Ang pag-uuri ng protina sa secretory pathway ay mahalaga para sa pagpapanatili ng cell compartmentalization at homeostasis. Bukod sa shell-mediated sorting, ang papel ng mga lipid sa kinesin sorting sa proseso ng secretory transport ay isang matagal nang pangunahing tanong na hindi pa nasasagot. Dito, nagsasagawa kami ng 3D simultaneous multicolor high-resolution real-time imaging upang patunayan in vivo na ang mga bagong synthesized glycosylphosphatidylinositol-immobilized protein na may napakahabang ceramide lipid moieties ay pinagsama-sama at inuuri sa mga espesyalisadong endoplasms Net exit site, na naiiba sa ginagamit ng mga transmembrane protein. Bilang karagdagan, ipinapakita namin na ang haba ng chain ng ceramide sa endoplasmic reticulum membrane ay kritikal para sa sorting selectivity na ito. Ang aming pag-aaral ay nagbibigay ng unang direktang in vivo na ebidensya upang uriin ang mga protein cargoes batay sa haba ng lipid chain sa mga selective export site sa secretory pathway.
Sa mga eukaryotic cell, ang mga protina na na-synthesize sa endoplasmic reticulum (ER) ay inaayos habang dinadala sa pamamagitan ng secretory pathway para sa paghahatid sa kanilang naaangkop na cellular destination (1). Bukod sa coat-mediated sorting, matagal nang pinag-iisipan na ang ilang lipid ay maaari ring magsilbing selective exit points sa pamamagitan ng pagkumpol ng mga ito sa mga partikular na membrane domain na may mga partikular na protina (2-5). Gayunpaman, mayroon pa ring kakulangan ng direktang in vivo na ebidensya upang patunayan ang posibleng mekanismong nakabatay sa lipid. Upang malutas ang pangunahing problemang ito, pinag-aralan namin sa yeast kung paano ang glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins (GPI-APs) ay naiibang inilalabas mula sa ER. Ang GPI-APs ay iba't ibang lipid-connected cell surface proteins (6, 7). Ang GPI-AP ay isang secreted protein na nakakabit sa mga panlabas na leaflet ng plasma membrane sa pamamagitan ng glycolipid moiety (GPI anchor). Tinatanggap nila ang GPI anchors bilang mga konserbatibong post-translational modifications sa ER lumen (8). Pagkatapos ng pagkabit, ang GPI-AP ay dumadaan sa Golgi apparatus (5, 9) mula sa ER patungo sa plasma membrane. Ang presensya ng mga GPI anchor ay nagiging sanhi ng pagdadala ng GPI-AP nang hiwalay mula sa mga transmembrane secreted protein (kabilang ang iba pang mga plasma membrane protein) sa kahabaan ng secretory pathway (5, 9, 10). Sa mga yeast cell, ang mga GPI-AP ay pinaghihiwalay mula sa iba pang mga secreted protein sa endoplasmic reticulum, at pagkatapos ay inilalagay sa mga natatanging vesicle na nakabalot sa coat protein complex II (COPII) (6, 7). Hindi malinaw ang mga determinant ng proseso ng pag-uuri na ito sa proseso ng pag-export ng ER, ngunit pinaghihinalaan na ang mekanismong ito ay maaaring mangailangan ng mga lipid, lalo na ang structural remodeling ng lipid portion ng GPI anchor (5, 8). Sa yeast, ang GPI lipid remodeling ay nagsisimula kaagad pagkatapos kumapit ang GPI, at sa maraming kaso, nagiging sanhi ito ng pagbigkis ng ceramide sa 26-carbon long-chain saturated fatty acid (C26:0) (11, 12). Ang C26 ceramide ang pangunahing ceramide na nalilikha ng mga yeast cell sa ngayon. Ito ay na-synthesize sa ER at karamihan nito ay iniluluwas sa Golgi apparatus sa pamamagitan ng mga COPII vesicle (13). Ang ER export ng GPI-AP ay partikular na nangangailangan ng patuloy na ceramide synthesis (14, 15), at kaugnay nito, ang conversion ng ceramide sa inositol phosphate ceramide (IPC) sa Golgi apparatus ay nakasalalay sa GPI anchor synthesis (16). Ipinakita ng mga biophysical na pag-aaral na may mga artipisyal na lamad na ang napakahabang acyl chain ceramide ay maaaring magsama-sama upang bumuo ng mga ordered domain na may natatanging pisikal na katangian (17, 18). Ang mga datos na ito ay humahantong sa hypothesis na ang C26 ceramide at GPI-AP na may C26 ceramide ay gumagamit ng kanilang mga pisikal na katangian upang magsama-sama sa mga maayos na rehiyon o rehiyon sa medyo magulo na kapaligiran ng lipid ng ER membrane. Ito ay pangunahing binubuo ng maikli at unsaturated glycerolipids (C16:1 at C18:1) (19, 20). Ang mga rehiyong ito ay piliing tututukan sa mga partikular na lugar ng paglabas ng ER (ERES), kung saan ang ceramide at ceramide-based na GPI-AP ay maaaring sabay na dalhin sa Golgi sa parehong nakalaang COPII vesicle (5).
Sa pag-aaral na ito, direkta naming sinubukan ang mekanismong ito na nakabatay sa lipid gamit ang super-resolution confocal real-time imaging microscopy (SCLIM), na isang makabagong pamamaraan ng microscopy na maaaring sabay-sabay na obserbahan ang mga protina na may fluorescent label. Ang mga three-color at three-dimensional (3D) na imahe ay may napakataas na resolution at bilis sa mga buhay na selula (21, 22).
Una naming inilapat ang teknolohiyang SCLIM upang higit pang tukuyin kung paano nasuri ang normal na GPI-AP na may C26 ceramide group mula sa mga transmembrane secreted protein pagkatapos umalis sa ER sa S. cerevisiae. Upang masuri ang klasipikasyon ng ER, gumamit kami ng genetic system na direktang makakapaglarawan sa bagong synthesized na kargamento na pumapasok sa ERES in vivo (7, 23). Bilang kargamento, pinili namin ang C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 na may label na green fluorescent protein (GFP) at transmembrane secreted protein Mid2 na may label na near-infrared fluorescent protein (iRFP), na parehong tumatama sa plasma membrane (24–26). Sa sec31-1 temperature-sensitive mutant, ang dalawang kargamento na ito ay ipinapahayag sa ilalim ng galactose-inducible promoter at isang constitutive ERES marker. Sa matinding temperatura (37°C), dahil ang sec31-1 mutation ay nakakaapekto sa tungkulin ng COPII coat component na Sec31 upang pigilan ang pagtubo ng COPII at pag-export ng ER, ang bagong synthesized na kargamento ay naiipon sa ER (23). Pagkatapos lumamig sa mababang temperatura (24°C), ang mga sec31-1 mutant cells ay nakabawi mula sa secretory area, at ang naipon na bagong synthetic cargo ay nagsimulang i-export mula sa ER. Ipinakita ng CLIM visualization na karamihan sa mga bagong na-synthesize na Gas1-GFP at Mid2-iRFP ay naipon pa rin sa ER ng mga sec31-1 mutant cells pagkatapos ng incubation sa 37°C at pagkatapos ay inilabas sa 24°C sa loob ng 5 minuto (Figure 1). Dahil ang Mid2-iRFP ay ipinamamahagi sa buong ER membrane, at ang Gas1-GFP ay concentrated at natipon sa discontinuous ER membrane area, ang kanilang distribusyon ay ganap na naiiba (Figure 1, A hanggang C at Movie S1). Bilang karagdagan, tulad ng ipinapakita sa Figure 1D, ang Gas1-GFP cluster ay walang Mid2-iRFP. Ipinapahiwatig ng mga resultang ito na ang GPI-AP at mga transmembrane protein ay maagang pinaghiwalay sa iba't ibang rehiyon ng ER membrane. Ang kumpol ng Gas1-GFP ay katabi ng isang partikular na ERES na may label na mCherry's COPII coat protein na Sec13 (Larawan 1, E at F, at pelikulang S1) (23).
