Ang iba't ibang teorya ng depensa ng halaman ay nagbibigay ng mahalagang teoretikal na gabay para sa pagpapaliwanag ng mga pattern ng espesyalisadong metabolismo ng halaman, ngunit ang kanilang mga pangunahing hula ay kailangan pang subukin. Dito, gumamit kami ng walang kinikilingang tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis upang sistematikong tuklasin ang metabolome ng mga strain na pinahina ng tabako mula sa mga indibidwal na halaman hanggang sa mga populasyon at malapit na kaugnay na species, at pinroseso ang isang malaking bilang ng mga teorya ng mass spectrometric feature batay sa compound spectra sa information. Framework upang subukan ang mga pangunahing hula ng mga teorya ng optimal defense (OD) at moving target (MT). Ang bahagi ng impormasyon ng metabolomics ng halaman ay naaayon sa teorya ng OD, ngunit sumasalungat sa pangunahing hula ng teorya ng MT sa dinamika ng metabolomics na dulot ng mga herbivore. Mula sa micro hanggang sa macro evolutionary scale, ang jasmonate signal ay kinilala bilang pangunahing determinant ng OD, habang ang ethylene signal ay nagbigay ng fine-tuning ng herbivore-specific response na itinala ng MS/MS molecular network.
Ang mga espesyal na metabolite na may magkakaibang istruktura ang pangunahing kalahok sa pag-aangkop ng halaman sa kapaligiran, lalo na sa pagtatanggol sa mga kaaway (1). Ang kamangha-manghang pagkakaiba-iba ng espesyal na metabolismo na matatagpuan sa mga halaman ay nagpasigla ng mga dekada ng malalim na pananaliksik sa maraming aspeto ng mga tungkuling ekolohikal nito, at bumuo ng isang mahabang listahan ng mga teorya ng pagtatanggol ng halaman, na siyang ebolusyonaryo at ekolohikal na pag-unlad ng mga interaksyon ng halaman-insekto. Ang empirikal na pananaliksik ay nagbibigay ng mahalagang gabay (2). Gayunpaman, ang mga teorya ng pagtatanggol ng halaman na ito ay hindi sumunod sa normatibong landas ng hipotetikal na deduktibong pangangatwiran, kung saan ang mga pangunahing hula ay nasa parehong antas ng pagsusuri (3) at sinubukan sa eksperimento upang isulong ang susunod na siklo ng teoretikal na pag-unlad (4). Ang mga limitasyong teknikal ay naghihigpit sa pagkolekta ng datos sa mga partikular na kategorya ng metabolic at hindi isinasama ang komprehensibong pagsusuri ng mga espesyalisadong metabolite, kaya pinipigilan ang mga paghahambing sa pagitan ng mga kategorya na mahalaga para sa teoretikal na pag-unlad (5). Ang kakulangan ng komprehensibong datos ng metabolomika at isang karaniwang pera upang ihambing ang daloy ng trabaho sa pagproseso ng espasyo ng metabolic sa pagitan ng iba't ibang grupo ng halaman ay humahadlang sa siyentipikong kapanahunan ng larangan.
Ang mga pinakabagong pag-unlad sa larangan ng tandem mass spectrometry (MS/MS) metabolomics ay maaaring komprehensibong makilala ang mga pagbabago sa metabolismo sa loob at sa pagitan ng mga species ng isang partikular na clade ng sistema, at maaaring pagsamahin sa mga pamamaraan ng pagkalkula upang kalkulahin ang pagkakatulad sa istruktura sa pagitan ng mga kumplikadong halo na ito. Naunang kaalaman sa kimika (5). Ang kombinasyon ng mga advanced na teknolohiya sa pagsusuri at pagkalkula ay nagbibigay ng isang kinakailangang balangkas para sa pangmatagalang pagsubok ng maraming hula na ginawa ng mga teoryang ekolohikal at ebolusyonaryo ng pagkakaiba-iba ng metabolismo. Ipinakilala ni Shannon (6) ang teorya ng impormasyon sa unang pagkakataon sa kanyang mahalagang artikulo noong 1948, na naglatag ng pundasyon para sa matematikal na pagsusuri ng impormasyon, na ginamit sa maraming larangan maliban sa orihinal nitong aplikasyon. Sa genomics, ang teorya ng impormasyon ay matagumpay na nailapat upang mabilang ang konserbatibong impormasyon sa pagkakasunud-sunod (7). Sa pananaliksik sa transcriptomics, sinusuri ng teorya ng impormasyon ang pangkalahatang mga pagbabago sa transcriptome (8). Sa mga nakaraang pananaliksik, inilapat namin ang istatistikal na balangkas ng teorya ng impormasyon sa metabolomics upang ilarawan ang kadalubhasaan sa metabolismo ng antas ng tisyu sa mga halaman (9). Dito, pinagsasama namin ang daloy ng trabaho na nakabatay sa MS/MS sa balangkas ng istatistika ng teorya ng impormasyon, na nailalarawan sa pamamagitan ng metabolic diversity sa karaniwang pera, upang ihambing ang mga pangunahing hula ng teorya ng depensa ng halaman ng metabolome na sapilitan ng mga herbivore.
Ang mga teoretikal na balangkas ng depensa ng halaman ay karaniwang inklusibo sa isa't isa at maaaring hatiin sa dalawang kategorya: ang mga sumusubok na ipaliwanag ang distribusyon ng mga metabolite na partikular sa halaman batay sa mga tungkulin ng depensa, tulad ng optimal defense (OD) (10), moving target (MT) (11)) at teorya ng hitsura (12), habang ang iba ay naghahanap ng mga mekanikal na paliwanag kung paano nakakaapekto ang mga pagbabago sa pagkakaroon ng mapagkukunan sa paglaki ng halaman at ang akumulasyon ng mga espesyalisadong metabolite, tulad ng carbon: nutrient balance hypothesis (13), growth rate hypothesis (14), at ang growth and differentiation equilibrium hypothesis (15). Ang dalawang hanay ng mga teorya ay nasa magkaibang antas ng pagsusuri (4). Gayunpaman, dalawang teorya na kinasasangkutan ng mga tungkulin ng depensa sa antas ng paggana ang nangingibabaw sa usapan tungkol sa mga constitutive at inducible defense ng halaman: OD theory, na ipinapalagay na ang mga halaman ay namumuhunan sa kanilang mamahaling kemikal na depensa lamang kapag kinakailangan, halimbawa, kapag sila ay nakain. Kapag umaatake ang isang hayop sa damo, samakatuwid, ayon sa posibilidad ng pag-atake sa hinaharap, ang compound na may tungkulin ng depensa ay itinalaga (10); Ang MT hypothesis ay nagmumungkahi na walang axis ng directional metabolite change, ngunit ang metabolite ay random na nagbabago, kaya lumilikha ng posibilidad na mahadlangan ang metabolic "motion target" ng mga umaatakeng herbivore. Sa madaling salita, ang dalawang teoryang ito ay gumagawa ng magkasalungat na mga hula tungkol sa metabolic remodeling na nangyayari pagkatapos ng pag-atake ng mga herbivore: ang ugnayan sa pagitan ng unidirectional accumulation ng mga metabolite na may defensive function (OD) at mga non-directed metabolic changes (MT) (11).
Ang mga hypotheses ng OD at MT ay hindi lamang nagsasangkot ng mga sapilitan na pagbabago sa metabolome, kundi pati na rin ang mga ekolohikal at ebolusyonaryong kahihinatnan ng akumulasyon ng mga metabolite na ito, tulad ng mga adaptive na gastos at benepisyo ng mga metabolic na pagbabagong ito sa isang partikular na kapaligirang ekolohikal (16). Bagama't kinikilala ng parehong hypotheses ang depensibong tungkulin ng mga espesyalisadong metabolite, na maaaring mahal o hindi, ang pangunahing hula na nagpapaiba sa mga hypotheses ng OD at MT ay nasa direksyon ng mga sapilitan na pagbabago sa metabolismo. Ang hula ng teorya ng OD ang nakatanggap ng pinakamaraming eksperimental na atensyon sa ngayon. Kasama sa mga pagsubok na ito ang pag-aaral ng direkta o hindi direktang mga tungkulin sa depensa ng iba't ibang tisyu ng mga partikular na compound sa mga greenhouse at natural na kondisyon, pati na rin ang mga pagbabago sa yugto ng pag-unlad ng halaman (17-19). Gayunpaman, sa ngayon, dahil sa kakulangan ng daloy ng trabaho at istatistikal na balangkas para sa pandaigdigang komprehensibong pagsusuri ng metabolic diversity ng anumang organismo, ang pangunahing hula sa pagkakaiba sa pagitan ng dalawang teorya (iyon ay, ang direksyon ng mga pagbabago sa metabolismo) ay kailangan pang subukan. Dito, nagbibigay kami ng ganitong pagsusuri.
