Salamat sa pagbisita sa nature.com. Limitado ang suporta sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin ang paggamit ng pinakabagong bersyon ng browser (o pag-off ng compatibility mode sa Internet Explorer). Bukod pa rito, upang matiyak ang patuloy na suporta, hindi isasama ng site na ito ang mga estilo o JavaScript.
Ang hydrogen sulfide (H2S) ay may maraming epektong pisyolohikal at patolohikal sa katawan ng tao. Ang sodium hydrosulfide (NaHS) ay malawakang ginagamit bilang isang parmakolohiko na kagamitan upang suriin ang mga epekto ng H2S sa mga eksperimentong biyolohikal. Bagama't ang pagkawala ng H2S mula sa mga solusyon ng NaHS ay tumatagal lamang ng ilang minuto, ang mga solusyon ng NaHS ay ginamit bilang mga donor compound para sa H2S sa inuming tubig sa ilang mga pag-aaral sa hayop. Sinuri ng pag-aaral na ito kung ang inuming tubig na may konsentrasyon ng NaHS na 30 μM na inihanda sa mga bote ng daga/daga ay maaaring manatiling matatag nang hindi bababa sa 12-24 na oras, gaya ng iminungkahi ng ilang mga may-akda. Maghanda ng solusyon ng NaHS (30 μM) sa inuming tubig at agad na ibuhos ito sa mga bote ng tubig ng daga/daga. Ang mga sample ay kinolekta mula sa dulo at loob ng bote ng tubig sa 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 at 24 na oras upang masukat ang nilalaman ng sulfide gamit ang pamamaraang methylene blue. Bukod pa rito, ang mga lalaking at babaeng daga ay tinurukan ng NaHS (30 μM) sa loob ng dalawang linggo at ang mga konsentrasyon ng serum sulfide ay sinukat tuwing ikalawang araw sa unang linggo at sa pagtatapos ng ikalawang linggo. Ang solusyon ng NaHS sa sample na nakuha mula sa dulo ng bote ng tubig ay hindi matatag; bumaba ito ng 72% at 75% pagkatapos ng 12 at 24 na oras, ayon sa pagkakabanggit. Sa mga sample na nakuha mula sa loob ng mga bote ng tubig, ang pagbaba ng NaHS ay hindi makabuluhan sa loob ng 2 oras; gayunpaman, bumaba ito ng 47% at 72% pagkatapos ng 12 at 24 na oras, ayon sa pagkakabanggit. Ang iniksyon ng NaHS ay hindi nakakaapekto sa antas ng serum sulfide ng mga lalaking at babaeng daga. Bilang konklusyon, ang mga solusyon ng NaHS na inihanda mula sa inuming tubig ay hindi dapat gamitin para sa donasyon ng H2S dahil ang solusyon ay hindi matatag. Ang paraan ng pagbibigay na ito ay maglalantad sa mga hayop sa hindi regular at mas maliit kaysa sa inaasahang dami ng NaHS.
Ang hydrogen sulfide (H2S) ay ginamit bilang isang lason mula pa noong 1700; gayunpaman, ang posibleng papel nito bilang isang endogenous biosignaling molecule ay inilarawan nina Abe at Kimura noong 1996. Sa nakalipas na tatlong dekada, maraming tungkulin ng H2S sa iba't ibang sistema ng tao ang nalinaw, na humahantong sa pagkaunawa na ang mga H2S donor molecule ay maaaring may mga klinikal na aplikasyon sa paggamot o pamamahala ng ilang mga sakit; tingnan ang Chirino et al. para sa isang kamakailang pagsusuri.
Ang sodium hydrosulfide (NaHS) ay malawakang ginagamit bilang isang parmakolohiko na kasangkapan upang masuri ang mga epekto ng H2S sa maraming pag-aaral sa cell culture at hayop5,6,7,8. Gayunpaman, ang NaHS ay hindi isang mainam na donor ng H2S dahil mabilis itong nako-convert sa H2S/HS- sa solusyon, madaling kontaminado ng mga polysulfide, at madaling ma-oxidize at ma-volatilize4,9. Sa maraming mga eksperimento sa biyolohiya, ang NaHS ay natutunaw sa tubig, na nagreresulta sa passive volatilization at pagkawala ng H2S10,11,12, kusang oksihenasyon ng H2S11,12,13, at photolysis14. Ang sulfide sa orihinal na solusyon ay mabilis na nawawala dahil sa volatilization ng H2S11. Sa isang bukas na lalagyan, ang half-life (t1/2) ng H2S ay humigit-kumulang 5 minuto, at ang konsentrasyon nito ay bumababa ng humigit-kumulang 13% bawat minuto10. Bagama't ang pagkawala ng hydrogen sulfide mula sa mga solusyon ng NaHS ay tumatagal lamang ng ilang minuto, ang ilang pag-aaral sa hayop ay gumamit ng mga solusyon ng NaHS bilang pinagmumulan ng hydrogen sulfide sa inuming tubig sa loob ng 1-21 linggo, na pinapalitan ang solusyon na naglalaman ng NaHS tuwing 12-24 oras.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Ang kasanayang ito ay hindi naaayon sa mga prinsipyo ng siyentipikong pananaliksik, dahil ang mga dosis ng gamot ay dapat na batay sa kanilang paggamit sa ibang mga species, lalo na sa mga tao.27
Ang preclinical na pananaliksik sa biomedicine ay naglalayong mapabuti ang kalidad ng pangangalaga sa pasyente o mga resulta ng paggamot. Gayunpaman, ang mga resulta ng karamihan sa mga pag-aaral sa hayop ay hindi pa naisalin sa mga tao28,29,30. Isa sa mga dahilan ng pagkabigong ito sa pagsasalin ay ang kakulangan ng atensyon sa kalidad ng metodolohiya ng mga pag-aaral sa hayop30. Samakatuwid, ang layunin ng pag-aaral na ito ay upang siyasatin kung ang 30 μM na solusyon ng NaHS na inihanda sa mga bote ng tubig para sa daga/daga ay maaaring manatiling matatag sa inuming tubig sa loob ng 12-24 oras, gaya ng inaangkin o iminungkahi sa ilang pag-aaral.