Ang mga selula ng sec31-1 ay nagpapahayag ng mga sekresyon na dulot ng galactose, isang mahabang acyl chain (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, berde) at ang transmembrane protein na Mid2-iRFP (TMP, asul) at ang Constructive ERES labeling na Sec13-mCherry (ERES, magenta) na ito ay in-incubate sa 37°C sa loob ng 30 minuto, inilipat sa 24°C, at kinuhanan ng imahe ng SCLIM pagkalipas ng 5 minuto. Ang (A hanggang C) ay nagpapakita ng isang kinatawan na pinagsama o nag-iisang 2D na imahe ng isang plane (A), isang 2D projection na imahe ng 10 z-sections (B) o isang 3D na imahe ng cell hemisphere ng cargo at ERES markers (C). Scale bar 1μm (A at B). Ang scale unit ay 0.551μm (C). Ang Gas1-GFP ay natukoy sa magkakahiwalay na rehiyon o kumpol ng ER, habang ang Mid2-iRFP ay natukoy at naipamahagi sa buong ER membrane (C). (D) Ipinapakita ng graph ang relatibong intensidad ng fluorescence ng Gas1-GFP at Mid2-iRFP sa kumpol ng Gas1-GFP sa kahabaan ng puting linya ng palaso (kaliwa). Ang AU, arbitrary unit. Ang (E at F) ay kumakatawan sa 3D na imahe na pinagsasama ang marka ng mga produkto at ERES. Ang mga kumpol ng Gas1-GFP ay natukoy malapit sa partikular na ERES. Ang yunit ng iskala ay 0.551μm. (F) Ang puting solidong palaso ay nagmamarka sa kumpol ng Gas1-GFP na nauugnay sa ERES. Ipinapakita ng mga panel sa gitna at kanang bahagi ang pinagsamang pinalaking 3D na imahe at isang pinaikot na view ng napiling kumpol ng Gas1-GFP.
Ang malapit na spatial na ugnayan sa pagitan ng Gas1-GFP cluster at isang partikular na ERES ay nagpapahiwatig na ang Gas1-GFP ay maaaring pumasok sa pumipiling ERES, na naiiba sa selectivity na ginagamit ng Mid2-iRFP upang umalis sa ER. Upang matugunan ang posibilidad na ito, tinantiya namin ang ERES ratio para lamang sa isa o dalawang produkto (Larawan 2, A hanggang C). Natuklasan namin na karamihan sa ERES (70%) ay naglalaman lamang ng isang uri ng kargamento. Ang larawan sa ibaba ng Larawan 2C ay nagpapakita ng dalawang tipikal na halimbawa ng ERES na may Gas1-GFP lamang (Larawan 1) o Mid2-iRFP lamang (Larawan 2). Sa kabaligtaran, humigit-kumulang 20% ​​ng ERES ay naglalaman ng dalawang kargamento na nagsasapawan sa parehong lugar. Natuklasan na ang ilang ERES (10%) ay naglalaman ng dalawang uri ng kargamento, ngunit ang mga ito ay nakahiwalay sa malinaw na magkakaibang lugar. Samakatuwid, ipinapakita ng statistical analysis na ito na pagkatapos ma-export ang ER, ang GPI-AP Gas1-GFP at ang transmembrane cargo na Mid2-iRFP ay nahahati sa magkakaibang ERES (Larawan 2D). Ang kahusayan sa pag-uuri na ito ay lubos na naaayon sa nakaraang biochemical analysis (6) at morphological determination (7). Maaari rin nating obserbahan ang pag-uugali ng naka-quarantine na kargamento na pumapasok sa ERES (Figure 2E at Movie S2). Ipinapakita ng Figure 2E na maliit na bahagi lamang ng Gas1-GFP (panel 3) o Mid2-iRFP (panel 4) ang pumapasok sa ERES mula sa isang gilid at nakakulong sa isang hiwalay na lugar. Ipinapakita ng Panel 5 ng Figure 2E na ang Gas1-GFP at Mid2-iRFP ay minsan matatagpuan sa parehong ERES, ngunit pumapasok sila mula sa magkakaibang panig at naka-concentrate sa magkakahiwalay na rehiyon na maaaring kumakatawan sa magkakaibang COPII vesicles. Kinumpirma rin namin na ang naobserbahang paghihiwalay at pag-uuri ng C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 bilang selective ERES ay tiyak dahil ang isa pang transmembrane secretion cargo, ang GFP-tagged plasma membrane protein na Axl2 (27), ay nagpapakita ng katulad na pag-uugali sa Mid2-iRFP. (Larawan S1 at Movie S3). Ang bagong na-synthesize na Axl2-GFP ay ipinamamahagi sa pamamagitan ng ER membrane tulad ng Mid2-iRFP (Larawan S1, A at B), at co-localized sa Mid2-iRFP sa karamihan ng ERES (Larawan S1, B hanggang D). Ang mga Panel 1 at 2 ng Larawan 1. S1C ay nagpapakita ng dalawang tipikal na halimbawa ng ERES kung saan ang dalawang transmembrane cargoes ay nagsasapawan. Sa mga kasong ito, ang parehong produkto ay magkasamang pumapasok sa ERES (Larawan S1E, Panel 3 at Pelikula S3).
Ang mga selulang sec31-1 na nagpapahayag ng mga galactose inducible secretions, Gas1-GFP (GPI-AP, berde) at Mid2-iRFP (TMP, asul) at constitutive ERES labeling na Sec13-mCherry (ERES, magenta) ay inilagay sa 37°C. Pagkatapos i-incubate nang 30 minuto sa °C, lumipat sa 24°C upang ilabas ang secretion block, at i-imahe gamit ang SCLIM pagkatapos ng 20 minuto. (A hanggang C) Mga representatibong 2D projection images (A; scale bar, 1μm) o 3D cell hemisphere images (B at C; scale unit, 0.456μm) ng cargo at 10 z-sections na minarkahan ng ERES. Ang ibabang panel sa (B) at ang panel sa (C) ay nagpapakita ng mga naprosesong imahe upang ipakita lamang ang mga produktong nasa ERES (magenta) [Gas1-GFP (kulay abo) at Mid2-iRFP (mapusyaw na asul)]. (C) Bukas na palaso: Ang ERES ay nagdadala lamang ng isang piraso ng cargo (1 hanggang 4). Kulay abong palaso: Ang ERES ay naglalaman ng magkakahiwalay na kargamento (5). Puting solidong palaso: Ang ERES ay naglalaman ng magkakasamang kargamento. Sa ibaba: Ang napiling nag-iisang ERES ay naglalaman lamang ng Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Scale bar, 100 nm. (D) Pagkuwantipika ng photomicrograph na inilarawan sa (C). Ang average na porsyento ng ERES na naglalaman lamang ng isang kargamento (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), magkakahiwalay na kargamento at magkakapatong na kargamento. Sa tatlong independiyenteng eksperimento, n=432 sa 54 na selula. Error bar = SD. Two-tailed unpaired t test. *** P = 0.0002. (E) 3D na imahe ng napiling ERES ng naka-quarantine na kargamento na minarkahan ng (C). Ang Gas1-GFP (berde) (3) o Mid2-iRFP (asul) (4) ay pumapasok sa ERES (magenta) mula sa isang gilid at limitado sa isang maliit na lugar sa loob ng ERES. Minsan, ang parehong uri ng kargamento ay pumapasok sa parehong ERES (5) mula sa parehong panig at nakakulong sa isang liblib na lugar sa loob ng ERES. Scale bar, 100 nm.
