Nauna naming iniulat na ang mga antas ng serum ng gut-derived tryptophan metabolite na indole-3-propionic acid (IPA) ay mas mababa sa mga pasyenteng may liver fibrosis. Sa pag-aaral na ito, sinuri namin ang transcriptome at DNA methylome sa mga napakataba na atay kaugnay ng mga antas ng serum IPA, pati na rin ang papel ng IPA sa pag-induce ng phenotypic inactivation ng mga hepatic stellate cells (HSCs) in vitro.
Kasama sa pag-aaral ang 116 na pasyenteng napakataba na walang type 2 diabetes mellitus (T2DM) (edad 46.8 ± 9.3 taon; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) na sumailalim sa bariatric surgery sa Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS). Ang mga antas ng circulating IPA ay sinukat sa pamamagitan ng liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), ang liver transcriptome analysis ay isinagawa sa pamamagitan ng total RNA sequencing, at ang DNA methylation analysis ay isinagawa gamit ang Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Ang mga human hepatic stellate cells (LX-2) ay ginamit para sa mga in vitro na eksperimento.
Ang mga antas ng IPA sa serum ay may kaugnayan sa ekspresyon ng mga gene na kasangkot sa mga apoptotic, mitophagic, at longevity pathway sa atay. Ang AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) gene ang pinakamarami at dominanteng interacting gene sa transcript ng atay at mga profile ng methylation ng DNA. Ang paggamot sa IPA ay nagdulot ng apoptosis, nabawasan ang mitochondrial respiration, at binago ang morphology ng cell at mitochondrial dynamics sa pamamagitan ng pag-modulate sa ekspresyon ng mga gene na kilala upang makontrol ang fibrosis, apoptosis, at survival ng mga LX-2 cells.
Kung pagsasama-samahin, sinusuportahan ng mga datos na ito na ang IPA ay may mga potensyal na therapeutic effect at maaaring magdulot ng apoptosis at ilipat ang HSC phenotype patungo sa isang inactive state, sa gayon ay pinalalawak ang posibilidad ng pagpigil sa liver fibrosis sa pamamagitan ng paggambala sa HSC activation at mitochondrial metabolism.
Ang paglaganap ng labis na katabaan at metabolic syndrome ay naiugnay sa pagtaas ng insidente ng metabolically associated fatty liver disease (MASLD); ang sakit ay nakakaapekto sa 25% hanggang 30% ng pangkalahatang populasyon [1]. Ang pangunahing bunga ng MASLD etiology ay ang liver fibrosis, isang dynamic na proseso na nailalarawan sa pamamagitan ng patuloy na akumulasyon ng fibrous extracellular matrix (ECM) [2]. Ang mga pangunahing selula na kasangkot sa liver fibrosis ay ang hepatic stellate cells (HSCs), na nagpapakita ng apat na kilalang phenotypes: quiescent, activated, inactivated, at senescent [3, 4]. Ang mga HSC ay maaaring ma-activate at mag-transdifferentiate mula sa isang quiescent form patungo sa proliferative fibroblast-like cells na may mataas na pangangailangan sa enerhiya, na may pagtaas ng expression ng α-smooth muscle actin (α-SMA) at type I collagen (Col-I) [5, 6]. Sa panahon ng liver fibrosis reversal, ang mga activated HSC ay inaalis sa pamamagitan ng apoptosis o inactivation. Kabilang sa mga prosesong ito ang downregulation ng mga fibrogenic gene at modulation ng mga prosurvival gene (tulad ng NF-κB at PI3K/Akt signaling pathways) [7, 8], pati na rin ang mga pagbabago sa mitochondrial dynamics at function [9].
Natuklasan na ang mga antas ng serum ng tryptophan metabolite na indole-3-propionic acid (IPA), na ginawa sa bituka, ay nabawasan sa mga sakit na metaboliko ng tao kabilang ang MASLD [10–13]. Ang IPA ay nauugnay sa paggamit ng dietary fiber, kilala sa mga antioxidant at anti-inflammatory effect nito, at pinapahina ang diet-induced non-alcoholic steatohepatitis (NASH) phenotype in vivo at in vitro [11–14]. Ang ilang ebidensya ay nagmula sa aming nakaraang pag-aaral, na nagpakita na ang mga antas ng serum IPA ay mas mababa sa mga pasyenteng may liver fibrosis kaysa sa mga pasyenteng napakataba na walang liver fibrosis sa Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Bukod pa rito, ipinakita namin na ang paggamot sa IPA ay maaaring mabawasan ang ekspresyon ng mga gene na mga klasikong marker ng cell adhesion, cell migration at hematopoietic stem cell activation sa isang human hepatic stellate cell (LX-2) model at isang potensyal na hepatoprotective metabolite [15]. Gayunpaman, nananatiling hindi malinaw kung paano nagdudulot ang IPA ng liver fibrosis regression sa pamamagitan ng pag-activate ng HSC apoptosis at mitochondrial bioenergetics.
Dito, ipinapakita namin na ang serum IPA ay nauugnay sa ekspresyon ng mga gene na mayaman sa apoptosis, mitophagy, at longevity pathways sa atay ng mga napakataba ngunit hindi type 2 diabetes (KOBS) na mga indibidwal. Bukod pa rito, natuklasan namin na ang IPA ay maaaring mag-udyok sa clearance at degradation ng mga activated hematopoietic stem cells (HSCs) sa pamamagitan ng inactivation pathway. Ang mga resultang ito ay nagpapakita ng isang nobelang papel para sa IPA, na ginagawa itong isang potensyal na therapeutic target upang itaguyod ang liver fibrosis regression.
Isang nakaraang pag-aaral sa KOBS cohort ang nagpakita na ang mga pasyenteng may liver fibrosis ay may mas mababang antas ng circulating IPA kumpara sa mga pasyenteng walang liver fibrosis [15]. Upang ibukod ang potensyal na confounding effect ng type 2 diabetes, kumuha kami ng 116 na obese na pasyente na walang type 2 diabetes (mean age ± SD: 46.8 ± 9.3 taon; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Talahanayan 1) mula sa patuloy na pag-aaral ng KOBS bilang populasyon ng pag-aaral [16]. Lahat ng kalahok ay nagbigay ng nakasulat na informed consent at ang protocol ng pag-aaral ay inaprubahan ng Ethics Committee ng North Savo County Hospital alinsunod sa Deklarasyon ng Helsinki (54/2005, 104/2008 at 27/2010).
Ang mga ispesimen ng biopsy sa atay ay nakuha sa panahon ng bariatric surgery at sinuri sa pamamagitan ng histolohiya ng mga bihasang pathologist ayon sa mga naunang inilarawang pamantayan [17, 18]. Ang mga pamantayan sa pagtatasa ay nakabuod sa Supplementary Table S1 at nailarawan na noon [19].