Ang lahat ng mga eksperimento sa pag-aaral na ito ay isinagawa alinsunod sa mga inilathalang alituntunin para sa pangangalaga at paggamit ng mga hayop sa laboratoryo sa Iran31. Ang lahat ng mga ulat ng eksperimento sa pag-aaral na ito ay sumunod din sa mga alituntunin ng ARRIVE32. Inaprubahan ng Ethics Committee ng Institute of Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, ang lahat ng mga pamamaraan ng eksperimento sa pag-aaral na ito.
Ang zinc acetate dihydrate (CAS: 5970-45-6) at anhydrous ferric chloride (CAS: 7705-08-0) ay binili mula sa Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, France). Ang sodium hydrosulfide hydrate (CAS: 207683-19-0) at N,N-dimethyl-p-phenylenediamine (DMPD) (CAS: 535-47-0) ay binili mula sa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Ang Isoflurane ay binili mula sa Piramal (Bethlehem, PA, USA). Ang hydrochloric acid (HCl) ay binili mula sa Merck (Darmstadt, Germany).
Maghanda ng solusyon ng NaHS (30 μM) sa inuming tubig at agad itong ibuhos sa mga bote ng tubig para sa daga/daga. Ang konsentrasyong ito ay pinili batay sa maraming publikasyon gamit ang NaHS bilang pinagmumulan ng H2S; tingnan ang seksyon ng Talakayan. Ang NaHS ay isang hydrated molecule na maaaring maglaman ng iba't ibang dami ng water of hydration (ibig sabihin, NaHS•xH2O); ayon sa tagagawa, ang porsyento ng NaHS na ginamit sa aming pag-aaral ay 70.7% (ibig sabihin, NaHS•1.3 H2O), at isinaalang-alang namin ang halagang ito sa aming mga kalkulasyon, kung saan gumamit kami ng molecular weight na 56.06 g/mol, na siyang molecular weight ng anhydrous NaHS. Ang water of hydration (tinatawag ding water of crystallization) ay ang mga molekula ng tubig na bumubuo sa mala-kristal na istraktura33. Ang mga hydrate ay may iba't ibang pisikal at thermodynamic na katangian kumpara sa mga anhydrate34.
Bago idagdag ang NaHS sa inuming tubig, sukatin ang pH at temperatura ng solvent. Ibuhos agad ang solusyon ng NaHS sa bote ng tubig para sa daga/daga sa kulungan ng hayop. Kinolekta ang mga sample mula sa dulo at mula sa loob ng bote ng tubig sa oras na 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, at 24 oras upang masukat ang nilalaman ng sulfide. Kinuha agad ang mga sukat ng sulfide pagkatapos ng bawat pagkuha ng sample. Kumuha kami ng mga sample mula sa dulo ng tubo dahil ipinakita ng ilang pag-aaral na ang maliit na butas ng tubo ng tubig ay maaaring mabawasan ang pagsingaw ng H2S15,19. Ang isyung ito ay tila naaangkop din sa solusyon sa bote. Gayunpaman, hindi ito ang kaso para sa solusyon sa leeg ng bote ng tubig, na may mas mataas na rate ng pagsingaw at nag-a-autooxidize; sa katunayan, ang tubig na ito ang unang iniinom ng mga hayop.
Ginamit sa pag-aaral ang mga lalaking at babaeng Wistar na daga. Ang mga daga ay inilagay sa mga polypropylene cage (2-3 daga bawat hawla) sa ilalim ng mga karaniwang kondisyon (temperatura 21-26 °C, humidity 32-40%) na may 12 oras na liwanag (7 am hanggang 7 pm) at 12 oras na dilim (7 pm hanggang 7 am). Ang mga daga ay may libreng access sa tubig mula sa gripo at pinakain ng karaniwang pagkain (Khorak Dam Pars Company, Tehran, Iran). Ang mga babaeng Wistar na magkapareho ang edad (n=10, timbang ng katawan: 190–230 g) at lalaking Wistar na daga (n=10, timbang ng katawan: 320–370 g) ay random na hinati sa mga grupong ginamot sa kontrol at NaHS (30 μM) (n=5 bawat grupo). Upang matukoy ang laki ng sample, ginamit namin ang KISS (Keep It Simple, Stupid) na pamamaraan, na pinagsasama ang nakaraang karanasan at pagsusuri ng lakas35. Una kaming nagsagawa ng isang pilot study sa 3 daga at tinukoy ang mean serum total sulfide level at standard deviation (8.1 ± 0.81 μM). Pagkatapos, kung isasaalang-alang ang 80% power at ipagpalagay na may two-sided 5% significance level, tinukoy namin ang isang paunang sample size (n = 5 batay sa mga naunang literatura) na tumutugma sa isang standardized effect size na 2.02 na may paunang natukoy na halaga na iminungkahi ng Festing para sa pagkalkula ng sample size ng mga experimental animal35. Matapos i-multiply ang halagang ito sa SD (2.02 × 0.81), ang hinulaang detectable effect size (1.6 μM) ay 20%, na katanggap-tanggap. Nangangahulugan ito na ang n = 5/grupo ay sapat na upang matukoy ang 20% ​​mean change sa pagitan ng mga grupo. Ang mga daga ay random na hinati sa control at NaSH-treated na mga grupo gamit ang random function ng Excel software 36 (Supplementary Fig. 1). Isinagawa ang Blinding sa outcome level, at ang mga imbestigador na nagsasagawa ng mga biochemical measurement ay hindi alam ang tungkol sa mga group assignment.