Sumunod, sinubukan namin ang isang hypothesis na ang long acyl chain ceramide (C26) na nasa ER membrane ang nagtutulak sa specific clustering at sorting ng Gas1 patungo sa selective ERES. Para dito, gumamit kami ng modified yeast strain na GhLag1, kung saan ang dalawang endogenous ceramide synthases na Lag1 at Lac1 ay pinalitan ng GhLag1 (ang Lag1 homolog ng cotton), na nagresulta sa isang yeast strain na may cell membrane na Ceramide strain na mas maikli kaysa sa wild type (Figure 3A) (28). Ipinakita ng mass spectrometry (MS) analysis na sa wild-type strains, 95% ng kabuuang ceramide ay very long (C26) chain ceramide, habang sa GhLag1, 85% ng ceramide ay very long (C18 at C16). ), 2% lamang ng ceramide ang very long (C26) chain ceramide. Bagama't ang C18 at C16 ceramides ang pangunahing ceramides na natukoy sa GhLag1 membrane sa ngayon, kinumpirma rin ng MS analysis na ang GPI anchor ng Gas1-GFP na ipinahayag sa GhLag1 strain ay naglalaman ng C26 ceramide, na maihahambing sa wild-type lipids. Pareho ang kalidad (Fig. 3A) (26). Samakatuwid, nangangahulugan ito na ang ceramide remodeling enzyme na Cwh43 ay lubos na pumipili para sa C26 ceramide, tulad ng ipinapakita sa Figure 26, mas pinipili nitong isama ang GPI anchor mula sa isang maliit na halaga ng C26 ceramide sa GhLag1 strain. S2 (29). Gayunpaman, ang cell membrane ng GhLag1 ay karaniwang naglalaman lamang ng C18-C16 ceramide, habang ang Gas1-GFP ay mayroon pa ring C26 ceramide. Ang katotohanang ito ay ginagawang isang mainam na kasangkapan ang strain na ito upang partikular na malutas ang problema ng haba ng acyl chain ng membrane ceramide sa ER. Ang hipotetikal na papel ng klase at pag-uuri. Pagkatapos, una naming pinag-aralan ang kakayahan ng C26 Gas1-GFP na mag-ipon sa mga kumpol sa GhLag1 na may temperature-sensitive mutant allele na sec31-1 sa pamamagitan ng conventional fluorescence microscopy, kung saan tanging ang mahaba (C18-C16) chain lamang ang umiiral sa ER membrane na Ceramide (Fig. 3). Naobserbahan namin na sa sec31-1, karamihan sa Gas1-GFP ay naka-concentrate sa mga kumpol, habang ang Gas1-GFP sa sec31-1 GhLag1 na may mahaba (C18-C16) na ceramide ER membrane ay hindi pangunahing naka-cluster at nakakalat sa buong ER membrane. Para maging tumpak, dahil ang C26 ceramide-based clustering ay malapit na nauugnay sa partikular na ERES (Figure 1), sinundan naming siniyasat kung ang prosesong ito ay maaari ring may kinalaman sa function ng ER export protein mechanism. Gumagamit ang GPI-AP ng isang espesyal na COPII system para sa ER export, na aktibong kinokontrol ng structural remodeling ng Ted1 sa glycan portion ng GPI anchor (30, 31). Ang recombinant na GPI-glycan ay kinikilala ng transmembrane cargo receptor p24 complex, na siya namang pumipili sa Lst1, na isang partikular na isoform ng pangunahing COPII cargo binding subunit na Sec24, na bumubuo ng GPI-AP-rich COPII Vesicles (31-33). Samakatuwid, bumuo kami ng isang double mutant na pinagsama ang pagbura ng mga single protein na ito (ang p24 complex component na Emp24, GPI-glycan remodeling enzyme na Ted1 at ang partikular na COPII subunit na Lst1) kasama ang sec31-1 mutant strain, at pinag-aralan ang mga ito. Posible bang mabuo ang Gas1-cluster GFP (Larawan 3). Naobserbahan namin na sa sec31-1emp24Δ at sec31-1ted1Δ, ang Gas1-GFP ay pangunahing hindi nakakumpol at ipinamamahagi sa buong ER membrane, gaya ng nakita dati sa sec31-1 GhLag1, habang sa sec31-1lst1Δ, ang Gas1-GFP ay katulad ng sec31-1. Ipinapahiwatig ng mga resultang ito na bukod sa presensya ng C26 ceramide sa ER membrane, ang clustering ng Gas1-GFP ay kailangan ding magbigkis sa p24 complex, at hindi nangangailangan ng partikular na Lst1 recruitment. Pagkatapos, sinuri namin ang posibilidad na ang haba ng chain ng ceramide sa ER membrane ay maaaring mag-regulate sa pagbubuklod ng Gas1-GFP sa p24. Gayunpaman, natuklasan namin na ang presensya ng C18-C16 ceramide sa membrane ay hindi nakakaapekto sa mga GPI-glycan na muling itinayo ng p24 complex (Mga Larawan S3 at S4, A at B) o sa pagbubuklod sa GPI-AP at kakayahang mag-export ng GPI-AP. Recruit COPII subtype Lst1 (Larawan S4C). Samakatuwid, ang C26 ceramide-dependent clustering ay hindi nangangailangan ng mga interaksyon ng protina na may iba't ibang mekanismo ng ER export protein, ngunit sumusuporta sa isang alternatibong mekanismo ng pag-uuri na pinapagana ng haba ng lipid. Pagkatapos, sinuri namin kung ang haba ng ceramide acyl chain sa ER membrane ay mahalaga para sa epektibong pag-uuri ng Gas1-GFP bilang selective ERES. Dahil ang Gas1 sa GhLag1 strain na may short-chain ceramide ay umaalis sa ER at pumapasok sa plasma membrane (Figure S5), naniniwala kami na kung ang pag-uuri ay hinihimok ng haba ng ceramide acyl chain, ang Gas1 sa GhLag1 strain ay maaaring i-redirect at i-cross. Ang ERES ay may parehong membrane.