Isa sa mga pinakamahalagang katangian ng mga metabolite na partikular sa halaman ay ang kanilang matinding pagkakaiba-iba sa istruktura sa lahat ng antas mula sa iisang halaman, populasyon hanggang sa mga katulad na uri (20). Maraming mga pagbabago sa dami sa mga espesyalisadong metabolite ang maaaring maobserbahan sa antas ng populasyon, habang ang malalakas na pagkakaiba sa kwalitatibo ay karaniwang pinapanatili sa antas ng uri (20). Samakatuwid, ang pagkakaiba-iba ng metabolismo ng halaman ang pangunahing aspeto ng pagkakaiba-iba sa paggana, na sumasalamin sa kakayahang umangkop sa iba't ibang mga niche, lalo na ang mga niche na may iba't ibang posibilidad ng pagsalakay ng mga espesyal na insekto at karaniwang mga herbivore (21). Simula ng makabagong artikulo ni Fraenkel (22) tungkol sa mga dahilan ng pagkakaroon ng mga metabolite na partikular sa halaman, ang mga pakikipag-ugnayan sa iba't ibang insekto ay itinuturing na mahahalagang presyon ng pagpili, at ang mga pakikipag-ugnayang ito ay pinaniniwalaang humubog sa mga halaman sa panahon ng ebolusyon. Metabolic pathway (23). Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng mga uri sa pagkakaiba-iba ng mga espesyalisadong metabolite ay maaari ring sumasalamin sa balanseng pisyolohikal na nauugnay sa constitutive at inducible na pagtatanggol ng halaman laban sa mga estratehiya ng herbivorous, dahil ang dalawang uri ay kadalasang negatibong nauugnay sa isa't isa (24). Bagama't maaaring maging kapaki-pakinabang ang pagpapanatili ng isang mahusay na depensa sa lahat ng oras, ang napapanahong mga pagbabago sa metabolismo na nauugnay sa depensa ay nagbibigay ng malinaw na mga benepisyo sa pagpapahintulot sa mga halaman na maglaan ng mahahalagang mapagkukunan sa iba pang mga pamumuhunan sa pisyolohikal (19, 24), at maiwasan ang pangangailangan para sa simbiosis. Pinsala sa kolateral (25). Bilang karagdagan, ang mga reorganisasyong ito ng mga espesyalisadong metabolite na dulot ng mga herbivore ng insekto ay maaaring humantong sa mapanirang distribusyon sa populasyon (26), at maaaring magpakita ng mga direktang pagbasa ng mga malaking natural na pagbabago sa signal ng jasmonic acid (JA), na maaaring mapanatili sa populasyon. Ang mataas at mababang signal ng JA ay mga trade-off sa pagitan ng depensa laban sa mga herbivore at kompetisyon sa mga partikular na species (27). Bilang karagdagan, ang mga espesyalisadong pathway ng biosynthetic ng metabolite ay sasailalim sa mabilis na pagkawala at pagbabago sa panahon ng ebolusyon, na magreresulta sa hindi pantay-pantay na distribusyon ng metabolic sa mga malapit na magkakaugnay na species (28). Ang mga polymorphism na ito ay maaaring mabilis na maitatag bilang tugon sa pagbabago ng mga pattern ng herbivore (29), na nangangahulugang ang pagbabago-bago ng mga komunidad ng herbivore ay isang mahalagang salik na nagtutulak sa metabolic heterogeneity.
Dito, partikular naming nilutas ang mga sumusunod na problema. (I) Paano muling kino-configure ng insektong kumakain ng halaman ang metabolome ng halaman? (Ii) Ano ang mga pangunahing bahagi ng impormasyon ng metabolic plasticity na maaaring masukat upang masubukan ang mga hula ng pangmatagalang teorya ng depensa? (Iii) Kung ire-reprogram ang metabolome ng halaman sa paraang natatangi sa umaatake, kung gayon, ano ang papel na ginagampanan ng hormone ng halaman sa pag-aangkop ng isang partikular na tugon sa metabolismo, at aling mga metabolite ang nakakatulong sa espesipisidad ng depensa ng mga species? (Iv) Dahil ang mga hula na ginawa ng maraming teorya ng depensa ay maaaring mapalawak sa lahat ng antas ng mga biological na tisyu, tinanong namin kung gaano kapare-pareho ang sanhi ng tugon sa metabolismo mula sa panloob na paghahambing hanggang sa paghahambing sa pagitan ng mga species? Para sa layuning ito, sistematiko naming pinag-aralan ang leaf metabolome ng tobacco nicotine, na isang ecological model plant na may mayamang espesyalisadong metabolismo, at epektibo laban sa larvae ng dalawang katutubong herbivore, ang Lepidoptera Datura (Ms) (Napaka-agresibo, pangunahing kinakain). Sa Solanaceae at Spodoptera littoralis (Sl), ang mga cotton leaf worm ay isang uri ng "genus", kasama ang mga host plant ng Solanaceae at iba pang host ng iba pang genera at pamilya ng mga pagkaing halaman. Sinuri namin ang MS/MS metabolomics spectrum at kinuha ang mga statistical descriptor ng information theory upang ihambing ang mga teorya ng OD at MT. Gumawa ng mga specificity map upang ipakita ang pagkakakilanlan ng mga pangunahing metabolite. Ang pagsusuri ay pinalawak sa katutubong populasyon ng N. nasi at mga malapit na kaugnay na species ng tabako upang higit pang suriin ang covariance sa pagitan ng plant hormone signaling at OD induction.
Upang makuha ang isang pangkalahatang mapa tungkol sa plasticity at istruktura ng leaf metabolome ng herbivorous tobacco, gumamit kami ng isang dati nang binuong analysis at calculation workflow upang komprehensibong kolektahin at i-deconvolute ang high-resolution data independent MS/MS spectra mula sa plant extracts (9). Ang undifferentiated method na ito (tinatawag na MS/MS) ay maaaring bumuo ng non-redundant compound spectra, na maaaring gamitin para sa lahat ng compound-level analyses na inilarawan dito. Ang mga deconvoluted plant metabolites na ito ay may iba't ibang uri, na binubuo ng daan-daan hanggang libu-libong metabolites (mga 500-1000-s/MS/MS dito). Dito, isinasaalang-alang namin ang metabolic plasticity sa balangkas ng information theory, at tinantiya ang diversity at propesyonalismo ng metabolome batay sa Shannon entropy ng metabolic frequency distribution. Gamit ang dating ipinatupad na formula (8), kinalkula namin ang isang hanay ng mga indicator na maaaring gamitin upang ma-quantify ang diversity ng metabolome (Hj indicator), metabolic profile specialization (δj indicator) at metabolic specificity ng isang metabolite (Si indicator). Bukod pa rito, ginamit namin ang Relative Distance Plasticity Index (RDPI) upang masukat ang inducibility ng metabolome ng mga herbivore (Larawan 1A) (30). Sa loob ng balangkas na istatistikal na ito, tinatrato namin ang MS/MS spectrum bilang pangunahing yunit ng impormasyon, at pinoproseso ang relatibong kasaganaan ng MS/MS sa isang mapa ng distribusyon ng dalas, at pagkatapos ay ginagamit ang Shannon entropy upang tantyahin ang pagkakaiba-iba ng metabolome mula rito. Ang espesyalisasyon ng metabolome ay sinusukat ng average na specificity ng isang MS/MS spectrum. Samakatuwid, ang pagtaas sa kasaganaan ng ilang klase ng MS/MS pagkatapos ng induction ng herbivore ay binabago sa spectral inducibility, RDPI at espesyalisasyon, ibig sabihin, ang pagtaas sa δj index, dahil mas espesyalisadong mga metabolite ang nalilikha at isang mataas na Si index ang nalilikha. Ang pagbaba ng Hj diversity index ay sumasalamin na alinman sa bilang ng nabuong MS/MS ay nababawasan, o ang profile frequency distribution ay nagbabago sa isang hindi gaanong pare-parehong direksyon, habang binabawasan ang pangkalahatang kawalan ng katiyakan nito. Sa pamamagitan ng pagkalkula ng Si index, posibleng matukoy kung aling MS/MS ang na-induce ng ilang herbivore, sa kabaligtaran, kung aling MS/MS ang hindi tumutugon sa induction, na isang mahalagang tagapagpahiwatig upang makilala ang prediksyon ng MT at OD.
(A) Mga istatistikal na deskriptor na ginamit para sa herbivorous (H1 hanggang Hx) MS/MS data-inducibility (RDPI), diversity (Hj index), specialization (δj index) at metabolite specificity (Si index). Ang pagtaas sa antas ng specialization (δj) ay nagpapahiwatig na, sa karaniwan, mas maraming herbivorous specific metabolites ang malilikha, habang ang pagbaba sa diversity (Hj) ay nagpapahiwatig ng pagbaba sa produksyon ng mga metabolites o hindi pantay na distribusyon ng mga metabolites sa distribution map. Sinusuri ng Si value kung ang metabolite ay specific sa isang partikular na kondisyon (dito, herbivorous) o sa kabaligtaran ay pinapanatili sa parehong antas. (B) Konseptwal na diagram ng prediksyon ng teorya ng depensa gamit ang information theory axis. Hinuhulaan ng teorya ng OD na ang pag-atake ng herbivore ay magpapataas ng mga defense metabolites, sa gayon ay nagpapataas ng δj. Kasabay nito, bumababa ang Hj dahil ang profile ay muling inayos tungo sa nabawasang kawalan ng katiyakan ng metabolic information. Hinuhulaan ng teorya ng MT na ang pag-atake ng mga herbivore ay magdudulot ng mga di-direksyong pagbabago sa metabolome, sa gayon ay pinapataas ang Hj bilang isang indikasyon ng pagtaas ng kawalan ng katiyakan sa impormasyong metaboliko at magdudulot ng random na distribusyon ng Si. Nagpanukala rin kami ng isang halo-halong modelo, ang pinakamahusay na MT, kung saan ang ilang metabolite na may mas mataas na mga halaga ng depensa ay partikular na tataas (mataas na halaga ng Si), habang ang iba ay nagpapakita ng mga random na tugon (mas mababang halaga ng Si).
Gamit ang mga deskriptor ng teorya ng impormasyon, binibigyang-kahulugan namin ang teorya ng OD upang hulaan na ang mga pagbabago sa espesyal na metabolite na dulot ng herbivore sa isang hindi sapilitan na estado ng constitutive ay hahantong sa (i) pagtaas ng metabolic specificity (Si index) na magtutulak sa metabonomic specificity (δj index). Ang pagtaas ng) ilang partikular na grupo ng metabolite na may mas mataas na halaga ng depensa, at (ii) pagbaba ng metabolome diversity (Hj index) dahil sa pagbabago ng metabolic frequency distribution patungo sa mas leptin body distribution. Sa antas ng isang metabolite, inaasahan ang isang ordered Si distribution, kung saan tataas ang halaga ng Si ng metabolite ayon sa halaga ng depensa nito (Figure 1B). Kaugnay nito, ipinaliwanag namin ang teorya ng MT upang hulaan na ang excitation ay hahantong sa (i) mga di-direksyon na pagbabago sa mga metabolite na magreresulta sa pagbaba ng δj index, at (ii) pagtaas ng Hj index dahil sa pagtaas ng metabolic uncertainty. O randomness, na maaaring masukat ng Shannon entropy sa anyo ng generalized diversity. Kung tungkol sa metabolic composition, huhulaan ng teorya ng MT ang random distribution ng Si. Isinasaalang-alang na ang ilang mga metabolite ay nasa ilalim ng mga partikular na kondisyon sa ilalim ng mga partikular na kondisyon, at ang iba pang mga kondisyon ay wala sa ilalim ng mga partikular na kondisyon, at ang kanilang halaga ng depensa ay nakadepende sa kapaligiran, iminungkahi rin namin ang isang mixed defense model, kung saan ang δj at Hj ay ipinamamahagi sa dalawa sa kahabaan ng Si. Ang pagtaas sa lahat ng direksyon, tanging ang ilang grupo ng metabolite, na may mas mataas na halaga ng depensa, ang partikular na magpapataas ng Si, habang ang iba ay magkakaroon ng random na distribusyon (Larawan 1B).