Ang mga sample ng fasting serum ay sinuri gamit ang untargeted liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) para sa metabolomics analysis (n = 116). Ang mga sample ay sinuri gamit ang isang UHPLC-qTOF-MS system (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) gaya ng nailarawan dati19. Ang pagkilala sa isopropyl alcohol (IPA) ay batay sa retention time at paghahambing ng MS/MS spectrum sa mga purong pamantayan. Ang intensity ng signal ng IPA (peak area) ay isinaalang-alang sa lahat ng karagdagang pagsusuri [20].
Isinagawa ang whole liver RNA sequencing gamit ang Illumina HiSeq 2500 at ang datos ay paunang naproseso gaya ng nailarawan noon [19, 21, 22]. Nagsagawa kami ng naka-target na differential expression analysis ng mga transcript na nakakaapekto sa mitochondrial function/biogenesis gamit ang 1957 genes na napili mula sa MitoMiner 4.0 database [23]. Isinagawa ang liver DNA methylation analysis gamit ang Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) gamit ang parehong metodolohiya gaya ng nailarawan noon [24, 25].
Ang mga human hepatic stellate cells (LX-2) ay mabait na ibinigay ni Prof. Stefano Romeo at kinultura at pinanatili sa DMEM/F12 medium (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Upang mapili ang working dose ng IPA, ang mga LX-2 cells ay ginamot gamit ang iba't ibang konsentrasyon ng IPA (10 μM, 100 μM at 1 mM; Sigma, 220027) sa DMEM/F12 medium sa loob ng 24 oras. Bukod pa rito, upang siyasatin ang kakayahan ng IPA na i-inactivate ang mga HSC, ang mga LX-2 cells ay ginamot gamit ang 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) at 1 mM IPA sa serum-free medium sa loob ng 24 oras. Para sa mga kaukulang kontrol ng sasakyan, 4 nM HCL na naglalaman ng 0.1% BSA ang ginamit para sa paggamot ng TGF-β1 at 0.05% DMSO ang ginamit para sa paggamot ng IPA, at pareho itong ginamit nang magkasama para sa kombinasyong paggamot.
Ang apoptosis ay tinasa gamit ang FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit na may 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) ayon sa mga tagubilin ng tagagawa. Sa madaling salita, ang LX-2 (1 × 105 cells/well) ay kinultura magdamag sa 12-well plates at pagkatapos ay ginamot gamit ang maraming dosis ng IPA o IPA at TGF-β1. Kinabukasan, ang mga lumulutang at nakadikit na cell ay kinolekta, nilagyan ng trypsin, hinugasan gamit ang PBS, muling isinalin sa Annexin V binding buffer, at in-incubate gamit ang FITC-Annexin V at 7-AAD sa loob ng 15 minuto.
Ang mitochondria sa mga buhay na selula ay kinulayan para sa oxidative activity gamit ang Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Para sa mga MTR assay, ang mga LX-2 cell ay in-incubate sa pantay na densidad kasama ang IPA at TGF-β1. Pagkatapos ng 24 na oras, ang mga buhay na selula ay in-trypsinize, hinugasan gamit ang PBS, at pagkatapos ay in-incubate gamit ang 100 μM MTR sa serum-free medium sa 37 °C sa loob ng 20 minuto gaya ng nailarawan dati [26]. Para sa pagsusuri ng morphology ng live cell, ang laki ng cell at cytoplasmic complexity ay sinuri gamit ang mga parameter ng forward scatter (FSC) at side scatter (SSC), ayon sa pagkakabanggit.
Ang lahat ng datos (30,000 kaganapan) ay nakuha gamit ang NovoCyte Quanteon (Agilent) at sinuri gamit ang NovoExpress® 1.4.1 o FlowJo V.10 software.
Ang oxygen consumption rate (OCR) at extracellular acidification rate (ECAR) ay sinukat nang real time gamit ang isang Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) na may Seahorse XF Cell Mito Stress ayon sa mga tagubilin ng gumawa. Sa madaling salita, 2 × 104 LX-2 cells/well ang itinanim sa mga XF96 cell culture plates. Pagkatapos ng overnight incubation, ang mga cell ay ginamot gamit ang isopropanol (IPA) at TGF-β1 (Mga Karagdagang Paraan 1). Ang pagsusuri ng datos ay isinagawa gamit ang Seahorse XF Wave software, na kinabibilangan ng Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Mula rito, isang Bioenergetic Health Index (BHI) ang kinalkula [27].
Ang kabuuang RNA ay na-transcribe sa cDNA. Para sa mga partikular na pamamaraan, tingnan ang sanggunian [15]. Ang mga antas ng Human 60S ribosomal acidic protein P0 (RPLP0) at cyclophilin A1 (PPIA) mRNA ay ginamit bilang mga constitutive gene control. Ang QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, The Netherlands) ay ginamit kasama ang TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) o ang Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), at ang relative gene expression fold ay kinalkula gamit ang comparative Ct value cycling parameters (ΔΔCt) at ang ∆∆Ct method. Ang mga detalye ng mga primer ay ibinibigay sa Supplementary Tables S2 at S3.
Ang Nuclear DNA (ncDNA) at mitochondrial DNA (mtDNA) ay kinuha gamit ang DNeasy blood and tissue kit (Qiagen) gaya ng nailarawan noon [28]. Ang relatibong dami ng mtDNA ay kinalkula sa pamamagitan ng pagkalkula ng ratio ng bawat target na rehiyon ng mtDNA sa geometric mean ng tatlong rehiyon ng nuclear DNA (mtDNA/ncDNA), gaya ng nakadetalye sa Supplementary Methods 2. Ang mga detalye ng mga primer para sa mtDNA at ncDNA ay ibinibigay sa Supplementary Table S4.
Ang mga buhay na selula ay kinulayan gamit ang Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) upang mailarawan ang mga intercellular at intracellular mitochondrial network. Ang mga LX-2 cell (1 × 104 cells/well) ay kinultura sa mga glass slide sa kaukulang glass-bottomed culture plates (Ibidi GmbH, Martinsried, Germany). Pagkatapos ng 24 oras, ang mga buhay na LX-2 cell ay in-incubate gamit ang 100 μM MTR sa loob ng 20 minuto sa 37 °C at ang mga cell nuclei ay kinulayan gamit ang DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) gaya ng nailarawan noon [29]. Ang mga mitochondrial network ay nakita gamit ang isang Zeiss Axio Observer inverted microscope (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) na nilagyan ng Zeiss LSM 800 confocal module sa 37 °C sa isang humidified na kapaligiran na may 5% CO2 gamit ang isang 63×NA 1.3 objective. Kumuha kami ng sampung Z-series na imahe para sa bawat uri ng sample. Ang bawat Z-series ay naglalaman ng 30 seksyon, bawat isa ay may kapal na 9.86 μm. Para sa bawat sample, ang mga imahe ng sampung magkakaibang larangan ng pagtingin ay nakuha gamit ang ZEN 2009 software (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany), at ang mitochondrial morphology analysis ay isinagawa gamit ang ImageJ software (v1.54d) [30, 31] ayon sa mga parameter na nakadetalye sa Supplementary Methods 3.
