't ibang punto ng panahon pagkatapos ng pagsasama. Bagama't hindi natagpuan ang ecdysone sa mga birhen, naobserbahan namin ang malaking dami ng 3D20E22P sa LRT kaagad pagkatapos ng pagsasama (0.5 oras pagkatapos ng pagsasama, hpm), na bumababa sa paglipas ng panahon, habang ang mga antas ng 3D20E ay tumaas nang malaki (Larawan 1). Gamit ang kemikal na na-synthesize na 3D20E bilang pamantayan, natukoy namin na ang mga antas ng steroid hormone na ito sa mga nagsasama na LRT ay hindi bababa sa 100 beses na mas mataas kaysa sa 20E (Extended Data Table 1). Kaya, ang 3D20E22P ang pangunahing lalaking ecdysone na inililipat sa babaeng LRT habang nagsasama, at ang dephosphorylated na anyo nito, ang 3D20E, ay nagiging napakarami pagkatapos ng pagsasama. Ipinahihiwatig nito ang isang mahalagang papel para sa huling nabanggit na ecdysone sa biology ng babaeng nagsasama pagkatapos ng pagsasama.
Matapos makabuo ng isang bagong RNA sequencing (RNA-seq) dataset (Fig. 2a), gamit ang isang custom-built bioinformatics pipeline, hinanap namin ang ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), at ecdysone encoding 20E-modified phosphatase gene. Ang EPP) ay ipinapahayag sa mga reproductive tissues. Natukoy namin ang isang kandidatong EPP gene at dalawang potensyal na EcK genes (EcK1 at EcK2), ngunit hindi kami nakahanap ng isang mahusay na kandidatong EO gene. Kapansin-pansin, ang mga indibidwal na EPP genes ay ipinapahayag sa mataas na antas (98.9th percentile) sa Gambian MAGs ngunit hindi sa mga babaeng LRT (Fig. 2b), taliwas sa aming inaasahan dahil ang dephosphorylation ng 3D20E22P ay naganap sa babaeng tissue na ito. Samakatuwid, naniniwala kami na ang lalaking EPP ay maaaring mailipat habang nagsasama. Sa katunayan, gumamit kami ng in vivo stable isotope labeling upang itago ang protina ng babae pagkatapos ng pagsasama, isang enzyme na kinilala ng MS sa atrium ng babae (Fig. 2c at Supplementary Table 1). Ang pagkakaroon ng Ang EPP sa MAG at ang pinagsaluhan (ngunit hindi birhen) na babaeng LRT ay nakumpirma rin gamit ang mga partikular na antibody (Larawan 2d).
a, Isang pasadyang binuong bioinformatics pipeline upang maghanap sa mga reproductive tissue ng bawat kasarian para sa mga gene na nagko-code ng EcKs, EOs, at EPPs. Ang mga numero sa tabi ng mga arrow ay nagpapahiwatig ng bilang ng mga kandidatong lalaki at babae sa bawat hakbang. Kinilala ng pagsusuring ito ang isang EPP gene (EPP) at isang EcK gene (EcK1) na ipinapahayag sa mga lalaki, at isang EcK gene (EcK2) na ipinapahayag sa parehong kasarian ngunit hindi nagbubunga ng isang kandidatong EO gene. b, Heatmap na naghahambing sa ekspresyon ng kandidatong gene sa mga tisyu ng Anopheles gambiae na birhen (V) at magkapares (M). Spca, pertilisasyon; MAGs, mga accessory gland sa mga lalaki; iba pang bahagi ng katawan, kabilang ang mga suso, pakpak, binti, matabang katawan, at mga panloob na organo sa parehong kasarian, at mga obaryo sa mga babae. Ang EcK2 ay mataas ang ekspresyon sa parehong MAG at atria ng Gambia, samantalang ang EPP ay matatagpuan lamang sa MAG.c, Proteomic analysis ng male ejaculate group translocation sa female atria sa 3, 12 at 24 hpm, na nagpapakita ng 67 pinakamaraming protina. Ang mga babae ay pinalaki sa diyeta na naglalaman ng 15N upang lagyan ng label (at itago) ang lahat ng protina. Ang mga lalaking walang tag ay ipinares sa mga babaeng may tag, at ang mga babaeng LRT ay pinaghiwa sa 3, 12 at 24 hpm para sa proteomic analysis (tingnan ang Supplementary Table 1 para sa kumpletong listahan ng mga ejaculatory protein). Inset, ang EPP, Eck1 at EcK2 ay nakita sa MAG ng mga birhen na lalaki sa pamamagitan ng proteomic analysis ng mga tisyung ito.d, Ang EPP ay nakita sa pamamagitan ng western blot sa MAG at LRT ng mga babaeng pinag-asawa, ngunit hindi sa mga birhen na babae o lalaki o sa iba pang bahagi ng katawan ng babae. Ang mga lamad ay sabay-sabay na sinuri gamit ang anti-actin (loading control) at anti-EPP antibodies. Lahat ng lalaki ay birhen. Tingnan ang Karagdagang Larawan 1 para sa datos ng pinagmulan ng gel. Ang mga Western blots ay isinagawa nang dalawang beses na may magkatulad na resulta.