Upang masubukan ang prediksyon ng redefined defense theory sa axis ng information theory descriptor, nag-angat kami ng expert (Ms) o generalist (Sl) herbivore larvae sa mga dahon ng Nepenthes pallens (Figure 2A). Gamit ang MS/MS analysis, nakakuha kami ng 599 non-redundant MS/MS spectra (data file S1) mula sa methanol extracts ng leaf tissue na nakolekta pagkatapos kumain ng uod. Ang paggamit ng RDPI, Hj, at δj indexes upang mailarawan ang reconfiguration ng information content sa MS/MS configuration files ay nagpapakita ng mga kawili-wiling pattern (Figure 2B). Ang pangkalahatang trend ay, gaya ng inilarawan ng information descriptor, habang patuloy na kumakain ng mga dahon ang mga uod, ang antas ng lahat ng metabolic reorganization ay tumataas sa paglipas ng panahon: 72 oras pagkatapos kumain ang herbivore, ang RDPI ay tumataas nang malaki. Kung ikukumpara sa undamaged control, ang Hj ay nabawasan nang malaki, na dahil sa pagtaas ng antas ng espesyalisasyon ng metabolic profile, na tinantiya ng δj index. Ang maliwanag na kalakaran na ito ay naaayon sa mga hula ng teorya ng OD, ngunit hindi naaayon sa mga pangunahing hula ng teorya ng MT, na naniniwala na ang mga random (hindi direktang) pagbabago sa mga antas ng metabolite ay ginagamit bilang isang nagtatanggol na pagbabalatkayo (Larawan 1B). Bagama't magkaiba ang nilalaman ng oral secretion (OS) elicitor at gawi sa pagpapakain ng dalawang herbivore na ito, ang kanilang direktang pagpapakain ay nagresulta sa magkatulad na pagbabago sa mga direksyon ng Hj at δj sa loob ng 24-oras at 72-oras na panahon ng pag-aani. Ang tanging pagkakaiba ay naganap sa 72 oras ng RDPI. Kung ikukumpara sa sanhi ng pagpapakain ng Ms, ang pangkalahatang metabolismo na dulot ng pagpapakain ng Sl ay mas mataas.
(A) Disenyong eksperimental: ang mga karaniwang baboy (S1) o eksperto (Ms) na mga herbivore ay pinakakain ng mga dahong may desalinasyon ng mga pitcher plant, habang para sa simulated herbivory, ang OS ng Ms (W + OSMs) ay ginagamit upang hawakan ang pagbutas ng mga standardized na posisyon ng dahon. S1 (W + OSSl) larvae o tubig (W + W). Ang kontrol (C) ay isang dahong walang sira. (B) Inducibility (RDPI kumpara sa control chart), diversity (Hj index) at specialization (δj index) index na kinalkula para sa special metabolite map (599 MS/MS; data file S1). Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng direktang pagpapakain ng herbivore at ng control group (Student's t-test na may paired t-test, *P<0.05 at ***P<0.001). ns, hindi mahalaga. (C) Indeks ng resolusyon sa oras ng pangunahing (asul na kahon, amino acid, organikong acid at asukal; data file S2) at espesyal na metabolite spectrum (pulang kahon 443 MS/MS; data file S1) pagkatapos ng kunwaring paggamot sa herbivory. Ang banda ng kulay ay tumutukoy sa 95% na agwat ng kumpiyansa. Ang asterisk ay nagpapahiwatig ng makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng paggamot at ng kontrol [quadratic analysis of variance (ANOVA), na sinusundan ng Tukey's honestly significant difference (HSD) para sa post hoc multiple comparisons, *P<0.05, **P<0.01 At *** P <0.001]. (D) Espesyalisasyon ng mga scatter plot at mga espesyal na metabolite profile (mga paulit-ulit na sample na may iba't ibang paggamot).
Upang masuri kung ang herbivore-induced remodeling sa antas ng metabolome ay makikita sa mga pagbabago sa antas ng mga indibidwal na metabolite, una naming pinagtuunan ng pansin ang mga metabolite na dating pinag-aralan sa mga dahon ng Nepenthes pallens na may napatunayang resistensya sa herbivore. Ang mga phenolic amide ay mga hydroxycinnamamide-polyamine conjugate na naiipon sa panahon ng proseso ng herbivory ng mga insekto at kilalang nakakabawas sa performance ng insekto (32). Hinanap namin ang mga precursor ng kaukulang MS/MS at ipinlot ang kanilang cumulative kinetic curves (Figure S1). Hindi nakakagulat, ang mga phenol derivatives na hindi direktang kasangkot sa depensa laban sa mga herbivore, tulad ng chlorogenic acid (CGA) at rutin, ay bumababa ang antas ng kanilang aktibidad pagkatapos ng herbivory. Sa kabaligtaran, ang mga herbivore ay maaaring gawing lubos na makapangyarihan ang mga phenol amide. Ang patuloy na pagpapakain ng dalawang herbivore ay nagresulta sa halos parehong excitation spectrum ng mga phenolamide, at ang pattern na ito ay lalong halata para sa de novo synthesis ng mga phenolamide. Ang parehong penomeno ay maoobserbahan kapag ginalugad ang 17-hydroxygeranyl nonanediol diterpene glycosides (17-HGL-DTGs) pathway, na nagbubunga ng malaking bilang ng mga acyclic diterpenes na may epektibong anti-herbivore functions (33), kung saan ang Ms Feeding with Sl ay nag-trigger ng katulad na expression profile (Figure S1)).
Ang posibleng disbentaha ng mga direktang eksperimento sa pagpapakain ng herbivore ay ang pagkakaiba sa rate ng pagkonsumo ng dahon at oras ng pagpapakain ng mga herbivore, na nagpapahirap sa pag-alis ng mga epektong partikular sa herbivore na dulot ng mga sugat at herbivore. Upang mas mahusay na malutas ang espesipisidad ng herbivore species ng induced leaf metabolic response, ginaya namin ang pagpapakain ng Ms at Sl larvae sa pamamagitan ng agad na paglalapat ng bagong nakolektang OS (OSM at OSS1) sa karaniwang puncture W ng pare-parehong posisyon ng dahon. Ang pamamaraang ito ay tinatawag na W + OS treatment, at ini-standardize nito ang induction sa pamamagitan ng tumpak na pag-timing ng pagsisimula ng tugon na natamo ng herbivore nang hindi nagdudulot ng mga nakakalitong epekto ng mga pagkakaiba sa rate o dami ng pagkawala ng tissue (Figure 2A) (34). Gamit ang MS/MS analysis at calculation pipeline, nakuha namin ang 443 MS/MS spectra (data file S1), na nag-overlap sa spectra na dating binuo mula sa mga direktang eksperimento sa pagpapakain. Ang information theory analysis ng MS/MS data set na ito ay nagpakita na ang reprogramming ng mga leaf-specialized metabolomes sa pamamagitan ng paggaya sa mga herbivore ay nagpakita ng mga OS-specific inducement (Figure 2C). Sa partikular, kumpara sa paggamot ng OSS1, ang OSM ay nagdulot ng pagpapahusay ng espesyalisasyon ng metabolome sa loob ng 4 na oras. Mahalagang tandaan na kumpara sa direktang set ng datos na pang-eksperimento na pinapakain ng herbivore, ang metabolic kinetics na nakita sa two-dimensional space gamit ang Hj at δj bilang mga coordinate at ang direksyon ng espesyalisasyon ng metabolome bilang tugon sa kunwaring paggamot ng herbivore sa paglipas ng panahon ay patuloy na tumataas (Figure 2D). Kasabay nito, tinantiya namin ang nilalaman ng mga amino acid, organic acid at asukal (data file S2) upang siyasatin kung ang naka-target na pagtaas na ito sa kadalubhasaan sa metabolome ay dahil sa muling pagsasaayos ng central carbon metabolism bilang tugon sa mga kunwaring herbivore (Figure S2). Upang mas maipaliwanag ang pattern na ito, mas sinubaybayan pa namin ang metabolic accumulation kinetics ng mga naunang tinalakay na pathway ng phenolamide at 17-HGL-DTG. Ang OS-specific induction ng mga herbivore ay binago sa isang differential rearrangement pattern sa loob ng metabolismo ng phenolamide (Figure S3). Ang mga phenolic amide na naglalaman ng mga coumarin at caffeoyl moieties ay mas pinipiling i-induce ng OSS1, habang ang mga OSM ay nagti-trigger ng isang partikular na induction ng mga ferulyl conjugate. Para sa 17-HGL-DTG pathway, natukoy ang differential OS induction sa pamamagitan ng downstream malonylation at dimalonylation products (Figure S3).
Susunod, pinag-aralan namin ang OS-induced transcriptome plasticity gamit ang time-course microarray data set, na ginagaya ang paggamit ng mga OSM upang gamutin ang mga dahon ng mga dahon ng halamang rosette sa mga herbivore. Ang sampling kinetics ay karaniwang nagsasapawan sa kinetics na ginamit sa pag-aaral na ito ng metabolomics (35). Kung ikukumpara sa metabolome reconfiguration kung saan ang metabolic plasticity ay partikular na tumataas sa paglipas ng panahon, naobserbahan namin ang mga transient transcription burst sa mga dahon na dulot ng Ms, kung saan ang transcriptome inducibility (RDPI) at specialization (δj) ay nasa 1. Mayroong isang makabuluhang pagtaas sa mga oras, at diversity (Hj) sa puntong ito, ang expression ng BMP1 ay makabuluhang nabawasan, na sinundan ng pagluwag ng transcriptome specialization (Figure S4). Ang mga metabolic gene families (tulad ng P450, glycosyltransferase, at BAHD acyltransferase) ay nakikilahok sa proseso ng pag-assemble ng mga espesyal na metabolite mula sa mga structural unit na nagmula sa primary metabolism, kasunod ng nabanggit na early high-specialization model. Bilang isang case study, sinuri ang phenylalanine pathway. Kinumpirma ng pagsusuri na ang mga pangunahing gene sa metabolismo ng phenolamide ay lubos na na-induce ng OS sa mga herbivore kumpara sa mga halamang hindi naakit, at malapit na nakahanay sa kanilang mga pattern ng ekspresyon. Ang transcription factor na MYB8 at mga structural gene na PAL1, PAL2, C4H at 4CL sa upstream ng pathway na ito ay nagpakita ng maagang pagsisimula ng transkripsyon. Ang mga acyltransferase na gumaganap ng papel sa pangwakas na pagpupulong ng phenolamide, tulad ng AT1, DH29, at CV86, ay nagpapakita ng isang matagal na pattern ng upregulation (Figure S4). Ang mga obserbasyon sa itaas ay nagpapahiwatig na ang maagang pagsisimula ng espesyalisasyon ng transcriptome at ang mas huling pagpapahusay ng espesyalisasyon ng metabolomics ay isang coupled mode, na maaaring dahil sa synchronous regulatory system na nagsisimula ng isang malakas na tugon sa depensa.