Ang mga selula ay inayos gamit ang 2% glutaraldehyde sa 0.1 M phosphate buffer, na sinundan ng pag-ayos gamit ang 1% osmium tetroxide solution (Sigma Aldrich, MO, USA), unti-unting inalis sa tubig gamit ang acetone (Merck, Darmstadt, Germany), at sa huli ay inilagay sa epoxy resin. Ang mga ultrathin na seksyon ay inihanda at kinulayan gamit ang 1% uranyl acetate (Merck, Darmstadt, Germany) at 1% lead citrate (Merck, Darmstadt, Germany). Ang mga ultrastructural na imahe ay nakuha gamit ang isang JEM 2100F EXII transmission electron microscope (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) sa isang accelerating voltage na 80 kV.
Ang morpolohiya ng mga selulang LX-2 na ginamot gamit ang IPA sa loob ng 24 na oras ay sinuri gamit ang phase-contrast microscopy sa 50x magnification gamit ang isang Zeiss inverted light microscope (Zeiss Axio Vert.A1 at AxioCam MRm, Jena, Germany).
Ang mga klinikal na datos ay ipinahayag bilang mean ± standard deviation o median (interquartile range: IQR). Ginamit ang one-way analysis of variance (continuous variables) o χ² test (categorical variables) upang ihambing ang mga pagkakaiba sa pagitan ng tatlong grupo ng pag-aaral. Ginamit ang false positive rate (FDR) upang itama ang multiple testing, at ang mga gene na may FDR < 0.05 ay itinuturing na statistically significant. Ginamit ang Spearman correlation analysis upang iugnay ang CpG DNA methylation sa IPA signal intensity, na may mga nominal p values ​​​​(p < 0.05) na naiulat.
Isinagawa ang pagsusuri ng landas gamit ang isang web-based gene set analysis tool (WebGestalt) para sa 268 transcript (nominal p < 0.01), 119 mitochondria-associated transcripts (nominal p < 0.05), at 4350 CpGs mula sa 3093 liver transcripts na nauugnay sa mga antas ng circulating serum IPA. Ang malayang makukuhang Venny DB (bersyon 2.1.0) tool ay ginamit upang mahanap ang magkakapatong na mga gene, at ang StringDB (bersyon 11.5) ay ginamit upang mailarawan ang mga interaksyon ng protina-protina.
Para sa eksperimentong LX-2, ang mga sample ay sinubukan para sa normalidad gamit ang D'Agostino-Pearson test. Ang datos ay nakuha mula sa hindi bababa sa tatlong biological replicates at isinailalim sa one-way ANOVA gamit ang Bonferroni post hoc test. Ang p-value na mas mababa sa 0.05 ay itinuturing na statistically significant. Ang datos ay ipinakita bilang mean ± SD, at ang bilang ng mga eksperimento ay ipinahiwatig sa bawat pigura. Ang lahat ng pagsusuri at graph ay isinagawa gamit ang GraphPad Prism 8 statistical software para sa Windows (GraphPad Software Inc., bersyon 8.4.3, San Diego, USA).
Una, sinuri namin ang kaugnayan ng mga antas ng serum IPA sa mga transcript ng atay, buong katawan, at mitochondrial. Sa kabuuang profile ng transcript, ang pinakamalakas na gene na nauugnay sa mga antas ng serum IPA ay MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3); sa profile ng transcript na nauugnay sa mitochondria, ang pinakamalakas na nauugnay na gene ay AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Karagdagang file 1 at Karagdagang file 2).
Pagkatapos ay sinuri namin ang mga global transcript (n = 268; p < 0.01) at mga mitochondria-associated transcript (n = 119; p < 0.05), na sa huli ay natukoy ang apoptosis bilang ang pinakamahalagang canonical pathway (p = 0.0089). Para sa mga mitochondrial transcript na nauugnay sa mga antas ng serum IPA, nagtuon kami sa apoptosis (FDR = 0.00001), mitophagy (FDR = 0.00029), at mga TNF signaling pathway (FDR = 0.000006) (Larawan 1A, Talahanayan 2, at Mga Supplementary Figure 1A-B).
Pagsusuring nagsasapawan ng pandaigdigan, mitochondria-associated transcripts, at DNA methylation sa atay ng tao kaugnay ng mga antas ng serum IPA. Ang A ay kumakatawan sa 268 pandaigdigang transcript, 119 mitochondria-associated transcripts, at DNA methylated transcripts na naka-map sa 3092 CpG sites na nauugnay sa mga antas ng serum IPA (mga p value na < 0.01 para sa mga pandaigdigang transcript at DNA methylated, at mga p value na < 0.05 para sa mga mitochondrial transcript). Ang mga pangunahing nagsasapawan na transcript ay ipinapakita sa gitna (AKT1 at YKT6). B Ang mapa ng interaksyon ng 13 gene na may pinakamataas na marka ng interaksyon (0.900) sa iba pang mga gene ay binuo mula sa 56 na nagsasapawan na gene (rehiyon ng itim na linya) na makabuluhang nauugnay sa mga antas ng serum IPA gamit ang online tool na StringDB. Berde: Mga gene na naka-map sa Gene Ontology (GO) cellular component: mitochondria (GO:0005739). Ang AKT1 ang protina na may pinakamataas na marka (0.900) para sa mga interaksyon sa iba pang mga protina batay sa datos (batay sa text mining, mga eksperimento, mga database, at co-expression). Ang mga network node ay kumakatawan sa mga protina, at ang mga gilid ay kumakatawan sa mga koneksyon sa pagitan ng mga protina.
Dahil ang mga metabolite ng gut microbiota ay kayang i-regulate ang epigenetic composition sa pamamagitan ng DNA methylation [32], sinuri namin kung ang mga antas ng serum IPA ay nauugnay sa methylation ng DNA sa atay. Natuklasan namin na ang dalawang pangunahing methylation site na nauugnay sa mga antas ng serum IPA ay malapit sa proline-serine-rich region 3 (C19orf55) at heat shock protein family B (small) member 6 (HSPB6) (Karagdagang file 3). Ang DNA methylation ng 4350 CpG (p < 0.01) ay may kaugnayan sa mga antas ng serum IPA at pinayaman sa mga longevity regulatory pathway (p = 0.006) (Figure 1A, Table 2, at Supplementary Figure 1C).