Ang mga grupo ng NaHS ng parehong kasarian ay ginamot gamit ang 30 μM na solusyon ng NaHS na inihanda sa inuming tubig sa loob ng 2 linggo; Ang sariwang solusyon ay ibinigay bawat 24 oras, kung saan sinukat ang timbang ng katawan. Ang mga sample ng dugo ay kinolekta mula sa dulo ng buntot ng lahat ng daga sa ilalim ng isoflurane anesthesia tuwing ibang araw sa pagtatapos ng una at ikalawang linggo. Ang mga sample ng dugo ay isinailalim sa centrifugation sa 3000 g sa loob ng 10 minuto, ang serum ay pinaghiwalay at iniimbak sa –80°C para sa kasunod na pagsukat ng serum urea, creatinine (Cr), at total sulfide. Ang serum urea ay natukoy gamit ang enzymatic urease method, at ang serum creatinine ay natukoy gamit ang photometric Jaffe method gamit ang mga komersyal na available na kit (Man Company, Tehran, Iran) at isang automatic analyzer (Selectra E, serial number 0-2124, The Netherlands). Ang intra- at interassay coefficients of variation para sa urea at Cr ay mas mababa sa 2.5%.
Ang pamamaraang methylene blue (MB) ay ginagamit upang sukatin ang kabuuang sulfide sa inuming tubig at serum na naglalaman ng NaHS; ang MB ang pinakakaraniwang ginagamit na pamamaraan para sa pagsukat ng sulfide sa mga bulk solution at biological sample11,37. Ang pamamaraang MB ay maaaring gamitin upang tantyahin ang kabuuang sulfide pool38 at sukatin ang mga inorganic sulfide sa anyo ng H2S, HS- at S2 sa aqueous phase39. Sa pamamaraang ito, ang sulfur ay napi-precipitate bilang zinc sulfide (ZnS) sa presensya ng zinc acetate11,38. Ang zinc acetate precipitation ang pinakamalawak na ginagamit na pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga sulfide mula sa iba pang mga chromophores11. Ang ZnS ay muling natunaw gamit ang HCl11 sa ilalim ng mga kondisyong may matinding acidic. Ang sulfide ay tumutugon sa DMPD sa isang stoichiometric ratio na 1:2 sa isang reaksyon na na-catalyz ng ferric chloride (ang Fe3+ ay gumaganap bilang isang oxidizing agent) upang mabuo ang dye MB, na nade-detect nang spectrophotometrically sa 670 nm40,41. Ang detection limit ng pamamaraang MB ay humigit-kumulang 1 μM11.
Sa pag-aaral na ito, 100 μL ng bawat sample (solusyon o serum) ang idinagdag sa isang tubo; pagkatapos ay 200 μL ng zinc acetate (1% w/v sa distilled water), 100 μL ng DMPD (20 mM sa 7.2 M HCl), at 133 μL ng FeCl3 (30 mM sa 1.2 M HCl) ang idinagdag. Ang timpla ay in-incubate sa 37°C sa dilim sa loob ng 30 minuto. Ang solusyon ay sinentrifuga sa 10,000 g sa loob ng 10 minuto, at ang absorbance ng supernatant ay binasa sa 670 nm gamit ang isang microplate reader (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Ang mga konsentrasyon ng sulfide ay natukoy gamit ang isang calibration curve ng NaHS (0–100 μM) sa ddH2O (Karagdagang Larawan 2). Lahat ng solusyon na ginamit para sa mga pagsukat ay bagong inihanda. Ang intra- at interassay coefficients of variation para sa mga sukat ng sulfide ay 2.8% at 3.4%, ayon sa pagkakabanggit. Natukoy din namin ang kabuuang sulfide na nakuha mula sa mga sample ng inuming tubig at serum na naglalaman ng sodium thiosulfate gamit ang fortified sample method42. Ang mga nakuhang muli para sa mga sample ng inuming tubig at serum na naglalaman ng sodium thiosulfate ay 91 ± 1.1% (n = 6) at 93 ± 2.4% (n = 6), ayon sa pagkakabanggit.
Isinagawa ang pagsusuring istatistikal gamit ang GraphPad Prism software bersyon 8.0.2 para sa Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). Ginamit ang isang paired t-test upang ihambing ang temperatura at pH ng inuming tubig bago at pagkatapos ng pagdaragdag ng NaHS. Ang pagkawala ng H2S sa solusyon na naglalaman ng NaHS ay kinalkula bilang porsyento ng pagbaba mula sa baseline uptake, at upang masuri kung ang pagkawala ay makabuluhan sa istatistika, nagsagawa kami ng one-way repeated-measures ANOVA na sinundan ng Dunnett's multiple comparison test. Ang timbang ng katawan, serum urea, serum creatinine, at kabuuang serum sulfide sa paglipas ng panahon ay inihambing sa pagitan ng mga kontrol at mga daga na ginamot ng NaHS na may iba't ibang kasarian gamit ang two-way mixed (between-within) ANOVA na sinundan ng Bonferroni post hoc test. Ang two-tailed P values ​​​​< 0.05 ay itinuturing na makabuluhan sa istatistika.