Ang aktibidad ng ecdysteroid phosphophosphatase ng EPP ay napatunayan pagkatapos ng incubation gamit ang HPLC-MS/MS kasama ang 3D20E22P na nakahiwalay mula sa MAG (Extended Data Fig. 2a). Bukod pa rito, nang pinatahimik namin ang EPP sa pamamagitan ng RNA-mediated interference (RNAi), nakakita kami ng malakas na pagbawas sa aktibidad ng phosphatase sa mga reproductive tissue ng mga lalaking ito (Fig. 3a), at ang mga babaeng ipinares sa mga lalaking pinatahimik ng EPP ay nagpakita ng makabuluhang mas mababang proporsyon ng dephosphorylated na 3D20E (Fig. 3b) sa kabila ng bahagyang pagtahimik ng gene (Extended Data Fig. 2b,c). Sa kabaligtaran, hindi kami nakakita ng mga makabuluhang pagbabago sa ratio ng 20E22P/20E sa parehong mga lamok, na maaaring magmungkahi na ang enzyme ay tiyak para sa 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Nabawasan ang aktibidad ng phosphatase sa MAG na dulot ng pagpapatahimik ng EPP gamit ang double-stranded EPP RNA (dsEPP) o double-stranded GFP RNA (dsGFP) na mga kontrol. Dalawampung MAG pool ang ginamit sa bawat replicate (P = 0.0046, paired t-test, two-sided), na kinakatawan ng magkakahiwalay na tuldok. b, Ang mga babaeng ipinares sa mga lalaking pinatahimik ng EPP ay may mas mababang proporsyon ng dephosphorylated 3D20E sa 3 hpm (P = 0.0043, unpaired t-test, two-sided), samantalang ang mga antas ng 20E ay hindi naapektuhan (P = 0.063, unpaired). t-test, two-sided). Ang datos ay ipinakita bilang mean ± sem mula sa tatlong pool na may tig-13, 16 at 19 na babae. c, Ang mga babaeng nakipagtalik sa mga lalaking pinatahimik ng EPP ay may mas mataas na antas ng muling pagsasama (P = 0.0002, eksaktong pagsusuri ni Fisher, two-sided). Ang mga babae ay unang pinilit na makipagtalik upang matiyak ang kanilang katayuan sa pagsasama; Pagkalipas ng 2 araw, nakipag-ugnayan sila sa ibang mga lalaking may dalang transgenic sperm upang masuri ang mga rate ng muling pagsasama sa pamamagitan ng quantitative PCR detection ng transgene. Ang mga babaeng pinapakain ng dugo na ipinares sa mga lalaking pinatahimik ng EPP ay nagkaroon ng makabuluhang pagbaba ng fertility (P < 0.0001; Mann-Whitney test, two-sided) at bahagyang pagbaba ng bilang ng itlog (P = 0.088, Mann-Whitney test, two-sided), habang ang spawning rate ay hindi naapektuhan (P = 0.94, Fisher's exact test, two-sided). Sa lahat ng panel, ang n ay kumakatawan sa bilang ng mga biologically independent na sample ng lamok. Ang NS ay hindi makabuluhan.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Susunod, aming tinasa kung ang ecdysone dephosphorylation ay mahalaga para sa pag-udyok ng resistensya sa pagsasama sa mga babae. Kapansin-pansin, ang mga babaeng nakipagtalik sa mga lalaking kulang sa EPP ay muling nakipagtalik sa mas mataas na dalas (44.9%) kaysa sa mga babaeng kontrol (10.4%) kapag nalantad sa mga karagdagang (transgenic) na lalaki (Fig. 3c). Naobserbahan din namin ang isang makabuluhang pagbaba sa fertility (Fig. 3d, kaliwa) at isang bahagyang pagbaba sa bilang ng mga itlog na inilatag ng mga babaeng ito (Fig. 3d, gitna), habang ang porsyento ng mga itlog na inilatag ng mga babae (isa pang tugon na natamo sa mga babae sa pamamagitan ng pagsasama)) ay hindi naapektuhan (Fig. 3d, kanan). Dahil sa naobserbahang specificity ng EPP para sa 3D20E22P, ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang pag-activate ng 3D20E ng EPP na inilipat habang nagsasama ay maaaring may mahalagang papel sa pagpigil sa pagtanggap ng babae sa karagdagang pagsasama, isang pag-uugali na dating iniuugnay sa sekswal na paglilipat ng 20E. Samakatuwid, ang hormone na ito na partikular sa lalaki ay malakas ding nakakaapekto sa fertility ng babae.
Susunod, inihambing namin ang mga aktibidad ng 20E at 3D20E sa mga eksperimento sa iniksyon sa mga birhen na nasa hustong gulang na sa sekswal gamit ang chemically synthesized na 3D20E (Fig. 4a–c) at komersyal na makukuhang 20E. Naobserbahan namin na ang 3D20E ay mas epektibo kaysa sa 20E sa pagpigil sa sensitivity ng babae sa pag-aasawa sa parehong konsentrasyon (Fig. 4d). Kapansin-pansin, kalahati ng antas ng pisyolohikal ng 3D20E sa LRT (1,066 pg post-injection vs. 2,022 pg post-mating) ay nag-udyok ng isang proporsyon ng mga babaeng matigas ang ulo na 20-tiklop na mas mataas kaysa sa antas ng pisyolohikal ng 20E (361 pg post-injection) 24 oras pagkatapos ng iniksyon sa pinakamataas na konsentrasyon na 18 pg post-mating; Pinalawak na Talahanayan ng Datos 1). Ang resultang ito ay naaayon sa paniwala na ang sekswal na paglilipat ng 20E ay hindi nagdudulot ng mga panahon ng hindi matatag na pagsasama, at higit pang itinuturo ang 3D20E bilang isang pangunahing salik sa pagtiyak ng relasyon ng magulang at anak. Ang 3D20E ay mas aktibo rin nang malaki kaysa sa 20E sa mga egg-laying assay sa mga birhen na babae (Larawan 4e), na nagmumungkahi na ang normal na rate ng pangingitlog na aming naobserbahan pagkatapos ng bahagyang pagpapatahimik ng EPP ay dahil sa pagkakaroon ng natitirang aktibidad ng 3D20E na nalilikha pa rin ng mga salik na dulot ng pagsasama.
(a,b) 3D20E na kemikal na na-synthesize mula sa 20E (a) na may napakataas na conversion/efficiency (datos na ipinakita bilang mean ± sem mula sa tatlong independiyenteng reaksyon ng synthesis) (b).c, Ang mass spectrum (ibabang kalahati) ay eksaktong tumutugma sa ecdysone na natagpuan sa pinag-asawang babaeng LRT (itaas na kalahati).d, Kung ikukumpara sa 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Fisher's exact test, two-sided) at 10% ethanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Fisher's exact test, 2-sided), habang ang 20E ay mas mataas nang malaki kaysa sa kontrol lamang sa mas mataas na dosis (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Fisher's exact test, 2-sided).e, Ang iniksyon ng 3D20E ay nagdulot ng mas mataas na antas ng pangingitlog sa mga babaeng birhen kumpara sa 10% na kontrol ng ethanol (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; eksaktong pagsusuri ni Fisher, dalawang panig), habang ang 20E kumpara sa mga kontrol ay sa mas mataas na dosis lamang (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; eksaktong pagsusuri ni Fisher, dalawang panig). Ang 3D20E ay nagdulot ng mas mataas na antas ng pangingitlog kaysa sa 20E sa mas mataas na dosis (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; eksaktong pagsusuri ni Fisher, dalawang panig). Sa lahat ng panel, ang n ay kumakatawan sa bilang ng mga sample ng lamok na biyolohikal na independiyente. Ang NS, hindi makabuluhan.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Ang datos ay mula sa tatlong replika.