Upang maunawaan ang mga mekanismong biyolohikal na pinagbabatayan ng mga kaugnayan sa pagitan ng mga antas ng serum IPA, mga pandaigdigang transcript, mga transcript na nauugnay sa mitochondria, at DNA methylation sa atay ng tao, nagsagawa kami ng isang overlap analysis ng mga gene na natukoy sa nakaraang pathway analysis (Figure 1A). Ang mga resulta ng pathway enrichment analysis ng 56 na magkakapatong na gene (sa loob ng itim na linya sa Figure 1A) ay nagpakita na ang apoptosis pathway (p = 0.00029) ay nagtampok ng dalawang gene na karaniwan sa tatlong pagsusuri: AKT1 at YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog), tulad ng ipinapakita sa Venn diagram (Karagdagang Larawan 2 at Larawan 1A). Kapansin-pansin, natuklasan namin na ang AKT1 (cg19831386) at YKT6 (cg24161647) ay positibong nauugnay sa mga antas ng serum IPA (Karagdagang file 3). Upang matukoy ang mga potensyal na interaksyon ng protina sa pagitan ng mga produkto ng gene, pumili kami ng 13 gene na may pinakamataas na common region score (0.900) sa 56 na magkakapatong na gene bilang input at bumuo ng isang interaction map. Ayon sa antas ng kumpiyansa (marginal confidence), ang gene na AKT1 na may pinakamataas na iskor (0.900) ay nasa itaas (Larawan 1B).
Batay sa pagsusuri ng pathway, natuklasan namin na ang apoptosis ang pangunahing pathway, kaya sinuri namin kung ang paggamot ng IPA ay makakaapekto sa apoptosis ng mga HSC in vitro. Nauna naming ipinakita na ang iba't ibang dosis ng IPA (10 μM, 100 μM, at 1 mM) ay hindi nakakalason sa mga selula ng LX-2 [15]. Ipinakita ng pag-aaral na ito na ang paggamot ng IPA sa 10 μM at 100 μM ay nagpapataas ng bilang ng mga mabubuhay at necrotic na selula. Gayunpaman, kumpara sa control group, ang cell viability ay bumaba sa 1 mM na konsentrasyon ng IPA, habang ang cell necrosis rate ay nanatiling hindi nagbabago (Larawan 2A, B). Susunod, upang mahanap ang pinakamainam na konsentrasyon upang mag-induce ng apoptosis sa mga selula ng LX-2, sinubukan namin ang 10 μM, 100 μM, at 1 mM IPA sa loob ng 24 na oras (Larawan 2A-E at Supplementary Figure 3A-B). Kapansin-pansin, binawasan ng IPA 10 μM at 100 μM ang apoptosis rate (%), gayunpaman, pinataas ng IPA 1 mM ang late apoptosis at apoptosis rate (%) kumpara sa kontrol at samakatuwid ay pinili para sa mga karagdagang eksperimento (Mga Larawan 2A–D).
Ang IPA ay nagdudulot ng apoptosis ng mga selulang LX-2. Ginamit ang Annexin V at 7-AAD double staining method upang masukat ang apoptotic rate at morphology ng selula sa pamamagitan ng flow cytometry. Ang mga selulang BA ay in-incubate gamit ang 10 μM, 100 μM at 1 mM IPA sa loob ng 24 oras o gamit ang F–H TGF-β1 (5 ng/ml) at 1 mM IPA sa serum-free medium sa loob ng 24 oras. A: mga buhay na selula (Annexin V -/ 7AAD-); B: mga necrotic na selula (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: maaga (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: huli (Annexin V+/7AAD.+); E, H: porsyento ng kabuuang maaga at huling apoptotic na selula sa apoptotic rate (%). Ang datos ay ipinahayag bilang mean ± SD, n = 3 independent experiments. Ang mga istatistikal na paghahambing ay isinagawa gamit ang one-way ANOVA na may Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Gaya ng naipakita na namin dati, ang 5 ng/ml TGF-β1 ay maaaring mag-udyok ng HSC activation sa pamamagitan ng pagpapataas ng expression ng classical marker genes [15]. Ang mga LX-2 cells ay ginamot gamit ang 5 ng/ml TGF-β1 at 1 mM IPA nang sabay (Fig. 2E–H). Ang paggamot ng TGF-β1 ay hindi nagpabago sa apoptosis rate, gayunpaman, ang co-treatment ng IPA ay nagpataas ng late apoptosis at apoptosis rate (%) kumpara sa paggamot ng TGF-β1 (Fig. 2E–H). Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang 1 mM IPA ay maaaring magsulong ng apoptosis sa mga LX-2 cells nang hiwalay sa TGF-β1 induction.
Mas sinuri pa namin ang epekto ng IPA sa mitochondrial respiration sa mga LX-2 cells. Ipinakita ng mga resulta na ang 1 mM IPA ay nagpababa sa mga parameter ng oxygen consumption rate (OCR): non-mitochondrial respiration, basal at maximal respiration, proton leak at ATP production kumpara sa control group (Figure 3A, B), habang ang bioenergetic health index (BHI) ay hindi nagbago.
Binabawasan ng IPA ang mitochondrial respiration sa mga selula ng LX-2. Ang mitochondrial respiration curve (OCR) ay ipinapakita bilang mga parameter ng mitochondrial respiration (non-mitochondrial respiration, basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP generation, SRC at BHI). Ang mga selula A at B ay in-incubate gamit ang 10 μM, 100 μM at 1 mM IPA sa loob ng 24 oras, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga selula C at D ay in-incubate gamit ang TGF-β1 (5 ng/ml) at 1 mM IPA sa serum-free medium sa loob ng 24 oras, ayon sa pagkakabanggit. Lahat ng mga sukat ay na-normalize sa nilalaman ng DNA gamit ang CyQuant kit. BHI: bioenergetic health index; SRC: respiratory reserve capacity; OCR: oxygen consumption rate. Ang datos ay ipinapakita bilang mean ± standard deviation (SD), n = 5 independent experiments. Ang mga paghahambing sa istatistika ay isinagawa gamit ang one-way ANOVA at Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; at ***p < 0.001
Upang makakuha ng mas komprehensibong pag-unawa sa epekto ng IPA sa bioenergetic profile ng mga TGF-β1-activated LX-2 cells, sinuri namin ang mitochondrial oxidative phosphorylation sa pamamagitan ng OCR (Fig. 3C,D). Ipinakita ng mga resulta na ang paggamot ng TGF-β1 ay maaaring makabawas sa maximum respiration, respiratory reserve capacity (SRC) at BHI kumpara sa control group (Fig. 3C,D). Bukod pa rito, ang kombinasyon ng paggamot ay nakabawas sa basal respiration, proton leak at produksyon ng ATP, ngunit ang SRC at BHI ay mas mataas nang malaki kaysa sa mga ginamot gamit ang TGF-β1 (Fig. 3C,D).