Ang muling pagsasaayos sa pagbibigay ng senyas ng hormone ng halaman ay gumaganap bilang isang regulatory layer na nagsasama ng impormasyon tungkol sa mga herbivore upang muling iprograma ang pisyolohiya ng mga halaman. Pagkatapos ng simulasyon ng herbivore, sinukat namin ang pinagsama-samang dinamika ng mga pangunahing kategorya ng hormone ng halaman at isinalarawan ang temporal na co-expression sa pagitan ng mga ito [Pearson correlation coefficient (PCC)> 0.4] (Larawan 3A). Gaya ng inaasahan, ang mga hormone ng halaman na may kaugnayan sa biosynthesis ay nakaugnay sa loob ng network ng co-expression ng hormone ng halaman. Bilang karagdagan, ang metabolic specificity (Si index) ay inimapa sa network na ito upang i-highlight ang mga hormone ng halaman na sapilitan ng iba't ibang paggamot. Dalawang pangunahing lugar ng herbivorous specific response ang iginuhit: ang isa ay nasa JA cluster, kung saan ang JA (ang biologically active form nito na JA-Ile) at iba pang JA derivatives ay nagpapakita ng pinakamataas na Si score; ang isa pa ay ethylene (ET). Ang Gibberellin ay nagpakita lamang ng katamtamang pagtaas sa herbivore specificity, habang ang iba pang mga hormone ng halaman, tulad ng cytokinin, auxin, at abscisic acid, ay may mababang induction specificity para sa mga herbivore. Kung ikukumpara sa paggamit ng W + W lamang, ang paglaki ng pinakamataas na halaga ng mga JA derivatives sa pamamagitan ng aplikasyon ng OS (W + OS) ay maaaring maituring na isang malakas at tiyak na tagapagpahiwatig ng mga JA. Hindi inaasahan, ang OSM at OSS1 na may iba't ibang nilalaman ng elicitor ay kilalang nagdudulot ng magkatulad na akumulasyon ng JA at JA-Ile. Kabaligtaran ng OSS1, ang OSM ay partikular at malakas na na-induce ng mga OSM, habang ang OSS1 ay hindi nagpapalaki ng tugon ng mga basal na sugat (Larawan 3B).
(A) Pagsusuri ng co-expression network batay sa pagkalkula ng PCC ng herbivore-induced plant hormone accumulation kinetics simulation. Ang node ay kumakatawan sa isang plant hormone, at ang laki ng node ay kumakatawan sa Si index na partikular sa plant hormone sa pagitan ng mga treatment. (B) Akumulasyon ng JA, JA-Ile at ET sa mga dahon na dulot ng iba't ibang treatment na ipinahiwatig ng iba't ibang kulay: aprikot, W + OSM; asul, W + OSSl; itim, W + W; kulay abo, C (kontrol). Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng treatment at control (two-way ANOVA na sinusundan ng Tukey HSD post hoc multiple comparison, *** P <0.001). Pagsusuri ng information theory ng (C)697 MS/MS (data file S1) sa JA biosynthesis at impaired perception spectrum (irAOC at irCOI1) at (D)585 MS/MS (data file S1) sa ETR1 na may impaired ET signal. Dalawang simulated herbivore treatment ang nag-trigger ng plant lines at empty vehicle (EV) control plant. Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng paggamot ng W+OS at hindi nasirang kontrol (two-way ANOVA na sinusundan ng Tukey HSD post hoc multiple comparison, *P<0.05, **P<0.01 at ***P<0.001). (E) Mga kalat-kalat na graph ng kalat-kalat na oposisyon sa espesyalisasyon. Ang mga kulay ay kumakatawan sa iba't ibang genetically modified strains; ang mga simbolo ay kumakatawan sa iba't ibang paraan ng paggamot: tatsulok, W + OSS1; parihaba, W + OSM; bilog C
Susunod, gumamit kami ng genetically modified strain ng attenuated Nepenthes (irCOI1 at sETR1) sa mga pangunahing hakbang ng JA at ET biosynthesis (irAOC at irACO) at perception (irCOI1 at sETR1) upang suriin ang metabolismo ng dalawang plant hormone na ito sa mga herbivore. Ang relatibong kontribusyon ng reprogramming. Alinsunod sa mga nakaraang eksperimento, kinumpirma namin ang induction ng herbivore-OS sa mga empty carrier (EV) plant (Figure 3, C hanggang D) at ang pangkalahatang pagbaba sa Hj index na dulot ng OSM, habang tumaas ang δj index. Ang tugon ay mas malinaw kaysa sa tugon na na-trigger ng OSS1. Ang isang two-line graph gamit ang Hj at δj bilang mga coordinate ay nagpapakita ng partikular na deregulasyon (Figure 3E). Ang pinaka-halatang trend ay sa mga strain na kulang sa JA signal, ang metabolome diversity at specialization changes na dulot ng mga herbivore ay halos ganap na naaalis (Figure 3C). Sa kabaligtaran, ang tahimik na persepsyon ng ET sa mga halamang sETR1, bagama't ang pangkalahatang epekto sa mga pagbabago sa metabolismo ng mga halamang herbivorous ay mas mababa kaysa sa JA signaling, ay nagpapahina sa pagkakaiba sa mga indeks ng Hj at δj sa pagitan ng mga pagganyak ng OSM at OSS1 (Larawan 3D at Larawan S5). Ipinapahiwatig nito na bilang karagdagan sa pangunahing tungkulin ng JA signal transduction, ang ET signal transduction ay nagsisilbi ring pag-fine-tune ng metabolic response ng mga herbivore na partikular sa species. Kasabay ng pag-fine-tune na tungkuling ito, walang pagbabago sa pangkalahatang inducibility ng metabolome sa mga halamang sETR1. Sa kabilang banda, kumpara sa mga halamang sETR1, ang mga halamang irACO ay nag-induce ng magkatulad na pangkalahatang amplitude ng mga pagbabago sa metabolismo na dulot ng mga herbivore, ngunit nagpakita ng makabuluhang magkakaibang marka ng Hj at δj sa pagitan ng mga hamon ng OSM at OSS1 (Larawan S5).
Upang matukoy ang mga espesyalisadong metabolite na may mahahalagang kontribusyon sa tugon ng mga herbivore na partikular sa uri at pinuhin ang kanilang produksyon sa pamamagitan ng mga signal ng ET, ginamit namin ang dating binuong istrukturang pamamaraan ng MS/MS. Ang pamamaraang ito ay umaasa sa pamamaraan ng bi-clustering upang muling mahulaan ang metabolic family mula sa mga fragment ng MS/MS [normalized dot product (NDP)] at similarity score batay sa neutral loss (NL). Ang set ng datos ng MS/MS na binuo sa pamamagitan ng pagsusuri ng mga linya ng transgenic ng ET ay nakabuo ng 585 MS/MS (data file S1), na nalutas sa pamamagitan ng pag-cluster ng mga ito sa pitong pangunahing MS/MS module (M) (Larawan 4A). Ang ilan sa mga modyul na ito ay siksik na puno ng mga dating nailalarawang espesyal na metabolite: halimbawa, ang M1, M2, M3, M4 at M7 ay mayaman sa iba't ibang phenol derivatives (M1), flavonoid glycosides (M2), acyl sugars (M3 At M4), at 17-HGL-DTG (M7). Bukod pa rito, ang metabolic specific information (Si index) ng isang metabolite sa bawat module ay kinakalkula, at ang distribusyon ng Si nito ay makikita nang intuitibo. Sa madaling salita, ang MS/MS spectra na nagpapakita ng mataas na herbivory at genotype specificity ay nailalarawan sa pamamagitan ng mataas na halaga ng Si, at ang mga istatistika ng kurtosis ay nagpapahiwatig ng distribusyon ng balahibo sa kanang sulok ng buntot. Isa sa mga ganitong lean colloid distribution ang natukoy sa M1, kung saan ang phenol amide ay nagpakita ng pinakamataas na Si fraction (Figure 4B). Ang nabanggit na herbivorous inducible 17-HGL-DTG sa M7 ay nagpakita ng katamtamang Si score, na nagpapahiwatig ng katamtamang antas ng differential regulation sa pagitan ng dalawang uri ng OS. Sa kabaligtaran, karamihan sa mga constitutively produced specialized metabolites, tulad ng rutin, CGA, at acyl sugars, ay kabilang sa pinakamababang Si scores. Upang mas mahusay na masuri ang structural complexity at Si distribution sa pagitan ng mga espesyal na metabolite, isang molecular network ang binuo para sa bawat module (Figure 4B). Isang mahalagang hula ng teorya ng OD (na nakabuod sa Figure 1B) ay ang muling pagsasaayos ng mga espesyal na metabolite pagkatapos ng herbivory ay dapat humantong sa mga one-way na pagbabago sa mga metabolite na may mataas na halaga ng depensa, lalo na sa pamamagitan ng pagtaas ng kanilang ispesipisidad (kumpara sa random na distribusyon) Mode) Defensive metabolite na hinulaang ng teorya ng MT. Karamihan sa mga phenol derivatives na naipon sa M1 ay may kaugnayan sa paggana sa pagbaba ng pagganap ng insekto (32). Nang ihambing ang mga halaga ng Si sa mga metabolite ng M1 sa pagitan ng mga induced na dahon at mga bumubuong dahon ng mga halaman ng kontrol ng EV sa loob ng 24 na oras, naobserbahan namin na ang metabolic specificity ng maraming metabolite pagkatapos ng mga insekto ng herbivory ay may makabuluhang trend ng pagtaas (Figure 4C). Ang tiyak na pagtaas sa halaga ng Si ay nakita lamang sa mga defensive phenolamide, ngunit walang pagtaas sa halaga ng Si ang nakita sa iba pang mga phenol at hindi kilalang mga metabolite na magkakasamang umiiral sa modyul na ito. Ito ay isang espesyalisadong modelo, na nauugnay sa teorya ng OD. Ang mga pangunahing hula ng mga pagbabago sa metabolismo na dulot ng mga herbivore ay pare-pareho. Upang masubukan kung ang partikularidad na ito ng phenolamide spectrum ay na-induce ng OS-specific ET, ipinlot namin ang metabolite Si index at nagdulot ng differential expression value sa pagitan ng OSM at OSS1 sa mga genotype ng EV at sETR1 (Figure 4D). Sa sETR1, ang pagkakaiba na dulot ng phenamide sa pagitan ng OSM at OSS1 ay lubos na nabawasan. Ang bi-clustering method ay inilapat din sa MS/MS data na nakolekta sa mga strain na may hindi sapat na JA upang mahinuha ang mga pangunahing MS/MS module na may kaugnayan sa JA-regulated metabolic specialization (Figure S6).