Sa mga nakaraang pag-aaral, natukoy namin na ang sekswal na paglilipat ng mga steroid hormone ay nagdudulot ng ekspresyon ng MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), isang babaeng reproductive gene na nagpoprotekta sa mga babaeng A. gambiae mula sa impeksyon ng P. falciparum. Mga gastos sa kalusugan na dulot ng 13, ang pinakamalalang parasito ng malaria sa tao. Dahil sa kahalagahan ng MISO sa reproductive fitness ng Anopheles sa mga lugar na endemic ng malaria, napagpasyahan naming tukuyin kung aling hormone ang 3D20E o 20E ang nagti-trigger ng ekspresyon ng gene na ito. Natuklasan namin na habang ang 20E injection ay partikular o mas malakas na nag-induce ng ilang nuclear hormone receptors (HR), tulad ng HR3 at HR4, at mga tipikal na downstream steroid target, tulad ng mga yolkogenic gene na Vg14, 15, 16, ang MISO ay mas malakas na na-induce ng 3D20E (Extended Data Fig. 3). Kaya, ang sekswal na paglilipat ng androgenic steroid hormone na ito ay tila nagdudulot ng mga mekanismo na nagpoprotekta sa mga babae mula sa mga gastos na dulot ng impeksyon ng parasito. Bukod dito, ang 3D20E ay may magkakaibang epekto sa parehong isoform ng Ang E receptor na EcR, na nagdudulot ng EcR-A at pumipigil sa EcR-B, at mas malakas na nagti-trigger sa iba pang mga gene na nagdudulot ng pagsasama, kabilang ang HPX15, na nakakaapekto sa fertility ng babae. Ito ay maaaring magpaliwanag sa makabuluhang kawalan ng kakayahang ma-obserbahan sa mga babaeng nakipagtalik sa mga lalaking pinatahimik ng EPP (Extended Data Fig. 3). Ang mga datos na ito ay nagmumungkahi ng pagkakaroon ng mga downstream pathway na mas pinipiling na-activate ng dalawang ecdysone hormones na maaaring nasa ilalim ng sex-specific function.
Susunod, sinubukan namin ang tungkulin ng dalawang gene na EcK na natukoy sa aming bioinformatics pipeline. Ang pagpapatahimik sa EcK1 o EcK2 ay nagresulta sa malaking mortalidad sa mga lalaki (Extended Data Fig. 4a), na nagmumungkahi na ang ecdysone phosphorylation, at sa gayon ay inactivation, ay mahalaga para sa kaligtasan. Dahil ang EcK2 ay naipahayag sa mas mataas na antas kaysa sa EcK1 at natukoy sa MAGs sa pamamagitan ng proteomics (Fig. 2b,c at Supplementary Table 2), napatunayan namin ang aktibidad ng ecdysteroid kinase nito sa pamamagitan ng pag-incubate nito gamit ang 20E, na nagresulta sa phosphorylation 20E22P (Extended Data Figure 2).4b). Nang gamitin ang 3D20E bilang substrate, hindi namin natukoy ang phosphorylated product na 3D20E22P (Extended Data Fig. 4c), na nagmumungkahi na ang 20E sa halip na 3D20E ay maaaring ang ginustong target ng EcK2.
Ayon sa aming RNA-seq analysis, ang EcK2 ay mataas din ang ekspresyon sa LRT ng mga birheng babae, kung saan ito ay pinapatay pagkatapos mag-asawa (Fig. 2b). Kinumpirma namin ang mga datos na ito at natukoy na ang ekspresyon ng EcK2 ay hindi naapektuhan ng pagpapakain ng dugo (Extended Data Fig. 5a). Sa pagpapalawig ng aming mga unang eksperimento sa MS, natukoy namin na ang peak ng 20E22P ay malapit na nauugnay sa peak ng 20E (22-26 oras pagkatapos kumain ng dugo; Extended Data Fig. 5b). Ang pagpapatahimik ng EcK2 sa mga birheng babae ay nagresulta sa 3-tiklop na pagtaas sa relatibong ratio ng 20E sa 20E22P 26 oras pagkatapos kumain ng dugo (Extended Data Figures 2c at 5c), na nagpapatunay na ang EcK2 ay nagpo-phosphorylate din ng 20E sa mga babae. Kapansin-pansin, ang mga birheng naubos ang EcK2 ay nagpapanatili ng buong sekswal na pagtanggap (Extended Data Fig. 5d,e), na lalong nagmumungkahi na ang produksyon ng 20E ng babae ay hindi nagdudulot ng mga panahon ng matigas na pakikipagtalik. Gayunpaman, ang mga babaeng ito ay nagkaroon ng makabuluhang pagtaas sa mga rate ng pangingitlog kumpara sa mga kontrol, kung saan mahigit 30% ng mga birhen ang nangingitlog (Extended Data Fig. 5f). Kung ang mga double-stranded Eck2 RNA (dsEcK2) injection ay isinagawa pagkatapos ng pagpapakain ng dugo, hindi naganap ang pangingitlog, kung saan ang 20E peak dahil sa paglunok ng dugo ay bumaba. Sa pangkalahatan, sinusuportahan ng mga resultang ito ang isang modelo na ang 20E na ginawa pagkatapos ng pagsipsip ng dugo ay maaaring mag-udyok ng pangingitlog, ngunit kapag ang spawning block (EcK2 at posibleng iba pang mga salik) ay pinatay ng pagsasama. Hindi pinigilan ng mga iniksyon ng 20E o 3D20E ang ekspresyon ng EcK2 sa mga birhen (Extended Data Fig. 5g), na nagmumungkahi na ang ibang mga salik ay namamagitan sa pagsugpo sa kinase na ito. Gayunpaman, ang mga antas ng 20E pagkatapos ng pagpapakain ng dugo ay hindi sapat upang magdulot ng discomfort sa pagsasama, ngunit epektibong na-trigger ng mataas na titer ng sexually transferred 3D20E.