Isinagawa rin namin ang "Cellular Energy Phenotype Test" na ibinigay ng Seahorse software (Supplementary Fig. 4A–D). Gaya ng ipinapakita sa Supplementary Fig. 3B, parehong nabawasan ang metabolic potentials ng OCR at ECAR pagkatapos ng paggamot ng TGF-β1, gayunpaman, walang nakitang pagkakaiba sa mga grupo ng paggamot na may kombinasyon at IPA kumpara sa control group. Bukod pa rito, parehong bumaba ang basal at stress levels ng OCR pagkatapos ng paggamot na may kombinasyon at IPA kumpara sa control group (Supplementary Fig. 4C). Kapansin-pansin, isang katulad na pattern ang naobserbahan sa combination therapy, kung saan walang nakitang pagbabago sa basal at stress levels ng ECAR kumpara sa paggamot na may TGF-β1 (Supplementary Fig. 4C). Sa mga HSC, ang pagbawas sa mitochondrial oxidative phosphorylation at ang kakayahan ng paggamot na may kombinasyon na ibalik ang SCR at BHI pagkatapos ng pagkakalantad sa paggamot na may TGF-β1 ay hindi nagpabago sa metabolic potential (OCR at ECAR). Kung pagsasama-samahin, ipinapahiwatig ng mga resultang ito na maaaring mabawasan ng IPA ang bioenergetics sa mga HSC, na nagmumungkahi na ang IPA ay maaaring magdulot ng mas mababang energetic profile na maglilipat sa HSC phenotype patungo sa inactivation (Supplementary Figure 4D).
Ang epekto ng IPA sa mitochondrial dynamics ay siniyasat gamit ang three-dimensional quantification ng mitochondrial morphology at network connections pati na rin ang MTR staining (Figure 4 at Supplementary Figure 5). Ipinapakita ng Figure 4 na, kumpara sa control group, ang paggamot ng TGF-β1 ay nagbawas sa mean surface area, branch number, total branch length, at branch junction number (Figure 4A at B) at binago ang proporsyon ng mitochondria mula spherical hanggang intermediate morphology (Figure 4C). Tanging ang paggamot ng IPA lamang ang nagbawas sa mean mitochondrial volume at binago ang proporsyon ng mitochondria mula spherical hanggang intermediate morphology kumpara sa control group (Figure 4A). Sa kabaligtaran, ang sphericity, mean branch length, at mitochondrial activity na tinasa ng mitochondrial membrane potential-dependent MTR (Figure 4A at E) ay nanatiling hindi nagbabago at ang mga parameter na ito ay hindi naiiba sa pagitan ng mga grupo. Kung pagsasama-samahin, ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang paggamot ng TGF-β1 at IPA ay tila nagmo-modulate sa hugis at laki ng mitochondrial pati na rin ang network complexity sa mga buhay na LX-2 cells.
Binabago ng IPA ang mitochondrial dynamics at mitochondrial DNA abundance sa mga LX-2 cells. A. Mga representatibong confocal image ng mga live LX-2 cells na in-incubate gamit ang TGF-β1 (5 ng/ml) at 1 mM IPA sa loob ng 24 oras sa serum-free medium na nagpapakita ng mga mitochondrial network na kinulayan ng Mitotracker™ Red CMXRos at mga nuclei na kinulayan ng asul gamit ang DAPI. Lahat ng datos ay naglalaman ng hindi bababa sa 15 na imahe bawat grupo. Kumuha kami ng 10 Z-stack images para sa bawat uri ng sample. Ang bawat Z-axis sequence ay naglalaman ng 30 slices, bawat isa ay may kapal na 9.86 μm. Scale bar: 10 μm. B. Mga representatibong object (mitochondria lamang) na kinilala sa pamamagitan ng paglalapat ng adaptive thresholding sa imahe. Isinagawa ang quantitative analysis at paghahambing ng mga koneksyon sa mitochondrial morphological network para sa lahat ng cell sa bawat grupo. C. Dalas ng mga ratio ng hugis ng mitochondrial. Ang mga halagang malapit sa 0 ay nagpapahiwatig ng mga spherical na hugis, at ang mga halagang malapit sa 1 ay nagpapahiwatig ng mga filamentous na hugis. D Ang nilalaman ng Mitochondrial DNA (mtDNA) ay natukoy gaya ng inilarawan sa Mga Materyales at Paraan. Ang pagsusuri ng E Mitotracker™ Red CMXRos ay isinagawa sa pamamagitan ng flow cytometry (30,000 kaganapan) gaya ng inilarawan sa Materials and Methods. Ang datos ay ipinakita bilang mean ± SD, n = 3 independent experiments. Ang mga paghahambing sa istatistika ay isinagawa gamit ang one-way ANOVA at Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Pagkatapos ay sinuri namin ang nilalaman ng mtDNA sa mga selula ng LX-2 bilang isang tagapagpahiwatig ng bilang ng mitochondrial. Kung ikukumpara sa control group, ang nilalaman ng mtDNA ay tumaas sa grupong ginamot ng TGF-β1 (Larawan 4D). Kung ikukumpara sa grupong ginamot ng TGF-β1, ang nilalaman ng mtDNA ay nabawasan sa grupong ginamot ng kombinasyon (Larawan 4D), na nagmumungkahi na maaaring bawasan ng IPA ang nilalaman ng mtDNA at posibleng ang bilang ng mitochondrial pati na rin ang mitochondrial respiration (Larawan 3C). Bukod dito, tila binawasan ng IPA ang nilalaman ng mtDNA sa kombinasyong paggamot ngunit hindi nakakaapekto sa aktibidad ng mitochondrial na pinamagitan ng MTR (Mga Larawan 4A–C).
Sinuri namin ang kaugnayan ng IPA sa mga antas ng mRNA ng mga gene na nauugnay sa fibrosis, apoptosis, survival, at mitochondrial dynamics sa mga selula ng LX-2 (Larawan 5A–D). Kung ikukumpara sa control group, ang grupong ginamot ng TGF-β1 ay nagpakita ng pagtaas ng ekspresyon ng mga gene tulad ng collagen type I α2 chain (COL1A2), α-smooth muscle actin (αSMA), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), tissue inhibitor ng metalloproteinase 1 (TIMP1), at dynamin 1-like gene (DRP1), na nagpapahiwatig ng pagtaas ng fibrosis at activation. Bukod pa rito, kung ikukumpara sa control group, ang paggamot ng TGF-β1 ay nagpababa ng mga antas ng mRNA ng nuclear pregnane X receptor (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitor ng B-cell α, enhancer ng nuclear factor κ gene light peptide (NFκB1A), at inhibitor ng nuclear factor κB kinase subunit β (IKBKB) (Larawan 5A–D). Kung ikukumpara sa paggamot ng TGF-β1, ang kombinasyon ng paggamot gamit ang TGF-β1 at IPA ay nagpababa sa ekspresyon ng COL1A2 at MMP2, ngunit nagpataas sa antas ng mRNA ng PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, at IKBKB. Ang paggamot ng IPA ay makabuluhang nagpababa sa ekspresyon ng MMP2, Bcl-2-associated protein X (BAX), AKT1, optic atrophy protein 1 (OPA1), at mitochondrial fusion protein 2 (MFN2), samantalang ang ekspresyon ng CASP8, NFκB1A, NFκB1B, at IKBKB ay tumaas kumpara sa control group. Gayunpaman, walang nakitang pagkakaiba sa ekspresyon ng caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), mitochondrial fusion protein 1 (MFN1), at fission protein 1 (FIS1). Sa kabuuan, iminumungkahi ng mga resultang ito na ang paggamot ng IPA ay nagmo-modulate sa ekspresyon ng mga gene na nauugnay sa fibrosis, apoptosis, survival, at mitochondrial dynamics. Iminumungkahi ng aming datos na ang paggamot ng IPA ay nagbabawas ng fibrosis sa mga selula ng LX-2; kasabay nito, pinasisigla nito ang survival sa pamamagitan ng paglilipat ng phenotype patungo sa inactivation.