(A) Ang cell membrane ng GhLag1 ay pangunahing naglalaman ng mas maiikling C18-C16 ceramides, habang ang GPI anchor ng Gas1-GFP ay mayroon pa ring parehong C26 IPC gaya ng mga wild-type cells. Sa itaas: pagsusuri ng haba ng acyl chain ng ceramide sa cell membrane ng wild-type (Wt) at GhLag1p strains sa pamamagitan ng mass spectrometry (MS). Ang datos ay kumakatawan sa porsyento ng kabuuang ceramide. Ang average ng tatlong independiyenteng eksperimento. Error bar = SD. Two-tailed unpaired t test. **** P <0.0001. Ibabang panel: MS analysis ng haba ng acyl chain ng IPC na nasa Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI anchor na ipinahayag sa wild-type at GhLag1p strains. Ang datos ay kumakatawan sa porsyento ng kabuuang IPC signal. Average ng limang independiyenteng eksperimento. Error bar = SD. Two-tailed unpaired t test. ns, hindi mahalaga. P = 0.9134. (B) Ang mga fluorescence micrograph ng mga selulang sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ at sec31-1lst1Δ na nagpapahayag ng galactose-induced Gas1-GFP ay in-incubate sa 37°C sa loob ng 30 minuto at ipinasa pababa upang magsagawa ng routine fluorescence microscopy pagkatapos ng 24°C. Puting palaso: ER Gas1-GFP cluster. Bukas na palaso: Ang Unclustered Gas1-GFP ay nakakalat sa buong ER membrane, na nagpapakita ng ER characteristic nuclear ring staining. Scale bar, 5μm. (C) Pagkuwantipika ng photomicrograph na inilarawan sa (B). Ang average na porsyento ng mga selula na may punctate na istrukturang Gas1-GFP. Sa tatlong independiyenteng eksperimento, n≥300 na selula. Error bar = SD. Two-tailed unpaired t test. **** P <0.0001.
Upang direktang malutas ang problemang ito, nagsagawa kami ng SCLIM visualization ng Gas1-GFP at Mid2-iRFP sa GhLag1 kasama ang sec31-1 temperature-sensitive mutant allele (Figure 4 at Movie S4). Matapos mapanatili ang ER sa 37°C at kasunod na inilabas sa 24°C, karamihan sa mga bagong na-synthesize na Gas1-GFP ay hindi na-cluster at naipamahagi sa buong ER membrane, gaya ng naobserbahan ng mga conventional microscope (Figure 4, A at B). Bukod pa rito, ang malaking porsyento ng ERES (67%) ay kinabibilangan ng dalawang uri ng cargo na magkakasamang matatagpuan dito (Figure 4D). Ang mga panel 1 at 2 ng Figure 4C ay nagpapakita ng dalawang tipikal na halimbawa ng ERES na may magkakapatong na Gas1-GFP at Mid2-GFP. Bukod pa rito, ang parehong produkto ay pinagsama sa parehong ERES (Figure 4E, panel 3 at movie S4). Samakatuwid, ang aming mga resulta ay nagpapahiwatig na ang haba ng ceramide acyl chain sa ER membrane ay isang mahalagang determinant ng ER protein aggregation at classification.
Ang mga selula ng Sec31-1 GhLag1 na nagpapahayag ng mga pagtatago na dulot ng galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, berde) at Mid2-iRFP (TMP, asul) at constitutive ERES-labeled Sec13-mCherry (ERES, magenta) ay ini-incubate sa 37°C. Ipagpatuloy sa loob ng 30 minuto, ibaba sa 24°C upang maglabas ng mga pagtatago, at kumuha ng imahe gamit ang SCLIM pagkatapos ng 20 minuto. (A hanggang C) Mga representatibong 2D projection image (A; scale bar, 1μm) o 3D cell hemisphere image (B at C; scale unit, 0.45μm) ng 10 z-section na minarkahan ng cargo at ERES. Ang ibabang panel sa (B) at ang panel sa (C) ay nagpapakita ng mga naprosesong imahe upang ipakita lamang ang mga produktong nasa ERES (magenta) [Gas1-GFP (kulay abo) at Mid2-iRFP (mapusyaw na asul)]. (C) Puting palaso: ERES, magkakapatong ang mga produktong nasa loob. Bukas na palaso: Ang ERES ay naglalaman lamang ng isang aytem. Ibabang panel: Ang napiling ERES ay may magkakapatong na mga produkto (1 at 2) na minarkahan sa (C). Scale bar, 100 nm. (D) Pagkuwantipika ng photomicrograph na inilarawan sa (C). Sa mga yunit ng sec31-1 at sec31-1 GhLag1, isang kargamento lamang (Gas1-GFP o Mid2-iRFP) ang kasama, at ang average na porsyento ng ERES para sa nakahiwalay na kargamento at magkakapatong na kargamento. Sa tatlong independiyenteng eksperimento, n = 432 sa 54 na selula (sec31-1) at n = 430 sa 47 na selula (sec31-1 GhLag1). Error bar = SD. Two-tailed unpaired t test. *** P = 0.0002 (sec31-1) at ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D na imahe ng napiling ERES na may magkakapatong na kargamento (3) na minarkahan sa (C). Ang Gas1-GFP (berde) at Mid2-iRFP (asul) ay lumalapit sa ERES (magenta) mula sa iisang panig at nananatili sa parehong pinaghihigpitang lugar ng ERES. Scale bar, 100 nm.
Ang pag-aaral na ito ay nagbibigay ng direktang in vivo na ebidensya na ang mga lipid-based protein cargoes ay inuuri sa mga piling export sites sa secretory pathway, at ipinapakita ang kahalagahan ng haba ng acyl chain para sa selectivity ng klasipikasyon. Gamit ang isang makapangyarihan at makabagong pamamaraan ng microscopy na tinatawag na SCLIM, ipinakita namin ang bagong synthesized na Gas1-GFP (isang pangunahing plasma membrane GPI-AP na may napakahabang acyl chain (C26) ceramide lipid portion) sa yeast (Ang mga rehiyon na nakakumpol sa mga discrete ER ay nauugnay sa mga partikular na ERES, habang ang mga transmembrane secreted protein ay ipinamamahagi sa buong ER membrane (Figure 1). Bilang karagdagan, ang dalawang uri ng mga produkto na ito ay pumapasok sa iba't ibang ERES nang pili (Figure 2). Ang haba ng acyl chain ng cellular ceramide sa membrane ay nababawasan mula C26 patungong C18-C16, ang Gas1-GFP cluster ay naa-disrupt sa discrete ER region, at ang Gas1-GFP ay inililipat upang umalis sa ER kasama ang transmembrane protein sa pamamagitan ng parehong ERES (Figure 3 at Figure 3). 4).
Bagama't gumagamit ang GPI-AP ng isang espesyalisadong mekanismo ng protina upang lumabas sa ER, natuklasan namin na ang paghihiwalay na nakadepende sa C26 ceramide ay hindi umaasa sa magkakaibang interaksyon ng protina na maaaring humantong sa espesyalisasyon ng ERES (Mga Larawan S4 at S5). Sa halip, sinusuportahan ng aming mga natuklasan ang isang alternatibong mekanismo ng klasipikasyon na pinapagana ng lipid-based protein clustering at kasunod na pagbubukod ng iba pang mga kargamento. Ipinapahiwatig ng aming mga obserbasyon na ang rehiyon o kumpol ng Gas1-GFP na nauugnay sa isang partikular na ERES ay kulang sa transmembrane secreted protein na Mid2-iRFP, na nagpapahiwatig na ang C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster ay magpapadali sa kanilang pagpasok sa nauugnay na ERES, at kasabay nito, ibubukod ang mga transmembrane secretion na pumapasok sa partikular na ERES na ito (Mga Larawan 1 at 2). Sa kabaligtaran, ang presensya ng C18-C16 ceramides sa ER membrane ay hindi nagiging sanhi ng pagbuo ng mga rehiyon o kumpol ng GPI-AP, kaya hindi nila ibubukod o papalitan ang mga transmembrane secreted protein sa parehong ERES (Mga Larawan 3 at 4). Samakatuwid, iminumungkahi namin na ang C26 ceramide ay magtutulak ng paghihiwalay at klasipikasyon sa pamamagitan ng pagpapadali sa kumpol ng mga protina na naka-link sa mga partikular na ERES.