Ang aming mga resulta ay nagbibigay ng mahahalagang pananaw sa mga mekanismong kumokontrol sa tagumpay ng reproduksyon ng A. gambiae. Isang modelo ang lumitaw kung saan ang mga lalaki ay umunlad upang mag-synthesize ng mataas na titer ng 3D20E, isang male-specific modified ecdysone na nagsisiguro ng pagiging magulang sa pamamagitan ng pagpapagaan ng sensitibidad ng mga babae sa karagdagang pagsasama. Kasabay nito, ang mga malaria vector na ito ay nakabuo rin ng isang mahusay na sistema upang i-activate ang 3D20E sa mga babae bilang tugon sa sekswal na paglilipat ng male-specific EPP. Sa aming kaalaman, ito ang unang halimbawa ng isang sistema ng steroid hormone na pinangungunahan ng lalaki at babae na gumaganap ng isang kakaiba at kritikal na tungkulin sa mga insekto. Ang male-specific ecdysone function ay nai-postulate ngunit hindi pa tiyak na naipakita. Halimbawa, ang isang malaking pinabulaanan na hypothesis 18 ay ang mga tungkuling ito ay maaaring isagawa ng 20E precursor na E1. Kilalang-kilala na sa Drosophila, ang monandry ay na-trigger ng sekswal na paglilipat ng maliliit na sex peptides 19,20 na nakikipag-ugnayan sa mga neuron na nagpapagana sa reproductive tract ng babae sa pamamagitan ng mga partikular na sex peptide receptor 21,22. Kinakailangan ang karagdagang pag-aaral upang matukoy ang downstream signaling. mga kaskad na kontrolado ng 3D20E sa mga babaeng A. gambiae at upang matukoy kung ang mga kaskad na ito ay maaaring mapanatili sa pagitan ng mga lamok at Drosophila.
Dahil sa mahalagang papel ng 3D20E sa pertilidad at pag-uugali ng kababaihan na natukoy sa aming pag-aaral, ang mga landas na humahantong sa sintesis at pag-activate ng 3D20E ay nag-aalok ng mga bagong pagkakataon para sa mga estratehiya sa pagkontrol ng lamok sa hinaharap, tulad ng pagbuo ng mga mapagkumpitensyang baog na lalaki sa mga estratehiya sa teknolohiya ng baog na insekto. Gamitin para sa ligaw na pagpapakawala o upang gayahin ang 3D20E sa birhen na paglalaro. Ang tungkulin ng 3D20E na partikular sa lalaki ay maaaring umunlad nang ang A. gambiae at iba pang mga species ng Cellia ay nagkaroon ng kakayahang palakihin ang kanilang semilya sa mga mating plug, dahil pinapayagan nito ang mahusay na paglipat ng maraming bilang ng mga hormone at mga enzyme na nagpapagana ng hormone. Kaugnay nito, ang ebolusyon ng 3D20E na nagpapatupad ng monandry ay nagbibigay ng mekanismo para sa mga babae (sa pamamagitan ng mataas na pagpapahayag ng MISO) upang mapaboran ang kanilang reproductive fitness sa mga lugar na may mataas na prevalence ng malaria, na hindi direktang nakakatulong sa pagkalat ng Plasmodium. Dahil ang babaeng 20E ay ipinakita na may malalim na epekto sa kaligtasan at paglaki ng P. falciparum sa mga babaeng lamok na Anopheles,24 ang parehong mga pathway ng steroid hormone ng lalaki at babae ay mga pangunahing aspeto na ngayon ng mga interaksyon ng lamok-parasito.
Ang mga strain ng A. gambiae G3 ay pinalaki sa ilalim ng karaniwang mga kondisyon ng insekto (26-28 °C, 65-80% relatibong halumigmig, 12:12 oras na liwanag/madilim na photoperiod). Ang mga larvae ay pinakain ng pulbos na pagkain ng isda (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets at Tetra Pond Sticks sa ratio na 7:7:2). Ang mga adultong lamok ay pinakain nang ad libitum ng 10% dextrose solution at lingguhang dugo ng tao (pag-aaralan ang mga bahagi ng dugo). Ang mga birhen na lamok ay nakuha sa pamamagitan ng paghihiwalay ng mga kasarian sa yugto ng pupa pagkatapos suriin ang mga dulo gamit ang mikroskopya. Ang mga lalaking may dalang DsRed transgene ay nailarawan na noon.
Isinagawa ang mga eksperimento sa sapilitang pagpapares ayon sa mga naunang inilarawang protokol. Para sa natural na pagpapares, ang mga babaeng birhen na 4 na araw ang edad ay pinanatili sa 1:3 na ratio sa mga lalaking birhen na may sapat na gulang sa loob ng dalawang gabi. Para sa mga eksperimento kung saan ang mga lalaki ay tinurukan ng dsEPP, ang co-caging ay kasabay ng ika-3-4 na araw pagkatapos ng iniksyon, kung kailan ang aktibidad ng phosphatase ay lubos na natahimik (Extended Data Fig. 2b).
Ang mga tisyu ng lamok, natitirang mga bangkay (iba pang bahagi ng katawan), o buong katawan ay pinaghiwa-hiwalay upang maging 100% methanol at hinalo gamit ang isang beader (2 mm glass beads, 2,400 rpm, 90 segundo). Ang dami ng tisyu at dami ng methanol ay ang mga sumusunod: iba pang bahagi ng katawan, 50 sa 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; babaeng LRT, 25–50 80 µl. Ang namuong precipitate ay isinailalim sa pangalawang methanol extraction na may parehong dami ng methanol. Ang mga labi ng selula ay inalis sa pamamagitan ng centrifugation. Ang methanol mula sa parehong extraction ay pinagsama at pinatuyo sa ilalim ng daloy ng nitrogen, pagkatapos ay muling isinalin sa mga sumusunod na dami ng 80% methanol sa tubig: iba pang bahagi ng katawan, 50 µl; MAG at babaeng LRT, 30 µl.
Ang mga sample ay sinuri sa isang mass spectrometer (ID-X, Thermo Fisher) na nakakabit sa isang instrumento ng LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl ng sample ang itinurok sa isang 3 µm, 100 × 4.6 mm na column (Inspire C8, Dikma) na pinanatili sa 25 °C. Ang mga mobile phase para sa LC ay A (tubig, 0.1% formic acid) at B (acetonitrile, 0.1% formic acid). Ang LC gradient ay ang mga sumusunod: 5% B sa loob ng 1 minuto, pagkatapos ay dinagdagan sa 100% B sa loob ng 11 minuto. Pagkatapos ng 8 minuto sa 100%, muling i-equilibrate ang column sa 5% B sa loob ng 4 na minuto. Ang flow rate ay 0.3 ml min-1. Ang ionization sa MS source ay nagagawa sa pamamagitan ng pinainit na electrospray ionization sa positibo at negatibong mga mode.