Binabago ng IPA ang ekspresyon ng mga gene na fibroblast, apoptotic, viability, at mitochondrial dynamics sa mga selula ng LX-2. Ipinapakita ng mga histogram ang ekspresyon ng mRNA kaugnay ng endogenous control (RPLP0 o PPIA) pagkatapos ma-induce ang mga selula ng LX-2 gamit ang TGF-β1 at IPA sa serum-free medium sa loob ng 24 oras. Ang A ay nagpapahiwatig ng mga fibroblast, ang B ay nagpapahiwatig ng mga apoptotic cell, ang C ay nagpapahiwatig ng mga surviving cell, at ang D ay nagpapahiwatig ng ekspresyon ng gene na mitochondrial dynamics. Ang datos ay ipinapakita bilang mean ± standard deviation (SD), n = 3 independent experiments. Ang mga paghahambing sa istatistika ay isinagawa gamit ang one-way ANOVA at Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Pagkatapos, ang mga pagbabago sa laki ng selula (FSC-H) at cytoplasmic complexity (SSC-H) ay tinasa sa pamamagitan ng flow cytometry (Larawan 6A,B), at ang mga pagbabago sa morpolohiya ng selula pagkatapos ng paggamot ng IPA ay tinasa sa pamamagitan ng transmission electron microscopy (TEM) at phase contrast microscopy (Karagdagang Larawan 6A-B). Gaya ng inaasahan, ang mga selula sa grupong ginamot ng TGF-β1 ay lumaki ang laki kumpara sa control group (Larawan 6A,B), na nagpapakita ng klasikong paglawak ng rough endoplasmic reticulum (ER*) at phagolysosomes (P), na nagpapahiwatig ng hematopoietic stem cell (HSC) activation (Karagdagang Larawan 6A). Gayunpaman, kumpara sa grupong ginamot ng TGF-β1, ang laki ng selula, cytoplasmic complexity (Larawan 6A,B), at nilalaman ng ER* ay nabawasan sa grupong ginamot ng kombinasyon ng TGF-β1 at IPA (Karagdagang Larawan 6A). Bukod pa rito, binawasan ng paggamot ng IPA ang laki ng selula, cytoplasmic complexity (Mga Larawan 6A,B), nilalaman ng P at ER* (Karagdagang Larawan 6A) kumpara sa control group. Bukod pa rito, ang nilalaman ng mga apoptotic cell ay tumaas pagkatapos ng 24 na oras ng paggamot gamit ang IPA kumpara sa control group (mga puting arrow, Supplementary Fig. 6B). Sa kabuuan, iminumungkahi ng mga resultang ito na ang 1 mM IPA ay maaaring magpasigla ng HSC apoptosis at baligtarin ang mga pagbabago sa mga morphological parameter ng cell na dulot ng TGF-β1, sa gayon ay kinokontrol ang laki at complexity ng cell, na maaaring nauugnay sa HSC inactivation.
Binabago ng IPA ang laki ng selula at ang cytoplasmic complexity sa mga selulang LX-2. Mga representatibong larawan ng pagsusuri ng flow cytometry. Gumamit ang pagsusuri ng isang gating strategy na partikular para sa mga selulang LX-2: SSC-A/FSC-A upang tukuyin ang populasyon ng selula, FSC-H/FSC-A upang matukoy ang mga doublet, at SSC-H/FSC-H para sa pagsusuri ng laki at complexity ng selula. Ang mga selula ay in-incubate gamit ang TGF-β1 (5 ng/ml) at 1 mM IPA sa serum-free medium sa loob ng 24 na oras. Ang mga selulang LX-2 ay ipinamahagi sa ibabang kaliwang quadrant (SSC-H-/FSC-H-), itaas na kaliwang quadrant (SSC-H+/FSC-H-), ibabang kanang quadrant (SSC-H-/FSC-H+), at itaas na kanang quadrant (SSC-H+/FSC-H+) para sa pagsusuri ng laki ng selula at cytoplasmic complexity. B. Ang morpolohiya ng selula ay sinuri sa pamamagitan ng flow cytometry gamit ang FSC-H (forward scatter, laki ng selula) at SSC-H (side scatter, cytoplasmic complexity) (30,000 kaganapan). Ang datos ay ipinakita bilang mean ± SD, n = 3 independent experiments. Ang mga paghahambing sa istatistika ay isinagawa gamit ang one-way ANOVA at Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 at ****p < 0.0001
Ang mga metabolite ng bituka tulad ng IPA ay naging mainit na paksa ng pananaliksik, na nagmumungkahi na maaaring may mga bagong target na matuklasan sa gut microbiota. Kaya naman kawili-wili na ang IPA, isang metabolite na aming iniugnay sa fibrosis ng atay sa mga tao [15], ay ipinakita na isang potensyal na anti-fibrotic compound sa mga modelo ng hayop [13, 14]. Dito, ipinapakita namin sa unang pagkakataon ang isang kaugnayan sa pagitan ng serum IPA at global liver transcriptomics at DNA methylation sa mga napakataba na indibidwal na walang type 2 diabetes (T2D), na nagtatampok ng apoptosis, mitophagy at mahabang buhay, pati na rin ang isang posibleng kandidatong gene na AKT1 na kumokontrol sa homeostasis ng atay. Ang isa pang bagong bagay sa aming pag-aaral ay ang ipinakita namin ang interaksyon ng paggamot ng IPA sa apoptosis, morphology ng cell, mitochondrial bioenergetics at dynamics sa mga selula ng LX-2, na nagpapahiwatig ng isang mas mababang spectrum ng enerhiya na nagbabago sa phenotype ng HSC patungo sa inactivation, na ginagawang potensyal na kandidato ang IPA para sa pagpapabuti ng fibrosis ng atay.