(A) Ang mga resulta ng clustering ng 585 MS/MS batay sa shared fragment (NDP similarity) at shared neutral loss (NL similarity) ay nagreresulta sa module (M) na naaayon sa kilalang pamilya ng compound, o sa pamamagitan ng hindi alam o hindi maayos na na-metabolize na komposisyon ng Metabolite. Sa tabi ng bawat module, ipinapakita ang distribusyon ng metabolite (MS/MS) specific (Si). (B) Modular molecular network: Ang mga node ay kumakatawan sa MS/MS at mga gilid, NDP (pula) at NL (asul) na mga marka ng MS/MS (cut-off, > 0.6). Ang graded metabolite specificity index (Si) ay may kulay batay sa module (kaliwa) at naka-map sa molecular network (kanan). (C) Module M1 ng EV plant sa constitutive (control) at induced state (simulated herbivore) sa loob ng 24 oras: molecular network diagram (Ang halaga ng Si ay ang laki ng node, ang defensive phenolamide ay naka-highlight sa asul). (D) Ang M1 molecular network diagram ng spectrum line na sETR1 na may kapansanan sa persepsyon ng EV at ET: ang phenolic compound na kinakatawan ng berdeng bilog na node, at ang makabuluhang pagkakaiba (P value) sa pagitan ng mga paggamot ng W + OSM at W + OSS1 bilang laki ng Node. CP, N-caffeoyl-tyrosine; CS, N-caffeoyl-spermidine; FP, N-ferulic acid ester-uric acid; FS, N-ferulyl-spermidine; CoP, N', N “-Coumarolyl-tyrosine; DCS, N', N”-dicaffeoyl-spermidine; CFS, N', N”-caffeoyl, feruloyl-spermidine; Lycium barbarum sa wolfberry Son; Nick. O-AS, O-acyl sugar.
Pinalawak pa namin ang pagsusuri mula sa isang pinahinang genotype ng Nepenthes patungo sa mga natural na populasyon, kung saan ang malalakas na intraspecific na pagbabago sa mga antas ng herbivorous JA at mga partikular na antas ng metabolite ay nailarawan na noon sa mga natural na populasyon (26). Gamitin ang set ng datos na ito upang masakop ang 43 germplasm. Ang mga germplasm na ito ay binubuo ng 123 species ng halaman mula sa N. pallens. Ang mga halamang ito ay kinuha mula sa mga buto na nakolekta sa iba't ibang katutubong tirahan sa Utah, Nevada, Arizona, at California (Larawan S7), kinalkula namin ang metabolome diversity (dito ay tinatawag na antas ng populasyon) β diversity) at ang espesyalisasyon na dulot ng OSM. Kasabay ng mga nakaraang pag-aaral, naobserbahan namin ang malawak na hanay ng mga pagbabago sa metabolismo sa kahabaan ng Hj at δj axes, na nagpapahiwatig na ang mga germplasm ay may mga makabuluhang pagkakaiba sa plasticity ng kanilang mga metabolic response sa mga herbivore (Larawan S7). Ang organisasyong ito ay nakapagpapaalala sa mga nakaraang obserbasyon tungkol sa dynamic range ng mga pagbabago sa JA na dulot ng mga herbivore, at napanatili ang isang napakataas na halaga sa isang populasyon (26, 36). Sa pamamagitan ng paggamit ng JA at JA-Ile upang subukan ang pangkalahatang ugnayan sa pagitan ng Hj at δj, natuklasan namin na mayroong isang makabuluhang positibong ugnayan sa pagitan ng JA at ng metabolome β diversity and specialization index (Figure S7). Ipinahihiwatig nito na ang herbivore-induced heterogeneity sa JAs induction na natukoy sa antas ng populasyon ay maaaring dahil sa mga pangunahing metabolic polymorphism na dulot ng pagpili mula sa mga herbivore na insekto.
Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang mga uri ng tabako ay lubhang magkakaiba sa uri at relatibong pagdepende sa mga sapilitan at konstitutibong metabolic defenses. Pinaniniwalaan na ang mga pagbabagong ito sa anti-herbivore signal transduction at mga kakayahan sa depensa ay kinokontrol ng presyon ng populasyon ng insekto, siklo ng buhay ng halaman, at mga gastos sa produksyon ng depensa sa niche kung saan lumalaki ang isang partikular na species. Pinag-aralan namin ang pagkakapare-pareho ng leaf metabolome remodeling na sapilitan ng mga herbivore ng anim na species ng Nicotiana na katutubong sa North America at South America. Ang mga species na ito ay malapit na nauugnay sa Nepenthes North America, lalo na ang Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, linear tobacco, tobacco (Nicotiana spegazzinii) at tobacco leaf tobacco (Nicotiana obtusifolia) (Figure 5A) (37). Anim sa mga species na ito, kabilang ang mahusay na nailalarawan na species na N. please, ay mga taunang halaman ng petunia clade, at ang obtusifolia N. ay mga perennial ng sister clade na Trigonophyllae (38). Kasunod nito, isinagawa ang W + W, W + OSM at W + OSS1 induction sa pitong species na ito upang pag-aralan ang metabolic rearrangement sa antas ng species ng pagpapakain ng insekto.
(A) Isang bootstrap phylogenetic tree batay sa maximum likelihood [para sa nuclear glutamine synthesis (38)] at ang heograpikal na distribusyon ng pitong malapit na magkakaugnay na species ng Nicotiana (iba't ibang kulay) (37). (B) Isang scatter plot ng espesyalisadong pagkakaiba-iba para sa mga metabolic profile ng pitong species ng Nicotiana (939 MS/MS; data file S1). Sa antas ng species, ang pagkakaiba-iba ng metabolome ay negatibong nauugnay sa antas ng espesyalisasyon. Ang pagsusuri ng ugnayan sa antas ng species sa pagitan ng metabolic diversity at espesyalisasyon at akumulasyon ng JA ay ipinapakita sa Figure 2. S9. Kulay, iba't ibang uri; tatsulok, W + OSS1; parihaba, W + OSM; (C) Ang dinamika ng Nicotiana JA at JA-Ile ay niraranggo ayon sa OS excitation amplitude (two-way ANOVA at Tukey HSD post-multiple comparison, * P <0.05, ** P <0.01 at * ** Para sa paghahambing ng W + OS at W + W, P <0.001). Box plot ng (D) pagkakaiba-iba at (E) espesyalisasyon ng bawat uri ng hayop pagkatapos gayahin ang mga herbivorous at methyl JA (MeJA). Ang asterisk ay nagpapahiwatig ng makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng W + OS at W + W o lanolin kasama ang W (Lan + W) o Lan kasama ang MeJA (Lan + MeJa) at Lan control (two-way analysis of variance, na sinusundan ng Tukey's HSD post hoc multiple comparison, *P<0.05, **P<0.01 at ***P<0.001).
Gamit ang dual cluster method, natukoy namin ang 9 na module ng 939 MS/MS (data file S1). Ang komposisyon ng MS/MS na muling na-configure ng iba't ibang treatment ay lubhang nag-iiba sa iba't ibang module sa pagitan ng species (Figure S8). Ang pagtingin sa Hj (tinutukoy dito bilang species-level γ-diversity) at δj ay nagpapakita na ang iba't ibang species ay nagsasama-sama sa magkakaibang grupo sa metabolic space, kung saan ang species-level division ay karaniwang mas kitang-kita kaysa sa excitation. Maliban sa N. linear at N. obliquus, nagpapakita sila ng malawak na dynamic range ng induction effects (Figure 5B). Sa kabaligtaran, ang mga species tulad ng N. purpurea at N. obtusifolia ay may hindi gaanong halatang metabolic response sa treatment, ngunit ang metabolome ay mas magkakaiba. Ang species-specific distribution ng induced metabolic response ay nagresulta sa isang makabuluhang negatibong ugnayan sa pagitan ng specialization at gamma diversity (PCC = -0.46, P = 4.9×10-8). Ang mga pagbabagong dulot ng OS sa mga antas ng JA ay positibong nauugnay sa espesyalisasyon ng metabolome, at negatibong nauugnay sa metabolic gamma diversity na ipinakita ng bawat species (Figure 5B at Figure S9). Mahalagang tandaan na ang species na karaniwang tinutukoy bilang mga species na "signal response" sa Figure 5C, tulad ng Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute, at Nepenthes attenuated, ay nagdulot ng mga makabuluhang palatandaan pagkalipas ng 30 minuto. Ang mga kamakailang pagsiklab ng OS-specific JA at JA-Ile, habang ang iba pang bacteria na tinatawag na "signal unresponsive", tulad ng Nepenthes mills, Nepenthes powdery at N. obtusifolia ay nagpapakita lamang ng JA-Ile Edge induction nang walang anumang OS specificity (Figure 5C). Sa antas ng metabolic, gaya ng nabanggit sa itaas, para sa mga attenuated Nepenthes, ang mga signal-responsive substance ay nagpakita ng OS specificity at makabuluhang nagpataas ng δj, habang binabawasan ang Hj. Ang OS-specific priming effect na ito ay hindi nakita sa mga species na inuri bilang signal non-reactive species (Figure 5, D at E). Ang mga metabolite na partikular sa OS ay mas madalas na ibinabahagi sa pagitan ng mga species na tumutugon sa signal, at ang mga kumpol ng signal na ito ay nagtitipon sa mga species na may mas mahinang tugon sa signal, habang ang mga species na may mas mahinang tugon sa signal ay nagpapakita ng mas kaunting interdependence (Figure S8). Ang resultang ito ay nagpapahiwatig na ang OS-specific induction ng mga JA at ang OS-specific reconfiguration ng downstream metabolome ay magkakaugnay sa antas ng species.