Sinusukat ng mass spectrometer ang datos sa hanay ng m/z mula 350 hanggang 680 sa resolusyong 60,000 sa buong MS mode. Nakuha ang datos ng MS/MS sa [M + H]+ (lahat ng target), [M - H2O + H]+ (lahat ng target), at [M - H]- (mga target na may phosphorylation). Ginamit ang datos ng MS/MS upang kumpirmahin ang mga katangian ng ecdysone ng mga target na walang magagamit na pamantayan. Upang matukoy ang mga hindi naka-target na ecdysteroid, sinuri ang datos ng MS/MS para sa lahat ng HPLC peak na may >15% relatibong kasaganaan. I-quantify gamit ang mga standard curve na nilikha mula sa mga purong pamantayan (20E, 3D20E) upang kalkulahin ang mga absolute na dami o dilution ng isang partikular na sample (lahat ng iba pang target) upang kalkulahin ang kanilang katumbas sa mga dami na natagpuan sa isang lalaki. Para sa 3D20E, isinagawa ang quantification gamit ang kabuuan ng mga sumusunod na adduct: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Ang mga datos ay kinuha at binilang gamit ang Tracefinder (bersyon 4.1). Ang mga datos ng MS/MS ay sinuri gamit ang Xcalibur (bersyon 4.4). Ang mga MS spectra ng E, 20E at 3D20E ay inihambing sa kani-kanilang mga pamantayan. Ang 3D20E22P ay sinuri sa pamamagitan ng derivatization gamit ang reagent ni Girard. Ang 20E22P ay sinuri sa pamamagitan ng m/z ratio.
Ang 3D20E22P ay pinadalisay mula sa MAG. Ang paglilinis ay isinagawa sa isang analytical scale gamit ang isang ultra-performance liquid chromatograph (Acquity, Waters) na may quadrupole mass-based detector (QDa, Acquity, Waters) sa ilalim ng parehong mga kondisyon ng LC gaya ng HPLC-MS/MS analysis. Ang fraction collection ay na-trigger nang ang m/z na katumbas ng 3D20E22P ay natukoy sa parehong oras ng pagpapanatili gaya ng naunang natukoy. Ang kadalisayan ng mga nakuha na compound ay sinuri sa pamamagitan ng HPLC-MS/MS gaya ng inilarawan sa itaas.
Ang kabuuang RNA ay kinuha mula sa 10-12 reproductive tissues o iba pang bahagi ng katawan (walang ulo) gamit ang TRI reagent (Thermo Fisher) kasunod ng mga tagubilin ng gumawa. Ang RNA ay ginamot gamit ang TURBO DNase (Thermo Fisher). Ang cDNA ay na-synthesize gamit ang Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) kasunod ng mga tagubilin ng gumawa. Ang mga primer para sa reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR; Extended Data Table 2) ay nailathala na noon24 o dinisenyo gamit ang Primer-BLAST26, na may kagustuhang ibigay sa mga produktong may laki na 70-150 bp at sumasaklaw sa exon-exon junctions o Primer pair primers na magkahiwalay na exons. Ang mga sample ng cDNA mula sa tatlo hanggang apat na biological replicates ay diluted nang apat na beses sa tubig para sa RT-qPCR. Ang quantification ay isinagawa sa 15 µl replicate replicate replicate na naglalaman ng 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), mga primer, at 5 µl ng diluted cDNA. Ang mga reaksyon ay isinagawa sa isang QuantStudio 6 Pro. Ang real-time PCR system (Thermo Fisher) at ang datos ay kinolekta at sinuri gamit ang Design and Analysis (bersyon 2.4.3). Gaya ng ipinakita sa pag-aaral na ito, ang mga relatibong dami ay na-normalize sa ribosomal gene na RpL19 (AGAP004422), na ang ekspresyon ay hindi nagbago nang malaki sa pagpapakain ng dugo 27 o pagsasama 3.
Ang kalidad ng RNA ay sinuri gamit ang isang Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Ang mga Illumina paired-end library ay inihanda at pinatakbo sa Broad Institute ng MIT at Harvard. Ang mga sequencing read ay inihanay sa A. gambiae genome (PEST strain, bersyon 4.12) gamit ang HISAT2 (bersyon 2.0.5) na may mga default na parameter. Ang mga read na may mapping quality (MAPQ) score na <30 ay inalis gamit ang Samtools (bersyon 1.3.1). Ang bilang ng mga read na na-map sa mga gene ay binilang gamit ang htseq-count (bersyon 0.9.1) na may mga default na parameter. Ang mga normalized read count ay kinalkula at ang differential gene expression ay sinuri gamit ang DESeq2 package (bersyon 1.28.1) sa R ​​(bersyon 4.0.3).
Ang mga kandidatong gene na nagpapabago ng Ecdysone ay natukoy sa pamamagitan ng unang paghahanap sa genome ng A. gambiae gamit ang PSI-BLAST algorithm (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), gamit ang mga default na halaga na Parameter na may mga sumusunod na query protein sequence: mula sa Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 at XP_011294434.1) at Microplitis demolitor (Accession No. XP_008552646.1 at XP_008552645.1) EcK mula sa B. mori (Accession No. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202), Apis mellifera (Accession No. XP_394838) at Acyrthosiphon pisum (Accession No. XP_001947166); at EPP mula sa B. mori (Accession No. XP_001947166) NP_001177919.1 at NP_001243996.1) at EO ng D. melanogaster (Accession No. NP_572986.1) (hakbang 1). Susunod, sinasala ang mga hit batay sa mataas na ekspresyon ng mRNA (>100 fragments/kilobase exons per million mapped reads (FPKM) o >85%) sa reproductive tissue (female LRT o MAG) sa Gambia (hakbang 2). Upang mapabuti ang ispesipisidad, pumili kami ng mga kandidatong enzyme na ipinapahayag din sa reproductive tissue ng A. albimanus, isang uri ng anopheles na hindi nag-synthesize o naglilipat ng ecdysone habang nagsasama. Ang mga kandidatong gene ay sinala batay sa mababang ekspresyon (<100 FPKM o <85th percentile) sa reproductive tissue ng A. albimanus (hakbang 3). Bilang pangwakas na pansala (hakbang 4), ang mga kandidatong gene ay kailangang matugunan ang kahit isa sa mga sumusunod: (1) makabuluhang tumaas ang regulasyon pagkatapos ng pagsasama (P < 0.05) ayon sa pagsusuri ng mga gene na may magkakaibang pagpapahayag at (2) sa mga hindi reproductive tissue (< 85% o <100 FPKM).