Natuklasan namin na ang apoptosis, mitophagy, at longevity ang pinakamahalagang canonical pathways na pinayaman sa mga gene sa atay na nauugnay sa circulating serum IPA. Ang pagkagambala sa mitochondrial quality control (MQC) system ay maaaring humantong sa mitochondrial dysfunction, mitophagy, at apoptosis, sa gayon ay nagtataguyod ng paglitaw ng MASLD[33, 34]. Samakatuwid, maaari naming isipin na ang IPA ay maaaring kasangkot sa pagpapanatili ng cell dynamics at mitochondrial integrity sa pamamagitan ng apoptosis, mitophagy, at longevity sa atay. Ipinakita ng aming datos na dalawang gene ang karaniwan sa tatlong assays: YKT6 at AKT1. Mahalagang tandaan na ang YKT6 ay isang SNARE protein na kasangkot sa proseso ng cell membrane fusion. Ito ay gumaganap ng papel sa autophagy at mitophagy sa pamamagitan ng pagbuo ng isang initiation complex na may STX17 at SNAP29 sa autophagosome, sa gayon ay nagtataguyod ng fusion ng mga autophagosome at lysosome[35]. Bukod dito, ang pagkawala ng function ng YKT6 ay nagreresulta sa kapansanan sa mitophagy[36], habang ang upregulation ng YKT6 ay nauugnay sa pag-unlad ng hepatocellular carcinoma (HCC), na nagpapakita ng pagtaas ng cell survival[37]. Sa kabilang banda, ang AKT1 ang pinakamahalagang interacting gene at may mahalagang papel sa mga sakit sa atay, kabilang ang PI3K/AKT signaling pathway, cell cycle, cell migration, proliferation, focal adhesion, mitochondrial function, at collagen secretion[38–40]. Ang activated PI3K/AKT signaling pathway ay maaaring mag-activate ng hematopoietic stem cells (HSCs), na siyang mga selulang responsable sa produksyon ng extracellular matrix (ECM), at ang dysregulation nito ay maaaring mag-ambag sa paglitaw at pag-unlad ng liver fibrosis[40]. Bukod pa rito, ang AKT ay isa sa mga pangunahing cell survival factor na pumipigil sa p53-dependent cell apoptosis, at ang AKT activation ay maaaring nauugnay sa pagsugpo ng liver cell apoptosis[41, 42]. Ang mga nakuhang resulta ay nagmumungkahi na ang IPA ay maaaring kasangkot sa liver mitochondria-associated apoptosis sa pamamagitan ng pag-apekto sa desisyon ng mga hepatocytes sa pagitan ng pagpasok sa apoptosis o survival. Ang mga epektong ito ay maaaring kinokontrol ng AKT at/o YKT6 candidate genes, na mahalaga para sa liver homeostasis.
Ipinakita ng aming mga resulta na ang 1 mM IPA ay nag-udyok ng apoptosis at nabawasan ang mitochondrial respiration sa mga LX-2 cell na hiwalay sa paggamot ng TGF-β1. Kapansin-pansin na ang apoptosis ay isang pangunahing landas para sa paglutas ng fibrosis at pag-activate ng hematopoietic stem cell (HSC), at isa ring mahalagang kaganapan sa nababaligtad na pisyolohikal na tugon ng fibrosis sa atay [4, 43]. Bukod dito, ang pagpapanumbalik ng BHI sa mga LX-2 cell pagkatapos ng pinagsamang paggamot ay nagbigay ng mga bagong pananaw sa potensyal na papel ng IPA sa regulasyon ng mitochondrial bioenergetics. Sa ilalim ng mga kondisyon ng pagpapahinga at hindi aktibo, ang mga hematopoietic cell ay karaniwang gumagamit ng mitochondrial oxidative phosphorylation upang makagawa ng ATP at may mababang metabolic activity. Sa kabilang banda, ang HSC activation ay nagpapahusay sa mitochondrial respiration at biosynthesis upang mabawi ang mga pangangailangan sa enerhiya ng pagpasok sa glycolytic state [44]. Ang katotohanan na ang IPA ay hindi nakakaapekto sa metabolic potential at ECAR ay nagmumungkahi na ang glycolytic pathway ay hindi gaanong inuuna. Katulad nito, ipinakita ng isa pang pag-aaral na ang 1 mM IPA ay nagawang baguhin ang aktibidad ng mitochondrial respiratory chain sa mga cardiomyocytes, human hepatocyte cell line (Huh7) at human umbilical vein endothelial cells (HUVEC); Gayunpaman, walang nakitang epekto ng IPA sa glycolysis sa mga cardiomyocytes, na nagmumungkahi na ang IPA ay maaaring makaapekto sa bioenergetics ng iba pang mga uri ng cell [45]. Samakatuwid, ipinapalagay namin na ang 1 mM IPA ay maaaring kumilos bilang isang banayad na kemikal na uncoupler, dahil maaari nitong makabuluhang bawasan ang fibrogenic gene expression, cell morphology at mitochondrial bioenergetics nang hindi binabago ang dami ng mtDNA [46]. Ang mga mitochondrial uncoupler ay maaaring pumigil sa culture-induced fibrosis at HSC activation [47] at bawasan ang produksyon ng mitochondrial ATP na kinokontrol o hinihikayat ng ilang mga protina tulad ng uncoupling proteins (UCP) o adenine nucleotide translocase (ANT). Depende sa uri ng cell, ang phenomenon na ito ay maaaring protektahan ang mga cell mula sa apoptosis at/o magsulong ng apoptosis [46]. Gayunpaman, kinakailangan ang mga karagdagang pag-aaral upang linawin ang papel ng IPA bilang isang mitochondrial uncoupler sa hematopoietic stem cell inactivation.
Pagkatapos ay sinuri namin kung ang mga pagbabago sa mitochondrial respiration ay makikita sa mitochondrial morphology sa mga buhay na LX-2 cells. Kapansin-pansin, binabago ng paggamot ng TGF-β1 ang mitochondrial proportion mula spherical hanggang intermediate, na may nabawasang mitochondrial branching at pagtaas ng expression ng DRP1, isang mahalagang salik sa mitochondrial fission [48]. Bukod pa rito, ang mitochondrial fragmentation ay nauugnay sa pangkalahatang network complexity, at ang paglipat mula sa fusion patungo sa fission ay kritikal para sa hematopoietic stem cell (HSC) activation, samantalang ang pagsugpo sa mitochondrial fission ay humahantong sa HSC apoptosis [49]. Kaya, ipinapahiwatig ng aming mga resulta na ang paggamot ng TGF-β1 ay maaaring magdulot ng pagbaba sa mitochondrial network complexity na may nabawasang branching, na mas karaniwan sa mitochondrial fission na nauugnay sa mga activated hematopoietic stem cells (HSCs). Bukod pa rito, ipinakita ng aming datos na maaaring baguhin ng IPA ang proporsyon ng mitochondria mula spherical hanggang intermediate na hugis, sa gayon ay binabawasan ang expression ng OPA1 at MFN2. Ipinakita ng mga pag-aaral na ang downregulation ng OPA1 ay maaaring magdulot ng pagbaba sa mitochondrial membrane potential at mag-trigger ng cell apoptosis [50]. Ang MFN2 ay kilalang namamagitan sa mitochondrial fusion at apoptosis [51]. Ang mga nakuhang resulta ay nagmumungkahi na ang induction ng mga selula ng LX-2 sa pamamagitan ng TGF-β1 at/o IPA ay tila nagpapabago sa hugis at laki ng mitochondrial, pati na rin sa estado ng pag-activate at pagiging kumplikado ng network.