Ang pH ng inuming tubig ay 7.60 ± 0.01 bago idagdag ang NaHS at 7.71 ± 0.03 pagkatapos idagdag ang NaHS (n = 13, p = 0.0029). Ang temperatura ng inuming tubig ay 26.5 ± 0.2 at bumaba sa 26.2 ± 0.2 pagkatapos idagdag ang NaHS (n = 13, p = 0.0128). Maghanda ng 30 μM na solusyon ng NaHS sa inuming tubig at iimbak ito sa isang bote ng tubig. Ang solusyon ng NaHS ay hindi matatag at ang konsentrasyon nito ay bumababa sa paglipas ng panahon. Nang kumuha ng sample mula sa leeg ng bote ng tubig, isang makabuluhang pagbaba (68.0%) ang naobserbahan sa loob ng unang oras, at ang nilalaman ng NaHS sa solusyon ay bumaba ng 72% at 75% pagkatapos ng 12 at 24 na oras, ayon sa pagkakabanggit. Sa mga sample na nakuha mula sa mga bote ng tubig, ang pagbaba sa NaHS ay hindi makabuluhan hanggang 2 oras, ngunit pagkatapos ng 12 at 24 na oras, ito ay bumaba ng 47% at 72%, ayon sa pagkakabanggit. Ipinapahiwatig ng mga datos na ito na ang porsyento ng NaHS sa isang 30 μM na solusyon na inihanda sa inuming tubig ay bumaba sa humigit-kumulang isang-kapat ng paunang halaga pagkatapos ng 24 na oras, anuman ang lokasyon ng pagkuha ng sample (Larawan 1).
Katatagan ng solusyong NaHS (30 μM) sa inuming tubig sa mga bote ng daga/daga. Pagkatapos ihanda ang solusyon, kinuha ang mga sample mula sa dulo at loob ng bote ng tubig. Ang datos ay ipinapakita bilang mean ± SD (n = 6/grupo). * at #, P < 0.05 kumpara sa oras na 0. Ipinapakita ng litrato ng bote ng tubig ang dulo (na may butas) at ang katawan ng bote. Ang dami ng dulo ay humigit-kumulang 740 μL.
Ang konsentrasyon ng NaHS sa bagong handang 30 μM na solusyon ay 30.3 ± 0.4 μM (saklaw: 28.7–31.9 μM, n = 12). Gayunpaman, pagkatapos ng 24 na oras, ang konsentrasyon ng NaHS ay bumaba sa mas mababang halaga (mean: 3.0 ± 0.6 μM). Gaya ng ipinapakita sa Figure 2, ang mga konsentrasyon ng NaHS na kinaharap ng mga daga ay hindi pare-pareho sa panahon ng pag-aaral.
Ang bigat ng katawan ng mga babaeng daga ay tumaas nang malaki sa paglipas ng panahon (mula 205.2 ± 5.2 g hanggang 213.8 ± 7.0 g sa control group at mula 204.0 ± 8.6 g hanggang 211.8 ± 7.5 g sa grupong ginamot ng NaHS); gayunpaman, ang paggamot gamit ang NaHS ay walang epekto sa bigat ng katawan (Larawan 3). Ang bigat ng katawan ng mga lalaking daga ay tumaas nang malaki sa paglipas ng panahon (mula 338.6 ± 8.3 g hanggang 352.4 ± 6.0 g sa control group at mula 352.4 ± 5.9 g hanggang 363.2 ± 4.3 g sa grupong ginamot ng NaHS); gayunpaman, ang paggamot gamit ang NaHS ay walang epekto sa bigat ng katawan (Larawan 3).
Mga pagbabago sa timbang ng katawan sa mga babae at lalaking daga pagkatapos ng pagbibigay ng NaHS (30 μM). Ang datos ay ipinakita bilang mean ± SEM at inihambing gamit ang two-way mixed (within-between) analysis of variance na may Bonferroni post hoc test. n = 5 ng bawat kasarian sa bawat grupo.
Ang konsentrasyon ng serum urea at creatine phosphate ay maihahambing sa mga daga na ginagamot ng kontrol at NaSH sa buong pag-aaral. Bukod pa rito, ang paggamot ng NaSH ay hindi nakaapekto sa konsentrasyon ng serum urea at creatinechrome (Talahanayan 1).
Ang baseline serum total sulfide concentrations ay maihahambing sa pagitan ng control at mga lalaking daga na ginamot ng NaHS (8.1 ± 0.5 μM vs. 9.3 ± 0.2 μM) at babaeng daga (9.1 ± 1.0 μM vs. 6.1 ± 1.1 μM). Ang pagbibigay ng NaHS sa loob ng 14 na araw ay walang epekto sa serum total sulfide levels sa mga lalaking daga o babaeng daga (Fig. 4).
Mga pagbabago sa kabuuang konsentrasyon ng sulfide sa serum sa mga lalaking at babaeng daga pagkatapos ng pagbibigay ng NaHS (30 μM). Ang datos ay ipinakita bilang mean ± SEM at inihambing gamit ang two-way mixed (within-within) analysis of variance gamit ang Bonferroni post hoc test. Bawat kasarian, n = 5/grupo.