Sumunod, gumamit kami ng lanolin paste na naglalaman ng methyl JA (MeJA) upang gamutin ang mga halaman upang siyasatin kung ang mga coupling mode na ito ay pinaghihigpitan ng pagkakaroon ng JA na inilalapat ng exogenous JA, na mapapasa cytoplasm ng mga halaman. Ang mabilis na deesterification ay ang JA. Natagpuan namin ang parehong trend ng unti-unting pagbabago mula sa mga species na tumutugon sa signal patungo sa mga species na hindi tumutugon sa signal na dulot ng patuloy na supply ng JA (Larawan 5, D at E). Sa madaling salita, ang paggamot ng MeJA ay malakas na muling nagprograma sa mga metabolome ng mga linear nematode, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens, at N. mikimotoi, na nagresulta sa isang makabuluhang pagtaas sa δj at ang pagbaba sa Hj. Ang N. purpurea ay nagpakita lamang ng pagtaas sa δj, ngunit hindi ang Hj. N. obtusifolia, na dati nang ipinakita na nakakaipon ng napakababang antas ng JA, ay hindi rin tumutugon nang maayos sa paggamot ng MeJA sa mga tuntunin ng muling pagsasaayos ng metabolome. Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang produksyon ng JA o signal transduction ay pisyolohikal na pinaghihigpitan sa mga species na hindi tumutugon sa signal. Upang masubukan ang hypothesis na ito, pinag-aralan namin ang apat na species (N. pallens, N. mills, N. pink at N. microphylla) na na-induce ng W + W, W + OSMs at W + OSS1 Transcriptome (39). Alinsunod sa pattern ng metabolome remodeling, ang mga species ay maayos na nakahiwalay sa transcriptome space, kung saan ang N. attenuated ay nagpakita ng pinakamataas na OS-induced RDPI, habang ang N. gracilis ang may pinakamababa (Figure 6A). Gayunpaman, natuklasan na ang transcriptome diversity na na-induce ng N. oblonga ang pinakamababa sa apat na species, taliwas sa pinakamataas na metabonomic diversity ng N. oblonga na dati nang ipinakita sa pitong species. Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang isang hanay ng mga gene na nauugnay sa mga maagang signal ng depensa, kabilang ang mga signal ng JA, ay nagpapaliwanag sa pagiging tiyak ng mga maagang tugon sa depensa na na-induce ng mga herbivore-related elicitor sa mga species ng Nicotiana (39). Ang paghahambing ng mga JA signaling pathway sa pagitan ng apat na species na ito ay nagpakita ng isang kawili-wiling pattern (Figure 6B). Karamihan sa mga gene sa pathway na ito, tulad ng AOC, OPR3, ACX at COI1, ay nagpakita ng medyo mataas na antas ng induction sa apat na species na ito. Gayunpaman, isang pangunahing gene, ang JAR4, ang nagko-convert ng JA sa biologically active form nito ng mga naipon na transcript ng JA-Ile, at ang antas ng transcription nito ay napakababa, lalo na sa N. mills, Nepenthes pieris at N. microphylla. Bukod pa rito, tanging ang transcript ng isa pang gene na AOS ang hindi nakita sa N. bifidum. Ang mga pagbabagong ito sa gene expression ay maaaring responsable para sa mga matinding phenotype na dulot ng mababang produksyon ng JA sa mga signal anergic species at ang induction ng N. gracilis.
(A) Pagsusuri sa teorya ng impormasyon ng muling pagprograma ng mga maagang tugon sa transkripsyon ng apat na malapit na magkakaugnay na uri ng tabako na kinuhanan ng sample 30 minuto pagkatapos ng herbivory induction. Ang RDPI ay kinakalkula sa pamamagitan ng paghahambing ng mga dahon na sapilitan ng herbivore OS sa kontrol ng sugat. Ang mga kulay ay nagpapahiwatig ng iba't ibang uri, at ang mga simbolo ay nagpapahiwatig ng iba't ibang paraan ng paggamot. (B) Pagsusuri ng ekspresyon ng gene sa mga JA signaling pathway sa apat na uri. Ang pinasimpleng JA path ay ipinapakita sa tabi ng box plot. Ang iba't ibang kulay ay nagpapahiwatig ng iba't ibang paraan ng pagproseso. Ang asterisk ay nagpapahiwatig na mayroong isang makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng paggamot na W + OS at ng W + W control (para sa Student's t-test para sa pairwise differences, *P<0.05, **P<0.01 at ***P<0.001). OPDA, 12-oxophytodienoic acid; OPC-8: 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenyl)-cyclopentane-1-octanoic acid.
Sa huling bahagi, pinag-aralan namin kung paano ang pagbabagong-anyo ng metabolome ng iba't ibang uri ng halaman na partikular sa mga insekto ay maaaring maging lumalaban sa mga herbivore. Binigyang-diin ng mga nakaraang pananaliksik ang genus na Nicotiana. Ang kanilang resistensya sa Ms at larvae ay lubhang magkaiba (40). Dito, pinag-aralan namin ang koneksyon sa pagitan ng modelong ito at ng kanilang metabolic plasticity. Gamit ang apat na uri ng tabako sa itaas, at pagsubok sa ugnayan sa pagitan ng pagkakaiba-iba at espesyalisasyon ng metabolome na dulot ng mga herbivore at ang resistensya ng mga halaman sa Ms at Sl, natagpuan namin na ang resistensya, pagkakaiba-iba at espesyalisasyon sa generalist SlAll ay positibong nauugnay, habang ang ugnayan sa pagitan ng resistensya sa mga ekspertong babae at espesyalisasyon ay mahina, at ang ugnayan sa pagkakaiba-iba ay hindi makabuluhan (Larawan S10). Tungkol sa resistensya sa S1, ang parehong attenuated N. chinensis at N. gracilis, na dating ipinakita na nagpapakita ng parehong antas ng JA signal transduction at metabolome plasticity, ay may lubhang magkakaibang tugon sa herbivore induction, at nagpakita rin sila ng magkatulad na mataas na resistensya. Kasarian.
Sa nakalipas na animnapung taon, ang teorya ng depensa ng halaman ay nagbigay ng isang teoretikal na balangkas, kung saan hinulaan ng mga mananaliksik ang isang malaking bilang ng ebolusyon at mga tungkulin ng mga espesyalisadong metabolite ng halaman. Karamihan sa mga teoryang ito ay hindi sumusunod sa normal na pamamaraan ng malalakas na hinuha (41). Nagpapanukala sila ng mga pangunahing hula (3) sa parehong antas ng pagsusuri. Kapag ang pagsubok sa mga pangunahing hula ay nagpapahintulot sa mga partikular na teorya na masuri, ito ay magiging dahilan upang ang larangan ay sumusulong. Ang larangan ay sumusulong. Ang larangan ay sumusulong. Ang larangan ay sumusulong, ngunit tinatanggihan ang iba (42). Sa halip, ang bagong teorya ay gumagawa ng mga hula sa iba't ibang antas ng pagsusuri at nagdaragdag ng isang bagong patong ng mga naglalarawang konsiderasyon (42). Gayunpaman, ang dalawang teoryang iminungkahi sa antas ng paggana, ang MT at OD, ay madaling maipaliwanag bilang mahahalagang hula ng mga espesyalisadong pagbabago sa metabolismo na dulot ng mga herbivore: Naniniwala ang teorya ng OD na ang mga pagbabago sa espesyalisadong metabolic na "espasyo" ay lubos na nakadirekta. Naniniwala ang teorya ng MT na ang mga pagbabagong ito ay magiging hindi nakadirekta at random na matatagpuan sa metabolic space, at may posibilidad na magkaroon ng mga metabolite na may mataas na halaga ng depensa. Ang mga nakaraang pagsusuri sa mga hula ng OD at MT ay nasubukan gamit ang isang makitid na hanay ng mga a priori na "depensa" na compound. Ang mga pagsubok na nakasentro sa metabolite na ito ay humahadlang sa kakayahang suriin ang lawak at trajectory ng muling pagsasaayos ng metabolome sa panahon ng herbivory, at hindi pinapayagan ang pagsubok sa loob ng isang pare-parehong balangkas ng istatistika na mangailangan ng mga pangunahing hula na maaaring ituring bilang isang kabuuan. Sukatin ang mga pagbabago sa metabolome ng halaman. Dito, ginamit namin ang makabagong teknolohiya sa metabolome batay sa computational MS at nagsagawa ng deconvolution MS analysis sa pangkalahatang pera ng mga descriptor ng teorya ng impormasyon upang subukan ang pagkakaiba sa pagitan ng dalawang iminungkahi sa pandaigdigang antas ng metabolomic. Ang pangunahing hula ng teoryang ito. Ang teorya ng impormasyon ay inilapat sa maraming larangan, lalo na sa konteksto ng biodiversity at pananaliksik sa daloy ng sustansya (43). Gayunpaman, sa pagkakaalam namin, ito ang unang aplikasyon na ginamit upang ilarawan ang espasyo ng impormasyon ng metabolic ng mga halaman at lutasin ang mga problemang ekolohikal na may kaugnayan sa mga pansamantalang pagbabago sa metabolic bilang tugon sa mga pahiwatig sa kapaligiran. Sa partikular, ang kakayahan ng pamamaraang ito ay nakasalalay sa kakayahang ihambing ang mga pattern sa loob at sa pagitan ng mga species ng halaman upang suriin kung paano umunlad ang mga herbivore mula sa iba't ibang species patungo sa mga macroevolutionary pattern sa pagitan ng mga species sa iba't ibang antas ng ebolusyon. Metabolismo.