Paano makakamit ang C26 ceramide-dependent clustering na ito sa isang partikular na ER area? Ang tendensiya ng membrane ceramide na maghiwalay nang pahalang ay maaaring maging sanhi ng pagbuo ng maliliit at agarang nakaayos na mga lipid sa mas irregular na kapaligiran ng lipid ng ER membrane na naglalaman ng mas maikli at unsaturated glycerolipids. Mga de-kalidad na kumpol (17, 18). Ang maliliit na pansamantalang kumpol na ito ay maaaring higit pang pagsamahin sa mas malaki at mas matatag na mga kumpol pagkatapos magbigkis sa p24 complex (34). Kasabay nito, ipinakita namin na ang C26 Gas1-GFP ay kailangang makipag-ugnayan sa p24 complex upang bumuo ng mas malalaking nakikitang kumpol (Larawan 3). Ang p24 complex ay isang heterozygous oligomer na binubuo ng apat na magkakaibang p24 transmembrane protein sa yeast (35), na nagbibigay ng multivalent binding, na maaaring humantong sa cross-linking ng maliliit na kumpol ng GPI-AP, sa gayon ay bumubuo ng mas malaking Stable cluster (34). Ang interaksyon sa pagitan ng mga protein ectodomain ng GPI-AP ay maaari ring mag-ambag sa kanilang pagsasama-sama, tulad ng ipinakita sa panahon ng kanilang Golgi transport sa mga mammalian polarized epithelial cells (36). Gayunpaman, kapag ang C18-C16 ceramide ay naroroon sa ER membrane, kapag ang p24 complex ay nagbubuklod sa Gas1-GFP, ang malalaking magkakahiwalay na kumpol ay hindi mabubuo. Ang pinagbabatayang mekanismo ay maaaring depende sa mga partikular na pisikal at kemikal na katangian ng long acyl chain ceramide. Ipinapakita ng mga biophysical na pag-aaral ng mga artipisyal na lamad na bagama't ang parehong long (C24) at short (C18-C16) acyl chain ceramides ay maaaring magdulot ng phase separation, tanging ang long acyl chain ceramides (C24) lamang ang maaaring magsulong ng mataas na Curvature at film bending upang muling hubugin ang pelikula. Sa pamamagitan ng mutual reference (17, 37, 38). Ipinakita na ang transmembrane helix ng TMED2, ang human homologue ng Emp24, ay piling nakikipag-ugnayan sa C18 ceramide-based sphingomyelin sa cytoplasmic lobules (39). Gamit ang mga simulation ng molecular dynamics (MD), natuklasan namin na ang parehong C18 at C26 ceramides ay naiipon sa paligid ng cytoplasmic lobules ng Emp24 transmembrane helix, at mayroon silang magkatulad na mga kagustuhan (Figure S6). Mahalagang tandaan na ipinapahiwatig nito na ang transmembrane helix ng Emp24 ay maaaring humantong sa asymmetric distribution ng mga lipid sa membrane. Ito ay isang kamakailang resulta batay sa mga selula ng mammalian. Ipinapakita rin ng mga katulad na MD simulation ang presensya ng mga ether lipid (40). Samakatuwid, pinaghihinalaan namin na ang C26 ceramide sa dalawang lobules ng ER26 ay lokal na pinayaman. Kapag ang GPI-AP sa mga luminal lobules ay direktang nagbubuklod sa multivalent p24 at ang akumulasyon ng C26 ceramide sa paligid ng p24 sa mga cytoplasmic lobules, maaari nitong itaguyod ang kasamang Protein aggregation at membrane curvature na nabubuo sa pamamagitan ng mga daliri (41), na nagiging sanhi ng paghihiwalay ng GPI-AP sa mga hiwalay na rehiyon na katabi ng ERES, na pinapaboran din ang mga mataas na kurbadong rehiyon ng ER membrane (42). Sinuportahan ng mga naunang ulat ang iminungkahing mekanismo (43, 44). Ang multivalent binding ng mga oligolectin, pathogen o antibodies sa ceramide-based glycosphingolipids (GSL) sa plasma membrane ay nagpapalitaw ng malaking GSL aggregation, nagpapahusay sa phase separation at nagiging sanhi ng membrane deformation at internalization (44). Iwabuchi atbp. (43) Natuklasan na sa presensya ng mahahabang (C24) ngunit hindi maiikling (C16) acyl chains, ang multivalent ligand na nakagapos sa GSL lactosylceramide ay nag-udyok sa pagbuo ng malalaking kumpol at membrane invagination, at ang cytoplasm Lyn-mediated signal transduction sa mga leaflet ay interdigitated ng acyl chains sa coupled neutrophils.
Sa mga mammalian polarized epithelial cells, ang konsentrasyon ng anti-Golgi network (TGN) hanggang sa antas ng apical plasma membrane ay kumokontrol sa paghihiwalay at pag-uuri ng GPI-AP (10, 45). Ang pagsasama-samang ito ay hinihimok ng GPI-AP oligomerization (36), ngunit maaari rin itong depende sa haba ng ceramide chain na matatagpuan natin sa yeast. Bagama't ang mammalian GPI-AP ay may ether lipid-based anchor, at ang kemikal na istraktura nito ay ibang-iba sa napakahabang acyl chain ceramide, natuklasan ng isang kamakailang pag-aaral na ang parehong lipid ay may magkatulad na pisikal at kemikal na katangian at function (40). Samakatuwid, ang ether lipid na bahagi sa mga mammalian cell ay maaaring katulad ng C26 ceramide sa yeast, at ang papel nito ay ang pag-ugnay sa long-chain ceramide sa membrane upang isulong ang pagsasama-sama at pag-uuri ng GPI-AP. Bagama't kailangan pa ring direktang masubukan ang posibilidad na ito, sinusuportahan ng mga nakaraang natuklasan na ang transportasyon ng long acyl chain ceramide sa Golgi body ay hindi isinasagawa ng mga cytoplasmic transfer protein, ngunit nakasalalay sa synthesis ng mga GPI anchor tulad ng yeast. Samakatuwid, ang mekanismong konserbatibo sa ebolusyon ay tila kayang piliing mag-co-transport ng napakahabang acyl chain ceramide at GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) sa parehong transport vesicle.
Sa mga sistema ng yeast at mammalian polarized epithelial cell, ang pagsasama-sama at paghihiwalay ng GPI-AP mula sa iba pang mga protina ng plasma membrane ay nangyayari bago pa man makarating sa ibabaw ng cell. Natuklasan nina Paladino et al. (48) na sa TGN ng mga mammalian polarized epithelial cell, ang GPI-AP clustering ay hindi lamang kinakailangan para sa piling pag-uuri ng mga GPI-AP sa apical plasma membrane, kundi kinokontrol din nito ang organisasyon ng clustering ng mga GPI-AP at ang biological activity nito. Cell surface. Sa yeast, ipinakita ng pag-aaral na ito na ang C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster sa ER ay maaaring mag-regulate ng organisasyon ng cluster at functional activity ng GPI-AP sa plasma membrane (24, 49). Kasabay ng modelong ito, ang mga GhLag1 cell ay allergic sa mga GPI inhibitor o gamot na nakakaapekto sa integridad ng cell wall (28), at ang pangangailangan para sa mga functional Gas1-GFP cluster (49) ng tip ceramide na naka-project sa pagsasama ng mga yeast cell ay nagpapahiwatig ng G​​​ Posibleng pisyolohikal na kahihinatnan ng mga hLag1 cell. GPI-AP error. Gayunpaman, ang karagdagang pagsusuri kung ang functional organization ng cell surface ay na-program mula sa ER sa pamamagitan ng isang sorting method batay sa haba ng lipid ang magiging paksa ng aming pananaliksik sa hinaharap.