Ang pangunahing konklusyon ng pag-aaral na ito ay ang inuming tubig na naglalaman ng NaHS ay hindi matatag: halos isang-kapat lamang ng unang kabuuang nilalaman ng sulfide ang maaaring matukoy 24 oras pagkatapos kumuha ng sample mula sa dulo at sa loob ng mga bote ng tubig para sa daga/daga. Bukod pa rito, ang mga daga ay nalantad sa hindi matatag na konsentrasyon ng NaHS dahil sa pagkawala ng H2S sa solusyon ng NaHS, at ang pagdaragdag ng NaHS sa inuming tubig ay hindi nakaapekto sa timbang ng katawan, serum urea at creatine chromium, o kabuuang serum sulfide.
Sa pag-aaral na ito, ang rate ng pagkawala ng H2S mula sa 30 μM na solusyon ng NaHS na inihanda sa inuming tubig ay humigit-kumulang 3% kada oras. Sa isang buffered solution (100 μM sodium sulfide sa 10 mM PBS, pH 7.4), ang konsentrasyon ng sulfide ay naiulat na bumaba ng 7% sa paglipas ng panahon sa loob ng 8 oras11. Nauna na naming ipinagtanggol ang intraperitoneal na pagbibigay ng NaHS sa pamamagitan ng pag-uulat na ang rate ng pagkawala ng sulfide mula sa isang 54 μM na solusyon ng NaHS sa inuming tubig ay humigit-kumulang 2.3% kada oras (4%/oras sa unang 12 oras at 1.4%/oras sa huling 12 oras pagkatapos ng paghahanda)8. Ang mga naunang pag-aaral43 ay natagpuan ang isang patuloy na pagkawala ng H2S mula sa mga solusyon ng NaHS, pangunahin dahil sa volatilization at oksihenasyon. Kahit na walang idinagdag na mga bula, ang sulfide sa stock solution ay mabilis na nawawala dahil sa H2S volatilization11. Ipinakita ng mga pag-aaral na sa proseso ng pagbabanto, na tumatagal ng humigit-kumulang 30-60 segundo, humigit-kumulang 5-10% ng H2S ang nawawala dahil sa pagsingaw6. Upang maiwasan ang pagsingaw ng H2S mula sa solusyon, ang mga mananaliksik ay nagsagawa ng ilang hakbang, kabilang ang banayad na paghahalo ng solusyon12, pagtatakip sa stock solution ng plastic film6, at pagbabawas ng pagkakalantad ng solusyon sa hangin, dahil ang bilis ng pagsingaw ng H2S ay nakadepende sa interface ng hangin-likido.13 Ang kusang oksihenasyon ng H2S ay nangyayari pangunahin dahil sa mga transition metal ion, lalo na ang ferric iron, na mga dumi sa tubig.13 Ang oksihenasyon ng H2S ay nagreresulta sa pagbuo ng mga polysulfide (mga atomo ng sulfur na pinagdurugtong ng mga covalent bond)11. Upang maiwasan ang oksihenasyon nito, ang mga solusyon na naglalaman ng H2S ay inihahanda sa mga deoxygenated solvents44,45 at pagkatapos ay pinupurga gamit ang argon o nitrogen sa loob ng 20-30 minuto upang matiyak ang deoxygenation.11,12,37,44,45,46 Ang Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) ay isang metal chelator (10-4 M) na pumipigil sa HS- autoxidation sa mga aerobic solution. Sa kawalan ng DTPA, ang autoxidation rate ng HS- ay humigit-kumulang 50% sa loob ng humigit-kumulang 3 oras sa 25°C37,47. Bukod pa rito, dahil ang oksihenasyon ng 1e-sulfide ay na-catalyze ng ultraviolet light, ang solusyon ay dapat itago sa yelo at protektado mula sa liwanag11.
Gaya ng ipinapakita sa Figure 5, ang NaHS ay naghihiwalay sa Na+ at HS-6 kapag natunaw sa tubig; ang paghihiwalay na ito ay natutukoy ng pK1 ng reaksyon, na nakadepende sa temperatura: pK1 = 3.122 + 1132/T, kung saan ang T ay mula 5 hanggang 30°C at sinusukat sa degrees Kelvin (K), K = °C + 273.1548. Ang HS- ay may mataas na pK2 (pK2 = 19), kaya sa pH < 96.49, ang S2- ay hindi nabubuo o nabubuo sa napakaliit na dami. Sa kabaligtaran, ang HS- ay gumaganap bilang isang base at tumatanggap ng H+ mula sa isang molekula ng H2O, at ang H2O ay gumaganap bilang isang acid at kino-convert sa H2S at OH-.
Pagbuo ng natunaw na H2S gas sa solusyong NaHS (30 µM). aq, may tubig na solusyon; g, gas; l, likido. Ipinapalagay ng lahat ng kalkulasyon na ang pH ng tubig = 7.0 at temperatura ng tubig = 20 °C. Ginawa gamit ang BioRender.com.