Kino-convert ng principal component analysis (PCA) ang isang multivariate data set sa isang dimensionality reduction space upang maipaliwanag ang pangunahing trend ng data, kaya karaniwan itong ginagamit bilang isang exploratory technique upang i-parse ang data set, tulad ng deconvolution metabolome. Gayunpaman, mawawala ang bahagi ng nilalaman ng impormasyon sa data set ng pagbabawas ng dimensionality, at hindi makapagbigay ang PCA ng quantitative na impormasyon tungkol sa mga katangian na partikular na may kaugnayan sa ecological theory, tulad ng: kung paano muling kino-configure ng mga herbivore ang diversity sa mga espesyalisadong larangan (halimbawa, richness, distribution) at abundance) metabolites? Aling mga metabolite ang mga predictor ng induced state ng isang partikular na herbivore? Mula sa perspektibo ng specificity, diversity at inducibility, ang nilalaman ng impormasyon ng leaf-specific metabolite profile ay nabubulok, at natuklasan na ang pagkain ng mga herbivore ay maaaring mag-activate ng partikular na metabolismo. Hindi inaasahan, naobserbahan namin na, tulad ng inilarawan sa mga tagapagpahiwatig ng information theory na ipinatupad, ang nagresultang metabolic situation ay may malaking overlap pagkatapos ng mga pag-atake ng dalawang herbivore (ang night-fed generalist na si Sl) at ang Solanaceae expert na si Ms. Bagama't ang kanilang pag-uugali sa pagkain at konsentrasyon ay makabuluhang magkaiba. Fatty acid-amino acid conjugate (FAC) initiator sa OS (31). Sa pamamagitan ng paggamit ng herbivore OS upang gamutin ang mga standardized na sugat na natusok, ang simulated herbivore treatment ay nagpakita rin ng katulad na trend. Ang standardized na pamamaraang ito para sa paggaya sa tugon ng mga halaman sa mga pag-atake ng herbivore ay nag-aalis ng mga confounding factor na dulot ng mga pagbabago sa gawi sa pagkain ng mga herbivore, na humahantong sa iba't ibang antas ng pinsala sa iba't ibang oras (34). Ang FAC, na kilalang pangunahing sanhi ng OSM, ay binabawasan ang JAS at iba pang mga tugon ng hormone ng halaman sa OSS1, habang ang OSS1 ay binabawasan nang daan-daang beses (31). Gayunpaman, ang OSS1 ay nagdulot ng katulad na antas ng akumulasyon ng JA kumpara sa OSM. Nauna nang naipakita na ang tugon ng JA sa mga attenuated Nepenthes ay napaka-sensitibo sa OSM, kung saan maaaring mapanatili ng FAC ang aktibidad nito kahit na diluted 1:1000 sa tubig (44). Samakatuwid, kumpara sa OSM, bagama't napakababa ng FAC sa OSS1, sapat na ito upang magdulot ng sapat na pagsiklab ng JA. Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang mga protina na parang porin (45) at oligosaccharides (46) ay maaaring gamitin bilang mga molekular na pahiwatig upang ma-trigger ang mga tugon sa depensa ng halaman sa OSS1. Gayunpaman, hindi pa rin malinaw kung ang mga elicitor na ito sa OSS1 ang responsable para sa akumulasyon ng JA na naobserbahan sa kasalukuyang pag-aaral.
Bagama't kakaunti ang mga pag-aaral na naglalarawan sa magkakaibang metabolic fingerprints na dulot ng paglalapat ng iba't ibang herbivore o exogenous JA o SA (salicylic acid) (47), walang sinuman ang gumulo sa herbivore species-specific perturbation sa plant grass network at ang mga epekto nito sa partikular na personal na impormasyon. Kinumpirma pa ng pagsusuring ito na ang koneksyon ng internal hormone network sa iba pang plant hormone maliban sa JAs ang humuhubog sa specificity ng metabolic reorganization na dulot ng mga herbivore. Sa partikular, natuklasan namin na ang ET na dulot ng OSM ay mas malaki kaysa sa dulot ng OSS1. Ang mode na ito ay naaayon sa mas maraming nilalaman ng FAC sa OSM, na isang kinakailangan at sapat na kondisyon para sa pag-trigger ng ET burst (48). Sa konteksto ng interaksyon sa pagitan ng mga halaman at herbivore, ang signaling function ng ET sa plant-specific metabolite dynamics ay sporadic pa rin at tinatarget lamang ang isang compound group. Bukod pa rito, karamihan sa mga pag-aaral ay gumamit ng exogenous application ng ET o ng mga precursor nito o iba't ibang inhibitor upang pag-aralan ang regulasyon ng ET, kung saan ang mga exogenous chemical application na ito ay magdudulot ng maraming di-tiyak na side effect. Sa aming kaalaman, ang pag-aaral na ito ay kumakatawan sa unang malawakang sistematikong pagsusuri sa papel ng ET sa paggamit ng ET upang makagawa at makakita ng mga impaired transgenic na halaman upang i-coordinate ang plant metabolome dynamics. Ang herbivore-specific ET induction ay maaaring sa huli ay mag-modulate sa metabolome response. Ang pinakamahalaga ay ang transgenic manipulation ng ET biosynthesis (ACO) at perception (ETR1) genes na nagsiwalat ng herbivore-specific de novo accumulation ng phenolamides. Nauna nang naipakita na ang ET ay maaaring mag-fine-tune ng JA-induced nicotine accumulation sa pamamagitan ng pag-regulate ng putrescine N-methyltransferase (49). Gayunpaman, mula sa isang mekanikal na pananaw, hindi malinaw kung paano pino-fine-tune ng ET ang induction ng phenamide. Bukod sa tungkulin ng signal transduction ng ET, ang metabolic flux ay maaari ring ilipat sa S-adenosyl-1-methionine upang makontrol ang pamumuhunan sa polyaminophenol amides. Ang S-adenosyl-1-methionine ay ET at Karaniwang intermediate ng polyamine biosynthetic pathway. Ang mekanismo kung paano kinokontrol ng ET signal ang antas ng phenolamide ay nangangailangan ng karagdagang pag-aaral.
Sa loob ng mahabang panahon, dahil sa malaking bilang ng mga espesyal na metabolite na may hindi kilalang istraktura, ang matinding atensyon sa mga partikular na kategorya ng metabolic ay hindi mahigpit na nasusuri ang mga temporal na pagbabago ng metabolic diversity pagkatapos ng mga biological interaction. Sa kasalukuyan, batay sa pagsusuri ng teorya ng impormasyon, ang pangunahing resulta ng MS/MS spectrum acquisition batay sa mga walang kinikilingang metabolite ay ang mga herbivore na kumakain o ginagaya ang mga herbivore ay patuloy na binabawasan ang pangkalahatang metabolic diversity ng leaf metabolome habang pinapataas ang antas ng espesyalisasyon nito. Ang pansamantalang pagtaas na ito sa metabolome specificity na dulot ng mga herbivore ay nauugnay sa isang synergistic na pagtaas sa transcriptome specificity. Ang katangiang higit na nakakatulong sa mas malaking espesyalisasyon ng metabolome na ito (na may mas mataas na halaga ng Si) ay ang espesyal na metabolite na may dating nailalarawang herbivorous function. Ang modelong ito ay naaayon sa prediksyon ng teorya ng OD, ngunit ang prediksyon ng MT na may kaugnayan sa randomness ng metabolome reprogramming ay hindi pare-pareho. Gayunpaman, ang datos na ito ay naaayon din sa prediksyon ng mixed model (pinakamahusay na MT; Figure 1B), dahil ang iba pang mga hindi nailalarawang metabolite na may hindi kilalang mga function ng depensa ay maaari pa ring sumunod sa isang random na distribusyon ng Si.
Isang kapansin-pansing padron na higit pang nakuha ng pananaliksik na ito ay mula sa antas ng micro-evolution (iisang halaman at populasyon ng tabako) hanggang sa mas malaking evolutionary scale (malapit na kaugnay na species ng tabako), ang iba't ibang antas ng ebolusyonaryong organisasyon ay nasa "pinakamahusay na depensa". Mayroong mga makabuluhang pagkakaiba sa mga kakayahan ng mga herbivore. Sina Moore et al. (20) at Kessler at Kalske (1) ay nakapag-iisang iminungkahi na i-convert ang tatlong functional na antas ng biodiversity na orihinal na pinag-iba ni Whittaker (50) sa mga constitutive at induced temporal na pagbabago ng chemical diversity; hindi rin nilalagom ng mga may-akdang ito ang mga pamamaraan para sa malawakang pagkolekta ng datos ng metabolome kung paano kalkulahin ang metabolic diversity mula sa mga datos na ito. Sa pag-aaral na ito, ang mga maliliit na pagsasaayos sa functional classification ni Whittaker ay isasaalang-alang ang α-metabolic diversity bilang ang diversity ng MS/MS spectra sa isang partikular na halaman, at ang β-metabolic diversity bilang ang pangunahing intraspecific metabolism ng isang grupo ng mga populasyon. Ang Space, at γ-metabolic diversity ay magiging isang extension ng pagsusuri ng mga katulad na species.
Ang JA signal ay mahalaga para sa malawak na hanay ng mga metabolic response ng herbivore. Gayunpaman, may kakulangan ng mahigpit na quantitative testing sa kontribusyon ng intraspecific regulation ng JA biosynthesis sa metabolome diversity, at kung ang JA signal ay isang pangkalahatang lugar para sa stress-induced metabolic diversification sa mas mataas na macroevolutionary scale ay mahirap pa ring matukoy. Naobserbahan namin na ang herbivorous nature ng Nepenthes herbivorous ay nagdudulot ng metabolome specialization at ang variation ng metabolome specialization sa loob ng populasyon ng Nicotiana species at sa mga malapit na kaugnay na Nicotiana species ay sistematikong positibong nauugnay sa JA signaling. Bilang karagdagan, kapag ang JA signal ay may kapansanan, ang metabolic specificity na dulot ng isang genotype herbivore ay kakanselahin (Figure 3, C at E). Dahil ang mga pagbabago sa metabolic spectrum ng natural na attenuated na populasyon ng Nepenthes ay kadalasang quantitative, ang mga pagbabago sa metabolic β diversity at specificity sa pagsusuring ito ay maaaring higit na sanhi ng malakas na excitation ng mga metabolite-rich compound categories. Ang mga compound class na ito ay nangingibabaw sa bahagi ng metabolome profile at humahantong sa isang positibong ugnayan sa mga JA signal.