Ang mga strain ng Saccharomyces cerevisiae na ginamit sa gawaing ito ay nakalista sa Table S1. Ang mga strain ng MMY1583 at MMY1635 ng SCLIM para sa live cell imaging ay binuo sa background ng W303. Ang mga strain na ito na nagpapahayag ng Sec13-mCherry na may fluorescent protein tag ay binuo gamit ang isang polymerase chain reaction (PCR)-based na pamamaraan na may pFA6a plasmid bilang template (23). Ang strain na nagpapahayag ng Mid2-iRFP na may label na fluorescent protein sa ilalim ng kontrol ng GAL1 promoter ay binuo tulad ng sumusunod. PCR amplification ng iRFP-KanMx sequence mula sa pKTiRFP-KAN vector (regalo ni E. O'Shea, Addgene plasmid number 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; research resource identifier (RRID): Addgene_64687) At ipinasok sa C-terminus ng endogenous Mid2. Matapos ma-amplify at ma-clone ang Mid2-iRFP genome sequence sa GAL1 promoter, isinama ito sa Not I-Sac I site ng integration plasmid na pRS306. Ang nagresultang plasmid na pRGS7 ay inilinearize gamit ang Pst I upang maisama sa URA3 locus.
Ang Gas1-GFP fusion gene ay ipinapahayag sa ilalim ng kontrol ng GAL1 promoter sa centromere (CEN) plasmid, na binubuo ng mga sumusunod. Ang Gas1-GFP sequence ay pinalaki sa pamamagitan ng PCR mula sa pRS416-GAS1-GFP plasmid (24) (regalo ni L. Popolo) at na-clone sa Xma I–Xho I site ng CEN plasmid pBEVY-GL LEU2 (regalo ni C). Miller; Addgene plasmid number 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Ang nagresultang plasmid ay pinangalanang pRGS6. Ang Axl2-GFP fusion gene ay ipinapahayag din sa ilalim ng kontrol ng GAL1 promoter ng pBEVY-GL LEU2 vector, at ang konstruksyon nito ay ang mga sumusunod. Ang sequence ng Axl2-GFP ay pinalaki mula sa pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmid (23) sa pamamagitan ng PCR, at kinolon sa Bam HI-Pst I site ng pBEVY-GL LEU2 vector. Ang nagresultang plasmid ay pinangalanang pRGS12. Ang sequence ng mga oligonucleotide na ginamit sa pag-aaral na ito ay nakalista sa Table S2.
Ang strain ay dinagdagan ng 0.2% adenine at 2% glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] rich yeast extract protein p (YP) medium (1% Yeast extract at 2% protein ept). (YPR)] o 2% galactose [YP-galactose (YPG)] bilang pinagmumulan ng carbon, o sa isang synthetic minimal medium (0.15% yeast nitrogen base at 0.5% ammonium sulfate) upang madagdagan ang mga angkop na amino acid at base na kinakailangan para sa nutrisyon, at naglalaman ng 2% glucose (synthetic glucose minimal medium) o 2% galactose (synthetic galactose minimal medium) bilang pinagmumulan ng carbon.
Para sa real-time imaging, ang mga temperature-sensitive sec31-1 mutant cells na nagpapahayag ng construct sa ilalim ng GAL1 promoter ay pinalaki sa YPR medium sa 24°C magdamag hanggang sa mid-log phase. Pagkatapos ng induction sa YPG sa 24°C sa loob ng 1 oras, ang mga cell ay in-incubate sa SG sa 37°C sa loob ng 30 minuto, at pagkatapos ay inilipat sa 24°C upang lumabas mula sa secretion block. Ginamit ang Concanavalin A upang i-fix ang mga cell sa isang glass slide at kinukunan ng imahe gamit ang SCLIM. Ang SCLIM ay kombinasyon ng Olympus IX-71 inverted fluorescence microscope at UPlanSApo 100×1.4 numerical aperture oil lens (Olympus), high-speed at high-signal-to-noise ratio rotating disc confocal scanner (Yokogawa Electric), custom spectrometer, at custom cooling. Ang image intensifier ng system (Hamamatsu Photonics) ay maaaring magbigay ng magnifying lens system na may final magnification na ×266.7 at isang charge-coupled device camera na nagpaparami ng mga electron (Hamamatsu Photonics) (21). Ang pagkuha ng imahe ay isinasagawa sa pamamagitan ng custom software (Yokogawa Electric). Para sa mga 3D na imahe, gumamit kami ng custom-made na piezoelectric actuator upang i-vibrate ang objective lens nang patayo, at kinolekta ang mga optical na bahagi na 100 nm ang pagitan sa isang stack. Ang Z-stack na imahe ay kino-convert sa 3D voxel data, at ang theoretical point spread function na ginagamit para sa rotating disc confocal microscope ay ginagamit para sa deconvolution processing sa pamamagitan ng Volocity software (PerkinElmer). Gamit ang Volocity software upang awtomatikong magtakda ng threshold para sa co-location analysis, sinukat ang ERES kasama ang kargamento. Isinagawa ang line scan analysis gamit ang MetaMorph software (Molecular Devices).
Gamitin ang GraphPad Prism software upang matukoy ang statistical significance. Para sa two-tailed Student's t-test at sa ordinary one-way analysis of variance (ANOVA) test, ang mga pagkakaiba sa pagitan ng mga grupo ay itinuturing na may makabuluhang epekto sa P <0.05 (*).
Para sa fluorescence microscopy ng Gas1-GFP, ang mga log phase cell ay pinalaki magdamag sa YPD at kinolekta sa pamamagitan ng centrifugation, hinugasan nang dalawang beses gamit ang phosphate buffered saline, at in-incubate sa yelo nang hindi bababa sa 15 minuto, at pagkatapos ay ipinagpatuloy sa ilalim ng mikroskopyo gaya ng naunang inilarawan. Suriin (24). Ang Leica DMi8 microscope (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) na nilagyan ng objective lens, L5 (GFP) filter, Hamamatsu camera at Application Suite X (LAS X) software ang ginamit para sa pagkuha.