Binago namin ang mga naunang inilarawang pamamaraan 28, 29, 30 upang makamit ang whole-organism isotopic labeling. Sa madaling salita, ang wild-type Saccharomyces cerevisiae type II (YSC2, Sigma) ay sinubukan sa yeast nitrogen base (BD Difco, DF0335) na naglalaman ng (wt/vol) 2% glucose (G7528, Sigma), 1.7% amino acid-free at ammonium sulfate (culture medium) at 5% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) bilang tanging pinagmumulan ng nitrogen. Ang yeast ay nakuha sa pamamagitan ng centrifugation at ang larvae ng lamok ay pinakain nang ad libitum hanggang sa pupation. Dinagdagan ng fishmeal (0.5 mg bawat 300 larvae) upang maiwasan ang mortalidad sa ikaapat na instar. Tanging ang mga babae lamang ang ginamit sa mga eksperimento sa pagsasama sa mga lalaking walang label upang suriin ang lalaking proteome na inilipat habang nagsasama.
Ang mga babaeng birhen na may edad na 4-6 na araw at may 15N-tagged na may tatak ay napilitang magtalik sa mga lalaking birhen na kapareho ng edad at walang tatak. Ang matagumpay na pagsasama ay napatunayan sa pamamagitan ng pagtukoy sa mga plug ng pagsasama sa ilalim ng epifluorescence microscopy. Sa 3, 12, at 24 hpm, ang atria ng 45-55 babaeng nagsama ay hinati sa 50 µl ng ammonium bicarbonate buffer (pH 7.8) at hinalo gamit ang isang pestle. Ang homogenate ay sinentrifuga at ang supernatant ay hinaluan ng 50 µl ng 0.1% RapiGest (186001860, Waters) sa 50 mM ammonium bicarbonate. Ang supernatant at pellet mula sa bawat sample ay ini-snap frozen sa dry ice at ipinadala magdamag sa laboratoryo ng MacCoss sa University of Washington, kung saan nakumpleto ang paghahanda ng sample para sa LC-MS/MS. I-resuspend muli ang pellet sa 50 µl ng 0.1% RapiGest sa 50 mM ammonium bicarbonate at I-sonicate sa isang paliguan ng tubig. Ang konsentrasyon ng protina ng pellet at supernatant ay sinukat gamit ang BCA assay, ang mga sample ay binawasan gamit ang 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), nilagyan ng alkylation ng 15 mM iodoacetamide (Sigma) at in-incubate sa 37 °C (1:0 50) sa loob ng 1 oras na may trypsinization: trypsin:substrate ratio). Ang RapiGest ay ni-lyse sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 200 mM HCl, na sinundan ng incubation sa 37 °C sa loob ng 45 minuto at centrifugation sa 14,000 rpm sa loob ng 10 minuto sa 4 °C upang maalis ang mga debris. Ang mga sample ay hinugasan sa pamamagitan ng dual-mode solid-phase extraction (Oasis MCX cartridges, Waters) at muling isinalin sa 0.1% formic acid para sa pangwakas na konsentrasyon ng protina na 0.33 µg µl-1. Ang mga walang label na MAG proteome ay sinuri nang katulad mula sa mga birhen na lalaki. Dalawang analytical replicates ang sinuri para sa bawat isa. sample. Susunod, 1 µg ng bawat isa ay sinuri gamit ang isang 25-cm fused silica 75-μm column na may 4-cm fused silica Kasil1 (PQ) frit trap na puno ng Jupiter C12 reversed-phase resin (Phenomenex) at 180-minute liquid chromatography. Mga Sample Digest – Ang MS/MS ay pinatakbo sa isang Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) na may nanoACQUITY UPLC System (Waters). Ang data acquisition na may kaugnayan sa datos na nabuo para sa bawat pagtakbo ay na-convert sa mzML format gamit ang Proteowizard (bersyon 3.0.20287) at gamit ang Comet31 (bersyon 3.2) laban sa FASTA database na naglalaman ng mga protein sequence mula sa Anopheles gambiae (VectorBase bersyon 54), Anopheles coluzzi. Isang paghahanap ang isinagawa sa Mali-NIH (VectorBase bersyon 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Marso 2021), A. gambiae RNA-seq, at mga three-frame translation ng mga kilalang human contaminant. Ang mga peptide map-matched FDR ay natukoy gamit ang Percolator32 (bersyon 3.05) na may threshold na 0.01, at ang mga peptide ay pinagsama-sama sa mga protein identification gamit ang protein parsimony sa Limelight33 (bersyon 2.2.0). Tinantya ang relatibong kasaganaan ng protina gamit ang normalized spectral abundance factor (NSAF) na kinalkula para sa bawat protina sa bawat pagtakbo gaya ng naunang inilarawan. Ang NSAF na may kaugnayan sa bawat protina ay na-average sa mga sample mula sa dalawang magkaibang biological replicates. Matagumpay na natakpan ng 15N labeling ang babaeng proteome, bagama't isang maliit na halaga ng walang label na protina ang maaaring matukoy mula sa mga may label na virgin. Naitala namin ang pagtuklas ng pagbawas ng protina ng lalaki (1-5 spectra) sa mga hilaw na sample ng babae sa mga teknikal na pagtakbo lamang, kung saan ang mga hilaw na sample ay pinatakbo pagkatapos ng mga sample ng lalaki/magkapareha, bilang resulta ng "carry over" ng HPLC. Paminsan-minsang natagpuang 'mga kontaminante' mula sa mga may label na virgin ay nakalista sa Supplementary Table 1.
Dalawang antigenic peptide, ang QTTDRVAPAPDQQQ (sa loob ng isotype PA) at MESDGTTPSGDSEQ (sa loob ng isotype PA at PB) sa Genscript. Ang dalawang peptide ay pinagsama, pagkatapos ay ikinabit sa carrier protein na KLH at itinurok sa mga kuneho sa New Zealand. Ang mga kuneho ay isinakripisyo pagkatapos ng ikaapat na iniksyon, at ang kabuuang IgG ay inihiwalay sa pamamagitan ng affinity purification. Ang IgG mula sa kunehong pinaka-espesipiko sa EPP ay ginamit para sa karagdagang western blotting.