Sa kabila ng ebidensya na ang mga solusyon ng NaHS ay hindi matatag, ilang pag-aaral sa hayop ang gumamit ng mga solusyon ng NaHS sa inuming tubig bilang isang H2S donor compound15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 na may tagal ng interbensyon mula 1 hanggang 21 linggo (Talahanayan 2). Sa mga pag-aaral na ito, ang solusyon ng NaHS ay pinapalitan tuwing 12 oras, 15, 17, 18, 24, 25 oras o 24 oras, 19, 20, 21, 22, 23 oras. Ipinakita ng aming mga resulta na ang mga daga ay nalantad sa hindi matatag na konsentrasyon ng gamot dahil sa pagkawala ng H2S mula sa solusyon ng NaHS, at ang nilalaman ng NaHS sa inuming tubig ng mga daga ay nagbago nang malaki sa loob ng 12 o 24 oras (tingnan ang Larawan 2). Dalawa sa mga pag-aaral na ito ang nag-ulat na ang antas ng H2S sa tubig ay nanatiling matatag sa loob ng 24 na oras, 22 oras, o 2–3% lamang na pagkawala ng H2S ang naobserbahan sa loob ng 12 oras, 15 oras, ngunit hindi sila nagbigay ng sumusuportang datos o mga detalye ng pagsukat. Ipinakita ng dalawang pag-aaral na ang maliit na diyametro ng mga bote ng tubig ay maaaring mabawasan ang pagsingaw ng H2S15,19. Gayunpaman, ipinakita ng aming mga resulta na maaari lamang nitong maantala ang pagkawala ng H2S mula sa isang bote ng tubig ng 2 oras sa halip na 12–24 oras. Nabanggit sa parehong pag-aaral na ipinapalagay namin na ang antas ng NaHS sa inuming tubig ay hindi nagbago dahil hindi kami nakakita ng pagbabago ng kulay sa tubig; samakatuwid, ang oksihenasyon ng H2S sa pamamagitan ng hangin ay hindi makabuluhan19,20. Nakakagulat, ang subhetibong pamamaraang ito ay tinatasa ang katatagan ng NaHS sa tubig sa halip na sukatin ang pagbabago sa konsentrasyon nito sa paglipas ng panahon.
Ang pagkawala ng H2S sa solusyon ng NaHS ay may kaugnayan sa pH at temperatura. Gaya ng nabanggit sa aming pag-aaral, ang pagtunaw ng NaHS sa tubig ay nagreresulta sa pagbuo ng isang alkaline na solusyon50. Kapag ang NaHS ay natunaw sa tubig, ang pagbuo ng natunaw na H2S gas ay nakadepende sa halaga ng pH6. Kung mas mababa ang pH ng solusyon, mas malaki ang proporsyon ng NaHS na naroroon bilang mga molekula ng H2S gas at mas maraming sulfide ang nawawala mula sa aqueous solution11. Wala sa mga pag-aaral na ito ang nag-ulat ng pH ng inuming tubig na ginagamit bilang solvent para sa NaHS. Ayon sa mga rekomendasyon ng WHO, na pinagtibay ng karamihan sa mga bansa, ang pH ng inuming tubig ay dapat nasa hanay na 6.5–8.551. Sa hanay na ito ng pH, ang rate ng kusang oksihenasyon ng H2S ay tumataas nang humigit-kumulang sampung beses13. Ang pagtunaw ng NaHS sa tubig sa hanay na ito ng pH ay magreresulta sa konsentrasyon ng natunaw na H2S gas na 1 hanggang 22.5 μM, na nagbibigay-diin sa kahalagahan ng pagsubaybay sa pH ng tubig bago matunaw ang NaHS. Bukod pa rito, ang saklaw ng temperaturang naiulat sa pag-aaral sa itaas (18–26 °C) ay magreresulta sa pagbabago sa konsentrasyon ng dissolved H2S gas sa solusyon na humigit-kumulang 10%, dahil ang mga pagbabago sa temperatura ay nagpapabago sa pK1, at ang maliliit na pagbabago sa pK1 ay maaaring magkaroon ng malaking epekto sa konsentrasyon ng dissolved H2S gas48. Bukod pa rito, ang mahabang tagal ng ilang pag-aaral (5 buwan)22, kung saan inaasahan ang malaking pagkakaiba-iba ng temperatura, ay nagpapalala rin sa problemang ito.
Lahat ng pag-aaral maliban sa isa21 ay gumamit ng 30 μM na solusyon ng NaHS sa inuming tubig. Upang ipaliwanag ang dosis na ginamit (ibig sabihin, 30 μM), itinuro ng ilang mga may-akda na ang NaHS sa aqueous phase ay nagbubunga ng eksaktong parehong konsentrasyon ng H2S gas at ang physiological range ng H2S ay 10 hanggang 100 μM, kaya ang dosis na ito ay nasa loob ng physiological range15,16. Ipinaliwanag ng iba na ang 30 μM NaHS ay maaaring mapanatili ang antas ng plasma H2S sa loob ng physiological range, ibig sabihin, 5–300 μM19,20. Isinasaalang-alang namin ang konsentrasyon ng NaHS sa tubig na 30 μM (pH = 7.0, T = 20 °C), na ginamit sa ilang mga pag-aaral upang pag-aralan ang mga epekto ng H2S. Maaari naming kalkulahin na ang konsentrasyon ng dissolved H2S gas ay 14.7 μM, na humigit-kumulang 50% ng paunang konsentrasyon ng NaHS. Ang halagang ito ay katulad ng halagang kinalkula ng ibang mga may-akda sa ilalim ng parehong mga kondisyon13,48.
Sa aming pag-aaral, ang pagbibigay ng NaHS ay hindi nagpabago sa timbang ng katawan; ang resultang ito ay naaayon sa mga resulta ng iba pang mga pag-aaral sa mga lalaking daga22,23 at mga lalaking daga18; Gayunpaman, dalawang pag-aaral ang nag-ulat na naibalik ng NaSH ang nabawasang timbang ng katawan sa mga nephrectomized na daga24,26, samantalang ang ibang mga pag-aaral ay hindi nag-ulat ng epekto ng pagbibigay ng NaSH sa timbang ng katawan15,16,17,19,20,21,25. Bukod pa rito, sa aming pag-aaral, ang pagbibigay ng NaSH ay hindi nakaapekto sa antas ng serum urea at creatine chromium, na naaayon sa mga resulta ng isa pang ulat25.