Ang mga sample ay dinalisay gamit ang SDS sample buffer sa 65°C sa loob ng 10 minuto, at pagkatapos ay pinaghiwalay gamit ang SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Para sa immunoblotting analysis, 10 μl ng sample ang inilagay sa bawat lane. Pangunahing antibody: Gumamit ng rabbit polyclonal anti-Gas1 sa dilution na 1:3000, rabbit polyclonal anti-Emp24 sa dilution na 1:500, at rabbit polyclonal anti-GFP (regalo mula kay H. Riezman) sa dilution na 1:3000. Ang mouse monoclonal anti-Pgk1 antibody ay ginamit sa dilution na 1:5000 (regalo mula kay J. de la Cruz). Pangalawang antibody: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) na ginamit sa dilution na 1:3000 (Pierce). Ginamit ang HRP-conjugated goat anti-mouse IgG sa dilution na 1:3000 (Pierce). Ang immune response zone ay naobserbahan gamit ang chemiluminescence method ng SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
Gaya ng inilarawan sa (31), isang natural immunoprecipitation experiment ang isinagawa sa enriched ER fraction. Sa madaling salita, hugasan ang mga yeast cell gamit ang TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride at protease inhibitor mixture) sa 600 nm (OD600) sa 100 optical density nang dalawang beses. Ito ay binasag gamit ang glass beads, at pagkatapos ay tinanggal ang mga labi ng cell at glass beads sa pamamagitan ng centrifugation. Ang supernatant ay sinentrifuga sa 17,000 g sa loob ng 15 minuto sa 4°C. Ang pellet ay muling isinalin sa TNE at ang digitalis saponin ay idinagdag sa huling konsentrasyon na 1%. Ang suspensyon ay in-incubate sa loob ng 1 oras na may rotation sa 4°C, at pagkatapos ay tinanggal ang mga hindi natutunaw na bahagi sa pamamagitan ng centrifugation sa 13,000 g sa 4°C sa loob ng 60 minuto. Para sa immunoprecipitation ng Gas1-GFP, unang i-pre-incubate ang sample gamit ang mga empty agarose beads (ChromoTek) sa 4°C sa loob ng 1 oras, at pagkatapos ay i-incubate gamit ang GFP-Trap_A (ChromoTek) sa 4°C sa loob ng 3 oras. Ang mga immunoprecipitated beads ay hinugasan ng limang beses gamit ang TNE na naglalaman ng 0.2% digoxigenin, ini-elute gamit ang SDS sample buffer, pinaghiwalay sa SDS-PAGE, at sinuri sa pamamagitan ng immunoblotting.
Gaya ng inilarawan sa (31), isinagawa ang cross-linking determination sa enriched ER fraction. Sa madaling salita, ang enriched ER fraction ay in-incubate gamit ang 0.5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Ang crosslinking reaction ay pinatigil sa pamamagitan ng pagdaragdag ng glycine (50 mM final concentration, 5 minuto, 20°C).
Gaya ng naunang inilarawan (50), isinagawa ang MS analysis ng ceramide sa wild-type at GhLag1 strains. Sa madaling salita, ang mga selula ay pinalaki sa exponential phase (3 hanggang 4 OD600 units/ml) sa YPD sa 30°C, at 25×107 na selula ang inani. Ang kanilang metabolismo ay pinapatay gamit ang trichloroacetic acid. Gumamit ng extraction solvent [ethanol, tubig, ether, pyridine at 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] at 1.2 nmol ng internal standard C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) quality). Gumamit ng monomethylamine reagent [methanol, tubig, n-butanol at methylamine solution (4:3:1:5 v/v)] upang magsagawa ng mild alkaline hydrolysis ng extract, at pagkatapos ay gamitin ang water-saturated n-butanol upang alisin ang asin. Panghuli, ang katas ay muling isinalin sa isang positive mode solvent [chloroform/methanol/tubig (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] at iniksyon sa mass spectrometer. Isinagawa ang multi-reaction monitoring (MRM) para sa pagtukoy at pagkuwantipika ng mga molekula ng sphingolipid. Ang TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ay nilagyan ng robotic nanoflow ion source na Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) para sa lipid analysis. Ang collision energy ay in-optimize para sa bawat kategorya ng ceramide. Ang datos ng MS ay nakuha sa positive mode. Para sa bawat biological replicate, ang lipid signal ay ang median ng tatlong magkakahiwalay na sukat.
Gaya ng inilarawan sa (31), ang mga selula (800×107) na nagpapahayag ng Gas1-GFP ay isinailalim sa natural na immunoprecipitation. Ang pinadalisay na Gas1-GFP ay pinaghiwalay ng SDS-PAGE at inilipat sa isang polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Ang protina ay nakita sa pamamagitan ng paglamlam sa PVDF gamit ang amide black. Ang banda ng Gas1-GFP ay pinutol mula sa PVDF at hinugasan ng 5 beses gamit ang methanol at isang beses gamit ang liquid chromatography-MS (LC-MS) grade water. Sa pamamagitan ng pag-incubate sa membrane strip na may 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer at 500μl na bagong tunaw na 1 M sodium nitrite mixture sa 37°C sa loob ng 3 oras, ang lipid fraction ay inilalabas mula sa Gas1-GFP at na-lyze. Paglabas ng inosine phosphate ceramide sa pagitan ng glucosamine at inositol (51). Pagkatapos nito, ang membrane strip ay hinugasan nang apat na beses gamit ang tubig na LC-MS grade, pinatuyo sa temperatura ng silid, at iniimbak sa nitrogen atmosphere sa -80°C hanggang sa pagsusuri. Bilang kontrol, isang blankong sample ng PVDF membrane ang ginamit para sa bawat eksperimento. Ang lipid na kinuha mula sa Gas1-GFP ay sinuri gamit ang MS gaya ng inilarawan (50). Sa madaling salita, ang mga PVDF strip na naglalaman ng GPI-lipid ay muling isinalin sa 75μl negative mold solvent [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] at dumaan sa electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage). Sa kasong ito, ang datos ng MS ay nakuha sa negative ion mode.
Gaya ng nabanggit kanina, ang bahagi ng lipid ng GPI anchor ay pinaghiwalay mula sa [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16). Ang mga lipid ay pinaghiwalay sa pamamagitan ng thin-layer chromatography gamit ang isang solvent system (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) at nakita gamit ang FLA-7000 (Fujifilm).
Ang mga selulang nagpapahayag ng Gas1-GFP (600×107) ay hinugasan nang dalawang beses gamit ang TNE buffer na may TNE buffer, at binasag gamit ang mga glass beads, at pagkatapos ay sinentrifuga upang alisin ang mga labi ng selula at mga glass beads. Ang supernatant ay sinentrifuga sa 17,000 g sa loob ng 1 oras sa 4°C. Ang pellet ay hinugasan sa TNE at in-incubate kasama ang 1 U PI-PLC (Invitrogen) sa TNE na naglalaman ng 0.2% digitalis saponin sa loob ng 1 oras sa 37°C. Pagkatapos ng enzyme treatment, ang membrane ay tinanggal sa pamamagitan ng centrifugation sa 17,000 g sa 4°C sa loob ng 1 oras. Upang immunoprecipitate ang Gas1-GFP, ang supernatant ay in-incubate kasama ang GFP-Trap_A (ChromoTek) sa 4°C magdamag. Ang purified Gas1-GFP na pinaghiwalay ng SDS-PAGE ay kinulayan ng Coomassie brilliant blue. Ang Gas1-GFP staining band ay pinutol mula sa kulay abong nakapalibot sa aqueduct, at pagkatapos ng alkylation gamit ang iodoacetamide at reduction gamit ang dithiothreitol, isinagawa ang in-gel digestion gamit ang trypsin. I-extract at i-dry ang mga tryptic peptide at peptide gamit ang GPI-glycans. Ang pinatuyong peptide ay tinunaw sa 20 μl ng tubig. Mag-inject ng isang bahagi (8μl) sa LC. Isang octadecylsilane (ODS) column (Develosil 300ODS-HG-5; inner diameter 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) ang ginamit upang paghiwalayin ang mga peptide sa ilalim ng mga partikular na kondisyon ng gradient. Ang mobile phase ay solvent A (0.08% formic acid) at solvent B (0.15% formic acid sa 80% acetonitrile). Isang Accela HPLC system (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ang ginamit upang i-elute ang column gamit ang solvent A sa loob ng 55 minuto sa flow rate na 50 μl min-1 sa loob ng 5 minuto, at pagkatapos ay dinagdagan ang konsentrasyon ng solvent B sa 40%. (Estados Unidos). Ang eluate ay patuloy na ipinasok sa ESI ion source, at ang mga tryptic peptide at peptide na may GPI-glycans ay sinuri gamit ang LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). Sa MS setup, ang boltahe ng capillary source ay nakatakda sa 4.5 kV, at ang temperatura ng transfer capillary ay pinanatili sa 300°C. Ang capillary voltage at tube lens voltage ay nakatakda sa 15 V at 50 V, ayon sa pagkakabanggit. Ang datos ng MS ay nakuha sa positive ion mode (resolution na 60,000; mass accuracy na 10 parts per million) sa mass range na 300/m/z mass/charge ratio (m/z) na 3000. Ang datos ng MS/MS ay nakuha sa pamamagitan ng ion trap sa LTQ Orbitrap XL [ang unang 3 digit kung saan nakasalalay ang datos, collision induced dissociation (CID)].