Para sa mga western blots, ang MAG (n = 10, kung saan ang n ay kumakatawan sa bilang ng mga biologically independent na sample ng lamok) at babaeng LRT (n = 30) mula sa 4-araw na gulang na birhen na lalaki at birhen o force-mated na babae (<10 post-mating), Protein extraction buffer (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× protease inhibitor cocktail (Roche)) ay idinagdag nang hiwalay. Ang mga sample ay agad na hinalo pagkatapos ng dissection gamit ang isang beader (2 mm glass beads, 2,400 rpm, 90 seg). Ang mga hindi natutunaw na debris ay inalis sa pamamagitan ng centrifugation sa 20,000 g sa 4 °C. Ang mga protina ay binilang gamit ang Bradford assay (Bio-Rad). Pagkatapos, 20 µg ng MAG protein, 40 µg ng LRT protein, at 20 µg ng residual bulk protein ay kinuha. dine-denatured at pinaghiwalay ng 10% Bis-Tris NuPAGE gamit ang MOPS buffer. Ang mga protina ay inilipat sa mga polyvinylidene fluoride membrane gamit ang iBlot2 transfer system (Thermo Fisher). Ang mga lamad ay hinugasan nang dalawang beses sa 1× PBS-T (0.1% Tween-20 sa PBS) at pagkatapos ay hinarangan sa Odyssey blocking buffer (Li-Cor) sa loob ng 1 oras sa 22°C. Ang mga lamad ay inalog magdamag sa 4°C gamit ang custom rabbit anti-EPP polyclonal primary antibody (1:700 sa blocking buffer) at rat anti-actin monoclonal primary antibody MAC237 (Abeam; 1:4,000). Ang mga lamad ay hinugasan gamit ang PBS-T at pagkatapos ay in-incubate kasama ng mga secondary antibodies (donkey anti-rabbit 800CW at goat anti-rat 680LT (Li-Cor), parehong 1:20,000) sa blocking buffer na naglalaman ng 0.01% SDS at 0.2% Tween-20 sa loob ng 1 oras sa 22 °C. Ang mga lamad ay hinugasan gamit ang PBS-T at kinunan ng imahe gamit ang isang Odyssey CLx scanner. Ang mga imahe ay kinolekta at pinoproseso sa Image Studio (bersyon 5.2). Walang nakitang partikular na banda na tumutugma sa EPP-RA isoform (82 kDa).
Ang mga rehiyon ng pagkokodigo ng EPP (bilang isoform na AGAP002463-RB na naglalaman ng histidine phosphatase domain, NCBI conserved domain search 34) at EcK2 (AGAP002181) ay na-clone sa pET-21a(+) plasmid (Novagen Millipore Sigma); Ang mga primer ay nakalista sa Extended Data Table 2. Walong GS4 linker (nang magkakasama) ang ipinasok bago ang C-terminal 6xHis tag ng pET-21a(+)-EcK2 construct. Ang mga recombinant na protina ay ginawa gamit ang NEBExpress cell-free E. coli protein synthesis reaction (New England BioLabs). Ang mga recombinant na protina ay pinadalisay gamit ang NEBExpress Ni spin columns (New England BioLabs). Ang dihydrofolate reductase (DHFR) control protein ay ginawa gamit ang DNA template mula sa NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Ang mga protina ay nakaimbak sa 50% glycerol sa PBS sa -20 °C nang hanggang 3 buwan.
Ang aktibidad ng phosphatase ng EPP at mga katas ng tisyu ay sinukat gamit ang 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). Ang reaction buffer ay naglalaman ng 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, at 1 mM DTT. Ang tisyu ay hinalo sa reaction buffer at ang mga labi ng selula ay inalis sa pamamagitan ng centrifugation. Simulan ang reaksyon sa pamamagitan ng pagdaragdag ng enzyme o katas ng tisyu sa reaction buffer na naglalaman ng 2.5 mg ml-1 pNPP. Ang pinaghalong reaksyon ay in-incubate sa temperatura ng silid sa dilim, at ang dami ng pNP na na-convert mula sa pNPP ay tinantiya sa pamamagitan ng pagsukat ng absorbance sa 405 nm sa iba't ibang oras.
Para sa in vitro na aktibidad ng EcK, ang protina ay in-incubate gamit ang 0.2 mg 20E o 3D20E sa 200 µl buffer (pH 7.5) na naglalaman ng 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP at 10 mM MgCl2 sa loob ng 2 oras sa 27 °C. Ang reaksyon ay pinahinto sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 800 µl methanol, pagkatapos ay pinalamig sa -20 °C sa loob ng 1 oras, pagkatapos ay sinentrifuga sa 20,000 g sa loob ng 10 minuto sa 4 °C. Ang supernatant ay sinuri gamit ang HPLC-MS/MS. Upang i-heat-inactivate ang mga protina na ginamit sa control group, ang mga protina ay in-incubate sa 50% glycerol sa PBS sa loob ng 20 minuto sa 95°C.
Para sa in vitro na aktibidad ng EPP, ang protina ay in-incubate kasama ng 3D20E22P (katumbas ng dami na matatagpuan sa 18 pares ng MAG, na pinadalisay gamit ang HPLC-MS/MS) sa 100 µl buffer (pH 7.5) na naglalaman ng 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, at 1 mM DTT sa loob ng 3 oras sa 27 °C. Ang reaksyon ay pinahinto sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 400 µl methanol at pinalamig sa -20 °C sa loob ng 1 oras, pagkatapos ay sinentrifuga sa 20,000 g sa loob ng 10 minuto sa 4 °C. Ang supernatant ay sinuri gamit ang HPLC-MS/MS.
Ang mga fragment ng PCR para sa EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) at EcK2 (556 bp) ay inamplified mula sa cDNA na inihanda mula sa mga bangkay ng lamok na walang ulo na magkahalong kasarian. Ang fragment ng PCR ng eGFP control (495 bp) ay inamplified mula sa naunang inilarawan na pCR2.1-eGFP; Ang mga PCR primer ay nakalista sa Extended Data Table 2. Ang PCR fragment ay ipinasok sa pagitan ng mga inverted T7 promoter sa pL4440 plasmid. Ang mga plasmid construct ay nakuha mula sa NEB 5-α competent E. coli (New England Biolabs) at beripikado sa pamamagitan ng DNA sequencing bago gamitin (tingnan ang Supplementary Data 1 para sa insert sequence). Ang mga primer na naitugma sa T7 promoter (Extended Data Table 2) ay ginamit upang palakasin ang insert mula sa pL4440-based plasmid. Ang laki ng produktong PCR ay kinumpirma sa pamamagitan ng agarose gel electrophoresis. Ang dsRNA ay na-transcribe mula sa mga PCR template gamit ang Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) at pinadalisay ayon sa mga tagubilin ng tagagawa gamit ang mga pagbabagong inilarawan dati.