Natuklasan sa pag-aaral na ang pagdaragdag ng NaHS sa inuming tubig sa loob ng 2 linggo ay hindi nakaapekto sa kabuuang konsentrasyon ng serum sulfide sa mga lalaking at babaeng daga. Ang natuklasang ito ay naaayon sa mga resulta nina Sen et al. (16): ang 8 linggong paggamot gamit ang 30 μM NaHS sa inuming tubig ay hindi nakaapekto sa mga antas ng plasma sulfide sa mga control rats; gayunpaman, iniulat nila na ang interbensyong ito ay nagpanumbalik sa nabawasang antas ng H2S sa plasma ng mga nephrectomized na daga. Iniulat din nina Li et al. (22) na ang paggamot gamit ang 30 μM NaHS sa inuming tubig sa loob ng 5 buwan ay nagpataas ng mga antas ng plasma free sulfide sa mga matatandang daga ng humigit-kumulang 26%. Ang ibang mga pag-aaral ay hindi nag-ulat ng mga pagbabago sa circulating sulfide pagkatapos ng pagdaragdag ng NaHS sa inuming tubig.
Pitong pag-aaral ang nag-ulat gamit ang Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 ngunit hindi nagbigay ng karagdagang detalye tungkol sa tubig ng hydration, at limang pag-aaral ang hindi binanggit ang pinagmulan ng NaHS na ginamit sa kanilang mga pamamaraan ng paghahanda17,18,24,25,26. Ang NaHS ay isang hydrated molecule at ang nilalaman ng tubig ng hydration nito ay maaaring mag-iba, na nakakaapekto sa dami ng NaHS na kinakailangan upang maghanda ng solusyon ng isang partikular na molarity. Halimbawa, ang nilalaman ng NaHS sa aming pag-aaral ay NaHS•1.3 H2O. Kaya, ang aktwal na konsentrasyon ng NaHS sa mga pag-aaral na ito ay maaaring mas mababa kaysa sa mga iniulat.
“Paano magkakaroon ng ganitong panandaliang epekto ang isang compound na may ganitong panandaliang epekto?” Itinanong ito nina Pozgay et al.21 nang suriin ang mga epekto ng NaHS sa colitis sa mga daga. Umaasa sila na masasagot ng mga pag-aaral sa hinaharap ang tanong na ito at mag-isip-isip na ang mga solusyon ng NaHS ay maaaring maglaman ng mas matatag na polysulfides bilang karagdagan sa H2S at mga disulfide na namamagitan sa epekto ng NaHS21. Ang isa pang posibilidad ay ang napakababang konsentrasyon ng NaHS na natitira sa solusyon ay maaari ring magkaroon ng kapaki-pakinabang na epekto. Sa katunayan, nagbigay si Olson et al. ng ebidensya na ang mga antas ng micromolar ng H2S sa dugo ay hindi pisyolohikal at dapat ay nasa nanomolar range o wala nang buo13. Ang H2S ay maaaring kumilos sa pamamagitan ng protein sulfation, isang nababaligtad na post-translational modification na nakakaapekto sa function, stability, at localization ng maraming protina52,53,54. Sa katunayan, sa ilalim ng mga kondisyong pisyolohikal, humigit-kumulang 10% hanggang 25% ng maraming protina sa atay ay sulfylated53. Kinikilala ng parehong pag-aaral ang mabilis na pagkasira ng NaHS19,23 ngunit nakakagulat na sinasabi na "kinokontrol namin ang konsentrasyon ng NaHS sa inuming tubig sa pamamagitan ng pagpapalit nito araw-araw."23 Hindi sinasadyang sinabi ng isang pag-aaral na "Ang NaHS ay isang karaniwang donor ng H2S at karaniwang ginagamit sa klinikal na kasanayan upang palitan ang H2S mismo."18
Ipinapakita ng talakayan sa itaas na ang NaHS ay nawawala mula sa solusyon sa pamamagitan ng volatilization, oxidation at photolysis, at samakatuwid ay may ilang mungkahi upang mabawasan ang pagkawala ng H2S mula sa solusyon. Una, ang pagsingaw ng H2S ay nakasalalay sa interface ng gas-liquid13 at sa pH ng solusyon11; samakatuwid, upang mabawasan ang pagkawala ng singaw, ang leeg ng bote ng tubig ay maaaring gawing maliit hangga't maaari gaya ng nailarawan noon15,19, at ang pH ng tubig ay maaaring isaayos sa isang katanggap-tanggap na upper limit (ibig sabihin, 6.5–8.551) upang mabawasan ang pagkawala ng singaw11. Pangalawa, ang kusang oksihenasyon ng H2S ay nangyayari dahil sa mga epekto ng oxygen at ang pagkakaroon ng mga transition metal ions sa inuming tubig13, kaya ang deoxygenation ng inuming tubig na may argon o nitrogen44,45 at ang paggamit ng mga metal chelator37,47 ay maaaring mabawasan ang oksihenasyon ng mga sulfide. Pangatlo, upang maiwasan ang photodecomposition ng H2S, ang mga bote ng tubig ay maaaring balutin ng aluminum foil; Ang kasanayang ito ay naaangkop din sa mga materyales na sensitibo sa liwanag tulad ng streptozotocin55. Panghuli, ang mga inorganic sulfide salt (NaHS, Na2S, at CaS) ay maaaring ibigay sa pamamagitan ng gavage sa halip na tunawin sa inuming tubig gaya ng naiulat noon56,57,58; ipinakita ng mga pag-aaral na ang radioactive sodium sulfide na ibinibigay sa pamamagitan ng gavage sa mga daga ay mahusay na nasisipsip at ipinamamahagi sa halos lahat ng tisyu59. Sa ngayon, karamihan sa mga pag-aaral ay nagbigay ng mga inorganic sulfide salt sa pamamagitan ng intraperitoneal; gayunpaman, ang rutang ito ay bihirang gamitin sa mga klinikal na setting60. Sa kabilang banda, ang oral na ruta ang pinakakaraniwan at ginustong ruta ng pagbibigay sa mga tao61. Samakatuwid, inirerekomenda namin ang pagsusuri sa mga epekto ng mga donor ng H2S sa mga daga sa pamamagitan ng oral gavage.