Isinagawa ang mga MD simulation gamit ang GROMACS (52) software at MARTINI 2 force field (53-55). Ang CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ay ginamit upang bumuo ng isang bilayer na naglalaman ng dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) at Cer C18 o DOPC at Cer C26. Ang topolohiya at mga coordinate ng Cer C26 ay hinango mula sa DXCE sa pamamagitan ng pag-alis ng mga sobrang beads mula sa sphingosine tail. Gamitin ang prosesong inilarawan sa ibaba upang balansehin ang double layer at patakbuhin ito, pagkatapos ay gamitin ang mga huling coordinate ng sistema upang bumuo ng isang sistema na naglalaman ng Emp24. Ang transmembrane domain ng yeast Emp24 (mga residue 173 hanggang 193) ay binuo bilang isang α-helix gamit ang visual MD (VMD) tool molecular structure (58). Pagkatapos, pagkatapos alisin ang mga magkakapatong na lipid, ang protina ay magaspang na binutil at ipinasok sa bilayer gamit ang CHARMM GUI. Ang pangwakas na sistema ay naglalaman ng 1202 DOPC at 302 Cer C26 o 1197 DOPC at 295 Cer C18 at Emp24. I-ionize ang sistema sa konsentrasyon na 0.150M. Apat na magkakahiwalay na replika ang ginawa para sa dalawang komposisyon ng bilayer.
Ang lipid bilayer ay binabalanse gamit ang prosesong CHARMM GUI, na kinabibilangan ng pagliit at pagbabalanse ng 405,000 hakbang, kung saan ang mga limitasyon sa posisyon ay unti-unting binabawasan at inaalis, at ang hakbang sa oras ay pinapataas mula 0.005 ps patungong 0.02 ps. Pagkatapos ng equilibration, nakakagawa ito ng 6 µs na may hakbang sa oras na 0.02 ps. Pagkatapos ipasok ang Emp24, gamitin ang parehong prosesong CHARMM GUI upang i-minimize at balansehin ang sistema, at pagkatapos ay patakbuhin nang 8 segundo sa produksyon.
Para sa lahat ng sistema, sa proseso ng pagbabalanse, ang presyon ay kinokontrol ng Berendsen barostat (59), at sa proseso ng produksyon, ang presyon ay kinokontrol ng Parrinello-Rahman barostat (60). Sa lahat ng kaso, ang average na presyon ay 1 bar at isang semi-isotropic pressure coupling scheme ang ginagamit. Sa proseso ng pagbabalanse at produksyon, isang thermostat (61) na may speed recalibration ang ginagamit upang i-couple ang temperatura ng mga particle ng protina, lipid, at solvent ayon sa pagkakabanggit. Sa buong operasyon, ang target na temperatura ay 310K. Ang non-bonding interaction ay kinakalkula sa pamamagitan ng pagbuo ng isang pairing list gamit ang Verlet scheme na may 0.005 buffer tolerance. Ang Coulomb term ay kinakalkula gamit ang reaction field at isang cut-off distance na 1.1 nm. Ang Vander Waals term ay gumagamit ng cut-off scheme na may cut-off distance na 1.1 nm, at ang Verlet cut-off scheme ay ginagamit para sa potensyal na drift (62).
Gamit ang VMD, ang cutoff wavelength sa pagitan ng DOPC phosphate beads o ceramide AM1 beads at ng protina ay 0.7 nm, at ang bilang ng mga lipid na nakikipag-ugnayan sa protina ay kinakalkula. Ayon sa sumusunod na pormula, kalkulahin ang depletion-enrichment (DE) factor tulad ng nasa (63): DE factor = (ang dami ng kabuuang lipid sa protina 0.7) sa protina 0.7 (ang dami ng Cer sa kabuuang lipid)
Ang iniulat na halaga ay kinukuha bilang average, at ang mga error bar ay apat na magkakahiwalay na kopya ng SE. Ang statistical significance ng DE factor ay kinakalkula sa pamamagitan ng t test [(averageDE-factor-1)/SE]. Kalkulahin ang P value mula sa one-tailed distribution.
Ginamit ang GROMACS tool upang kalkulahin ang 2D lateral density map ng sistemang naglalaman ng Emp24 sa loob ng huling 250 ns ng trace. Upang makuha ang enrichment/depletion map ng ceramide, ang density map ng Cer ay hinati sa kabuuan ng map ng Cer at DOPC, at pagkatapos ay hinati sa konsentrasyon ng Cer sa katawan. Ginagamit ang parehong color map scale.
Para sa mga karagdagang materyales para sa artikulong ito, pakitingnan ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ito ay isang artikulong maaaring gamitin sa bukas na pag-access na ipinamamahagi sa ilalim ng mga tuntunin ng Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, na nagpapahintulot sa paggamit, pamamahagi, at pagpaparami sa anumang midyum, hangga't ang pangwakas na paggamit ay hindi para sa komersyal na pakinabang at ang premise ay tama ang orihinal na akda. Sanggunian.
Paalala: Hinihiling lang namin sa iyo na ibigay ang iyong email address upang malaman ng taong irerekomenda mo sa pahina na gusto mong makita nila ang email at hindi ito spam. Hindi kami kukuha ng anumang email address.
Ang tanong na ito ay ginagamit upang subukan kung ikaw ay isang bisita at maiwasan ang awtomatikong pagpapadala ng spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Wagez -Linero, Misaho Lopez (Sergio Lopez), Miiho Lopez (Sergio Wagez) Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ipinapakita ng 3D high-resolution real-time imaging ang kahalagahan ng haba ng ceramide chain para sa pag-uuri ng protina sa mga selective output site.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Wagez -Linero, Misaho Lopez (Sergio Lopez), Miiho Lopez (Sergio Wagez) Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ipinapakita ng 3D high-resolution real-time imaging ang kahalagahan ng haba ng ceramide chain para sa pag-uuri ng protina sa mga selective output site.
©2020 American Association for the Advancement of Science. lahat ng karapatan ay nakalaan. Ang AAAS ay partner ng HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef at COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.