Para sa iniksyon ng dsRNA, 1,380 ng ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ang itinurok sa konsentrasyon na 10 ng nl-1 sa dibdib ng mga nasa hustong gulang na lalaki o babae (Nanoject III, Drummond) sa loob ng 1 araw pagkatapos ng eclosion. Ang mga antas ng knockdown ng gene ay natukoy sa hindi bababa sa tatlong biological replicates sa pamamagitan ng RNA extraction, cDNA synthesis, at RT-qPCR. Para sa iniksyon ng ecdysone, ang 4-araw na gulang na birhen o 6-araw na gulang na birhen na babaeng pinapakain ng dugo ay itinurok ng 0.13, 0.21, o 0.63 µg ng 20E o 3D20E (Nanoject III, Drummond) sa konsentrasyon na 1.3, 2.1, ayon sa pagkakabanggit, depende sa disenyo ng eksperimento o 6.3 ng nl-1. Mag-iniksyon ng 100 nl ng 10% (vol/vol) na ethanol sa tubig; 100 nl ng 3D20E22P sa 10% ethanol (katumbas ng 75% ng dami na matatagpuan sa isang pares ng MAG). Ang mga lamok ay sapalarang itinalaga sa grupong iniksiyon.
Para sa mga pagsusuri sa pangingitlog, ang mga babaeng 3-araw na gulang ay pinakain nang ad libitum ng dugo ng tao. Alisin ang mga lamok na bahagyang pinakain o hindi pinakain. Depende sa paggamot, ang mga babae ay inilalagay sa magkakahiwalay na tasa ng pangingitlog sa loob ng apat na gabi nang hindi bababa sa 48 oras pagkatapos kumain ng dugo. Ang mga itlog ay binilang sa ilalim ng stereoscope (Stemi 508, Zeiss); para sa mga babaeng nagtalik, ang mga itlog na napisa at naging larva ay itinuturing na fertile.
Para sa mga pagsubok sa pagsasama, ang mga babae ay pinayagan ng hindi bababa sa 2 araw depende sa paggamot upang magkaroon ng resistensya sa pagsasama, at ang mga lalaking wild-type na kapareho ng edad ay ipinakilala sa parehong hawla. Pagkalipas ng dalawang gabi, ang mga babaeng napertilisadong vesicle ay pinaghiwa-hiwalay at ang genomic DNA ay inilabas sa pamamagitan ng freeze-thaw at sonication sa isang buffer na naglalaman ng 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, at 25 mM NaCl (pH 8.2). Ang mga sample ay in-incubate gamit ang Proteinase K (0.86 µg µl-1) sa loob ng 15 minuto sa 55 °C, na sinundan ng 10 minuto sa 95 °C. Ang mga krudong genomic DNA preparations ay diluted nang 10 beses at isinailalim sa qPCR detection ng mga Y chromosome sequence; ang mga primer ay nakalista sa Extended Data Table 2. Ang kawalan ng Y chromosome sequence ay nagpapahiwatig ng kawalan ng pagsasama.
Para sa mga re-mating assay, ang mga babaeng force-mated ay sinuri para sa presensya ng mga mating plug upang kumpirmahin ang katayuan ng pagsasama at binigyan ng 2 araw upang magkaroon ng refractoriness sa pagsasama nang walang mga lalaki, gaya ng naunang inilarawan 36. Ang mga lalaking may dalang DsRed transgenic sperm ay ipinasok sa mga hawla ng babae. Pagkalipas ng dalawang gabi, ang mga fertilizing vesicle ay hiniwalay mula sa mga babae, at ang genomic DNA ay inihanda gaya ng inilarawan sa itaas at isinailalim sa qPCR detection ng DsRed transgene; ang mga primer ay nakalista sa Extended Data Table 2. Ang kawalan ng DsRed transgene ay nagpapahiwatig na walang naganap na re-mating.
Ang 3D20E ay na-synthesize gaya ng naunang inilarawan 37. Sa madaling salita, 10 mg ng 20E (Sigma-Aldrich) ay tinunaw sa 10 ml ng tubig, kasunod ang pagdaragdag ng 30 mg ng platinum black (sa anyong pulbos, Sigma-Aldrich). Isang banayad na daloy ng O2 ang patuloy na pinakulo sa pinaghalong reaksyon, na hinalo sa temperatura ng silid. Pagkatapos ng 6 na oras, 30 mL ng methanol ang idinagdag upang ihinto ang reaksyon. Ang pinaghalong ay isinailalim sa centrifugation upang alisin ang mga particle ng catalyst. Ang supernatant ay pinasingaw hanggang sa matuyo sa vacuum sa temperatura ng silid. Ang pinatuyong produkto ng reaksyon ay tinunaw sa 10% ethanol at methanol para sa iniksyon para sa pagsusuri ng HPLC-MS/MS. Ang conversion rate (mula 20E hanggang 3D20E) ay humigit-kumulang 97% (Fig. 4b), at ang MS spectrum ng na-synthesize na 3D20E ay tumugma sa natagpuan sa mga babaeng pinagsama (Fig. 4c).
Ang legend ay naglalaman ng mga partikular na detalye ng mga isinagawang istatistikal na pagsusuri. Ginamit ang GraphPad (bersyon 9.0) upang isagawa ang eksaktong pagsusuri ni Fisher, Mantel-Cox test, at Student's t-test. Ang mga pagsusuri ni Cochran-Mantel-Haenszel ay isinagawa gamit ang isang pasadyang R script (makukuha sa https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Ang distribusyon ng datos ay sinubukan para sa normalidad gamit ang Shapiro-Wilk test na may significance threshold na 0.05. Nang bumagsak ang datos sa normality test, isinagawa ang Mann-Whitney test. Sinuri ang datos ng survival gamit ang Mantel-Cox test. Ang DESeq2 package (bersyon 1.28.1) ay ginamit upang isagawa ang RNA-seq gene-level differential expression analysis. Ang pahalang na bar sa graph ay kumakatawan sa median. Ang significance value na P = 0.05 ay ginamit bilang threshold para sa lahat ng pagsusuri.
Para sa karagdagang impormasyon tungkol sa disenyo ng pag-aaral, tingnan ang abstrak ng Ulat sa Pananaliksik sa Kalikasan na naka-link sa artikulong ito.
Ang datos ng MS proteomic ay idineposito sa ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) sa pamamagitan ng PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) gamit ang dataset identifier na PXD032157.
Ang RNA-seq dataset ay nakadeposito sa Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sa ilalim ng serial record na GSE198665.
Ang mga karagdagang dataset na nabuo at/o sinuri sa kasalukuyang pag-aaral ay maaaring makuha mula sa mga kaukulang may-akda kapag may makatwirang kahilingan. Ang artikulong ito ay nagbibigay ng pinagmulang datos.
De Loof, A. Ecdysteroids: Mga steroid sa pakikipagtalik ng insekto na hindi pinapansin? Lalaki: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone at pag-unlad ng obaryo sa Anopheles stephens. J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).