Isang limitasyon ang pagsukat namin ng sulfide sa aqueous solution at serum gamit ang MB method. Kabilang sa mga pamamaraan para sa pagsukat ng sulfide ang iodine titration, spectrophotometry, electrochemical method (potentiometry, amperometry, coulometric method at amperometric method) at chromatography (gas chromatography at high-performance liquid chromatography), kung saan ang pinakakaraniwang ginagamit na pamamaraan ay ang MB spectrophotometric method62. Isang limitasyon ng MB method para sa pagsukat ng H2S sa mga biological sample ay sinusukat nito ang lahat ng sulfur-containing compounds at hindi ang free H2S63 dahil isinasagawa ito sa ilalim ng acidic na kondisyon, na nagreresulta sa pagkuha ng sulfur mula sa biological source64. Gayunpaman, ayon sa American Public Health Association, ang MB ang karaniwang pamamaraan para sa pagsukat ng sulfide sa tubig65. Samakatuwid, ang limitasyong ito ay hindi nakakaapekto sa aming pangunahing resulta sa kawalang-tatag ng mga solusyon na naglalaman ng NaHS. Bukod pa rito, sa aming pag-aaral, ang pagbawi ng mga sukat ng sulfide sa tubig at mga serum sample na naglalaman ng NaHS ay 91% at 93%, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga halagang ito ay naaayon sa mga naunang naiulat na saklaw (77–92)66, na nagpapahiwatig ng katanggap-tanggap na analytical precision42. Mahalagang tandaan na ginamit namin ang parehong lalaki at babaeng daga alinsunod sa mga alituntunin ng National Institutes of Health (NIH) upang maiwasan ang labis na pag-asa sa mga pag-aaral ng hayop na para lamang sa mga lalaki sa mga preclinical na pag-aaral67 at upang maisama ang parehong lalaki at babaeng daga hangga't maaari68. Ang puntong ito ay binigyang-diin ng iba69,70,71.
Bilang konklusyon, ang mga resulta ng pag-aaral na ito ay nagpapahiwatig na ang mga solusyon ng NaHS na inihanda mula sa inuming tubig ay hindi maaaring gamitin upang makabuo ng H2S dahil sa kanilang kawalang-tatag. Ang ganitong paraan ng pagbibigay ay maglalantad sa mga hayop sa hindi matatag at mas mababa kaysa sa inaasahang antas ng NaHS; samakatuwid, ang mga natuklasan ay maaaring hindi naaangkop sa mga tao.
Ang mga dataset na ginamit at/o sinuri sa kasalukuyang pag-aaral ay makukuha mula sa kaukulang may-akda kapag may makatwirang kahilingan.
Szabo, K. Timeline ng pananaliksik sa hydrogen sulfide (H2S): mula sa lason sa kapaligiran hanggang sa biyolohikal na tagapamagitan. Biochemistry and Pharmacology 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. at Kimura, H. Posibleng papel ng hydrogen sulfide bilang isang endogenous neuromodulator. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. at Papapetropoulos, A. Pisyolohikal na papel ng hydrogen sulfide sa mga selula, tisyu, at organo ng mammal. Mga Review sa Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB, at Kashfi, K. Umuusbong na pangako ng mga sistema ng paghahatid ng selula para sa nitric oxide at hydrogen sulfide: isang bagong panahon ng isinapersonal na medisina. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., et al. Ang pangmatagalang pagbibigay ng slow-release hydrogen sulfide donor ay maaaring makaiwas sa myocardial ischemia/reperfusion injury. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM at Hermann, A. Kinokontrol ng phosphorylation ng channel ng BK ang sensitibidad ng hydrogen sulfide (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM at Hermann, A. Pinahuhusay ng hydrogen sulfide ang aktibidad ng calcium-activated potassium (BK) channel sa mga selula ng tumor sa pituitary ng daga. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. Pinahuhusay ng hydrogen sulfide ang proteksiyon na epekto ng nitrite laban sa pinsala sa myocardial ischemia-reperfusion sa mga daga na may type 2 diabetic. Nitric Oxide 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., et al. Mga Uso sa kemistri ng donor ng H2S at ang epekto nito sa sakit sa puso. Antioxidants 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF, at Olson, KR (2012). Mga pasibong pagkawala ng hydrogen sulfide sa mga eksperimentong biyolohikal. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., et al. Mga aspektong kemikal ng mga sukat ng hydrogen sulfide sa mga sampol na pisyolohikal. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Pagtukoy ng ispektrofotometriko ng hydrogen sulfide sa natural na katubigan. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktikal na pagsasanay sa kemistri at biyolohiya ng hydrogen sulfide. “Mga Antioxidant.” Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).