Ipinapahiwatig ng aming mga resulta na ang pinagsamang paggamot ng TGFβ-1 at IPA ay maaaring makabawas sa mtDNA at mga morphological parameter ng cell sa pamamagitan ng pag-regulate sa mRNA expression ng fibrosis, apoptosis at mga gene na may kaugnayan sa survival sa mga cell na umiiwas sa apoptosis. Sa katunayan, binawasan ng IPA ang antas ng mRNA expression ng AKT1 at mahahalagang fibrosis gene tulad ng COL1A2 at MMP2, ngunit pinataas ang antas ng expression ng CASP8, na nauugnay sa apoptosis. Ipinakita ng aming mga resulta na pagkatapos ng paggamot ng IPA, bumaba ang expression ng BAX at tumaas ang expression ng mRNA ng mga subunit ng pamilya ng TIMP1, BCL-2 at NF-κB, na nagmumungkahi na maaaring pasiglahin ng IPA ang mga signal ng survival sa mga hematopoietic stem cell (HSC) na umiiwas sa apoptosis. Ang mga molekulang ito ay maaaring kumilos bilang mga pro-survival signal sa mga activated hematopoietic stem cell, na maaaring nauugnay sa pagtaas ng expression ng mga anti-apoptotic na protina (tulad ng Bcl-2), pagbaba ng expression ng pro-apoptotic BAX, at isang kumplikadong interaksyon sa pagitan ng TIMP at NF-κB [5, 7]. Ang IPA ay nagpapakita ng mga epekto nito sa pamamagitan ng PXR, at natuklasan namin na ang pinagsamang paggamot gamit ang TGF-β1 at IPA ay nagpataas ng mga antas ng ekspresyon ng PXR mRNA, na nagpapahiwatig ng pagsugpo sa pag-activate ng HSC. Ang na-activate na PXR signaling ay kilalang pumipigil sa pag-activate ng HSC kapwa in vivo at in vitro [52, 53]. Ipinapahiwatig ng aming mga resulta na ang IPA ay maaaring lumahok sa paglilinis ng mga na-activate na HSC sa pamamagitan ng pagtataguyod ng apoptosis, pagbabawas ng fibrosis at mitochondrial metabolism, at pagpapahusay ng mga survival signal, na mga tipikal na proseso na nagko-convert sa na-activate na HSC phenotype sa isang inactivated. Ang isa pang posibleng paliwanag para sa potensyal na mekanismo at papel ng IPA sa apoptosis ay ang pag-scavenge nito ng mga dysfunctional mitochondria pangunahin sa pamamagitan ng mitophagy (intrinsic pathway) at ang extrinsic TNF signaling pathway (Table 1), na direktang nakaugnay sa NF-κB survival signaling pathway (Karagdagang Larawan 7). Kapansin-pansin, ang mga enriched gene na nauugnay sa IPA ay nakakapag-induce ng mga pro-apoptotic at pro-survival signal sa apoptotic pathway [54], na nagmumungkahi na ang IPA ay maaaring mag-induce ng apoptotic pathway o survival sa pamamagitan ng pakikipag-ugnayan sa mga gene na ito. Gayunpaman, kung paano nagdudulot ng apoptosis o kaligtasan ang IPA sa panahon ng pag-activate ng HSC at ang mga mekanismong landas nito ay nananatiling hindi malinaw.
Ang IPA ay isang microbial metabolite na nabuo mula sa dietary tryptophan sa pamamagitan ng gut microbiota. Ipinakita ng mga pag-aaral na mayroon itong mga anti-inflammatory, antioxidant, at epigenetic regulatory properties sa intestinal environment.[55] Ipinakita ng mga pag-aaral na maaaring baguhin ng IPA ang intestinal barrier function at bawasan ang oxidative stress, na maaaring mag-ambag sa mga lokal na physiological effect nito.[56] Sa katunayan, ang IPA ay dinadala sa mga target na organ sa pamamagitan ng sirkulasyon, at dahil ang IPA ay may katulad na pangunahing istruktura ng metabolite sa tryptophan, serotonin, at mga indole derivatives, ang IPA ay nagsasagawa ng mga metabolic action na nagreresulta sa mga competitive metabolic fate.[52] Ang IPA ay maaaring makipagkumpitensya sa mga metabolite na nagmula sa tryptophan para sa mga binding site sa mga enzyme o receptor, na posibleng makagambala sa mga normal na metabolic pathway. Itinatampok nito ang pangangailangan para sa karagdagang mga pag-aaral sa pharmacokinetics at pharmacodynamics nito upang mas maunawaan ang therapeutic window nito.[57] Kailangan pang makita kung maaari rin itong mangyari sa mga hematopoietic stem cell (HSC).
Kinikilala namin na ang aming pag-aaral ay may ilang mga limitasyon. Upang partikular na suriin ang mga kaugnayan na may kaugnayan sa IPA, hindi namin isinama ang mga pasyenteng may type 2 diabetes mellitus (T2DM). Kinikilala namin na nililimitahan nito ang malawak na paggamit ng aming mga natuklasan sa mga pasyenteng may type 2 diabetes mellitus at advanced na sakit sa atay. Bagama't ang pisyolohikal na konsentrasyon ng IPA sa serum ng tao ay 1–10 μM [11, 20], isang konsentrasyon ng 1 mM IPA ang pinili batay sa pinakamataas na hindi nakakalason na konsentrasyon [15] at ang pinakamataas na rate ng apoptosis, na walang pagkakaiba sa porsyento ng populasyon ng necrotic cell. Bagama't ginamit ang mga supraphysiological na antas ng IPA sa pag-aaral na ito, sa kasalukuyan ay walang pinagkasunduan tungkol sa epektibong dosis ng IPA [52]. Bagama't makabuluhan ang aming mga resulta, ang mas malawak na metabolic fate ng IPA ay nananatiling isang aktibong larangan ng pananaliksik. Bukod dito, ang aming mga natuklasan sa kaugnayan sa pagitan ng mga antas ng serum IPA at DNA methylation ng mga transcript ng atay ay nakuha hindi lamang mula sa mga hematopoietic stem cell (HSC) kundi pati na rin mula sa mga tisyu ng atay. Pinili naming gamitin ang mga selula ng LX-2 ng tao batay sa aming mga naunang natuklasan mula sa pagsusuri ng transcriptome na ang IPA ay nauugnay sa pag-activate ng hematopoietic stem cell (HSC) [15], at ang mga HSC ang mga pangunahing selula na kasangkot sa pag-unlad ng fibrosis ng atay. Ang atay ay binubuo ng maraming uri ng selula, kaya ang iba pang mga modelo ng selula tulad ng hepatocyte-HSC-immune cell co-culture system na sinamahan ng caspase activation at DNA fragmentation pati na rin ang mekanismo ng pagkilos kabilang ang antas ng protina ay dapat isaalang-alang upang pag-aralan ang papel ng IPA at ang interaksyon nito sa iba pang mga uri ng selula ng atay.