Dahil ang mga mekanismong biokemikal ng mga uri ng tabako na malapit na nauugnay dito ay ibang-iba, ang mga metabolite ay partikular na natutukoy sa aspetong kwalitatibo, kaya mas analitikal ito. Ang pagproseso ng teorya ng impormasyon sa nakuhang metabolic profile ay nagpapakita na ang herbivorous induction ay nagpapalala sa trade-off sa pagitan ng metabolic gamma diversity at espesyalisasyon. Ang JA signal ay gumaganap ng isang pangunahing papel sa trade-off na ito. Ang pagtaas sa metabolome specialization ay naaayon sa pangunahing prediksyon ng OD at positibong nauugnay sa JA signal, habang ang JA signal ay negatibong nauugnay sa metabolic gamma diversity. Ipinapahiwatig ng mga modelong ito na ang kapasidad ng OD ng mga halaman ay pangunahing tinutukoy ng plasticity ng JA, maging sa isang microevolutionary scale o sa isang mas malaking evolutionary scale. Ang mga exogenous JA application experiments na umiiwas sa mga depekto sa biosynthesis ng JA ay lalong nagpapakita na ang malapit na nauugnay na mga uri ng tabako ay maaaring makilala sa mga species na tumutugon sa signal at hindi tumutugon sa signal, tulad ng kanilang mode ng JA at metabolome plasticity na dulot ng mga herbivore. Ang mga species na hindi tumutugon sa signal ay hindi maaaring tumugon dahil sa kanilang kawalan ng kakayahang gumawa ng endogenous JA at samakatuwid ay napapailalim sa mga limitasyong pisyolohikal. Maaaring sanhi ito ng mga mutasyon sa ilang pangunahing gene sa JA signaling pathway (AOS at JAR4 sa N. crescens). Itinatampok ng resultang ito na ang mga macroevolutionary pattern na ito sa pagitan ng mga species ay maaaring pangunahing dulot ng mga pagbabago sa internal hormone perception at responsiveness.
Bukod sa interaksyon sa pagitan ng mga halaman at mga herbivore, ang paggalugad sa metabolic diversity ay nauugnay sa lahat ng mahahalagang teoretikal na pagsulong sa pananaliksik ng biyolohikal na adaptasyon sa kapaligiran at ang ebolusyon ng mga kumplikadong katangiang phenotypic. Sa pagtaas ng dami ng datos na nakuha ng mga modernong instrumento ng MS, ang hypothesis testing sa metabolic diversity ay maaari na ngayong malampasan ang mga indibidwal/kategorya na pagkakaiba ng metabolite at magsagawa ng pandaigdigang pagsusuri upang ipakita ang mga hindi inaasahang pattern. Sa proseso ng malawakang pagsusuri, isang mahalagang metapora ang ideya ng pagbuo ng mga makabuluhang mapa na maaaring magamit upang galugarin ang datos. Samakatuwid, ang isang mahalagang resulta ng kasalukuyang kombinasyon ng walang kinikilingang MS/MS metabolomics at information theory ay ang pagbibigay nito ng isang simpleng sukatan na maaaring magamit upang bumuo ng mga mapa upang tingnan ang metabolic diversity sa iba't ibang taxonomic scale. Ito ang pangunahing kinakailangan ng pamamaraang ito. Ang pag-aaral ng micro/macro evolution at community ecology.
Sa antas ng makro-ebolusyonaryo, ang pangunahing teorya ng co-evolution ng halaman-insekto nina Ehrlich at Raven (51) ay ang paghula na ang pagkakaiba-iba ng metabolic diversity sa pagitan ng mga uri ang sanhi ng pag-iiba-iba ng mga linya ng halaman. Gayunpaman, sa loob ng limampung taon mula nang mailathala ang mahalagang akdang ito, ang hypothesis na ito ay bihirang masubukan (52). Ito ay higit na dahil sa mga katangiang pilohenetiko ng maihahambing na mga katangiang metaboliko sa mga linya ng halaman na malayo ang distansya. Ang pambihira ay maaaring gamitin upang iugnay ang mga pamamaraan ng pagsusuri ng target. Ang kasalukuyang daloy ng trabaho ng MS/MS na pinoproseso ng teorya ng impormasyon ay binibilang ang pagkakatulad ng istruktura ng MS/MS ng mga hindi kilalang metabolite (nang walang paunang pagpili ng metabolite) at kino-convert ang mga MS/MS na ito sa isang hanay ng MS/MS, kaya sa propesyonal na metabolismo ang mga modelong makro-ebolusyonaryong ito ay inihahambing sa iskala ng klasipikasyon. Mga simpleng istatistikal na tagapagpahiwatig. Ang proseso ay katulad ng pagsusuring pilohenetiko, na maaaring gumamit ng pagkakahanay ng pagkakasunud-sunod upang mabilang ang rate ng pag-iiba-iba o ebolusyon ng karakter nang walang paunang hula.
Sa antas ng biokemikal, ipinapakita ng screening hypothesis nina Firn at Jones (53) na ang metabolic diversity ay pinapanatili sa iba't ibang antas upang magbigay ng mga hilaw na materyales upang maisagawa ang mga biyolohikal na aktibidad ng mga dati nang hindi nauugnay o pamalit na metabolite. Ang mga pamamaraan ng teorya ng impormasyon ay nagbibigay ng isang balangkas kung saan ang mga metabolite-specific evolutionary transition na nangyayari sa panahon ng espesyalisasyon ng metabolite ay maaaring masukat bilang bahagi ng iminungkahing proseso ng evolutionary screening: biologically active adaptation mula sa mababang specificity hanggang sa mataas na specificity. Mga inhibitory metabolite ng isang partikular na kapaligiran.
Sa kabuuan, noong mga unang araw ng molecular biology, nabuo ang mahahalagang teorya ng depensa ng halaman, at ang mga deductive hypothesis-driven na pamamaraan ay malawakang itinuturing na tanging paraan ng pag-unlad ng agham. Ito ay higit na dahil sa mga limitasyong teknikal ng pagsukat ng buong metabolome. Bagama't ang mga hypothesis-driven na pamamaraan ay partikular na kapaki-pakinabang sa pagpili ng iba pang mga mekanismo ng sanhi, ang kanilang kakayahang isulong ang ating pag-unawa sa mga biochemical network ay mas limitado kaysa sa mga pamamaraan ng pagkalkula na kasalukuyang magagamit sa kontemporaryong agham na masinsinang gumagamit ng datos. Samakatuwid, ang mga teoryang hindi mahuhulaan ay lampas sa saklaw ng magagamit na datos, kaya ang hypothetical formula/test cycle ng pag-unlad sa larangan ng pananaliksik ay hindi maaaring alisin (4). Nakikita namin na ang computational workflow ng metabolomics na ipinakilala dito ay maaaring muling magpaningas ng interes sa mga kamakailang isyu (paano) at pangwakas (bakit) ng metabolic diversity, at mag-ambag sa isang bagong panahon ng teoretikal na ginagabayan na agham ng datos. Muling sinuri ng panahon ang mahahalagang teorya na nagbigay inspirasyon sa mga nakaraang henerasyon.
Ang direktang pagpapakain sa mga herbivore ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagpapalaki ng pangalawang instar larva o Sl larva sa isang maputlang dahon ng pitcher plant ng isang halamang namumulaklak ng rosas, na may 10 replika ng halaman bawat halaman. Ang mga larvae ng insekto ay kinakapitan ng mga pang-ipit, at ang natitirang tisyu ng dahon ay kinolekta 24 at 72 oras pagkatapos ng impeksyon at mabilis na ini-freeze, at ang mga metabolite ay kinuha.
Gayahin ang paggamot gamit ang mga halamang herbivorous sa isang lubos na sabay-sabay na paraan. Ang pamamaraan ay ang paggamit ng mga gulong na may disenyo ng tela upang butasan ang tatlong hanay ng mga tinik sa bawat gilid ng midrib ng tatlong ganap na lumawak na dahon ng halaman sa panahon ng yugto ng paglaki ng garland ng tela, at agad na maglagay ng 1:5 Diluted Ms. O kaya naman ay gumamit ng mga daliri na may guwantes upang ipasok ang S1 OS sa sugat na butasan. Anihin at iproseso ang isang dahon gaya ng inilarawan sa itaas. Gamitin ang naunang inilarawan na pamamaraan upang kunin ang mga pangunahing metabolite at mga hormone ng halaman (54).
Para sa mga aplikasyon ng exogenous JA, ang tatlong dahon ng tangkay ng bawat isa sa anim na halamang namumulaklak ng rosas ng bawat uri ay ginagamot ng 20μl ng lanolin paste na naglalaman ng 150μg MeJA (Lan + MeJA), at 20μl ng lanolin kasama ang paggamot sa sugat (Lan + W), o gumamit ng 20μl purong lanolin bilang kontrol. Ang mga dahon ay inani 72 oras pagkatapos ng paggamot, inilagay sa freezer sa likidong nitrogen, at iniimbak sa -80°C hanggang sa gamitin.
Apat na linya ng transgenic na JA at ET, katulad ng irAOC (36), irCOI1 (55), irACO at sETR1 (48), ang natukoy sa aming grupo ng pananaliksik. Malakas na nagpakita ang irAOC ng pagbaba sa antas ng JA at JA-Ile, habang ang irCOI1 ay hindi sensitibo sa mga JA. Kung ikukumpara sa EV, tumaas ang akumulasyon ng JA-Ile. Katulad nito, babawasan ng irACO ang produksyon ng ET, at kung ikukumpara sa EV, ang sETR1, na hindi sensitibo sa ET, ay magpapataas sa produksyon ng ET.
Isang photoacoustic laser spectrometer (Sensor Sense ETD-300 real-time ET sensor) ang ginagamit upang maisagawa ang pagsukat ng ET nang hindi invasive. Kaagad pagkatapos ng paggamot, kalahati ng mga dahon ay pinutol at inilipat sa isang 4-ml na selyadong vial na salamin, at ang headspace ay hinayaan na maipon sa loob ng 5 oras. Sa panahon ng pagsukat, ang bawat vial ay hinugasan ng 2 litro/oras ng purong hangin sa loob ng 8 minuto, na dati nang dumaan sa isang catalyst na ibinigay ng Sensor Sense upang alisin ang CO2 at tubig.
Ang datos ng microarray ay orihinal na inilathala sa (35) at nakaimbak sa National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Comprehensive Database (accession number GSE30287). Ang datos na katumbas ng mga dahon na dulot ng paggamot gamit ang W + OSMs at ang hindi nasirang kontrol ay kinuha para sa pag-aaral na ito. Ang raw intensity ay log2. Bago ang statistical analysis, ang baseline ay kinomberte at ni-normalize sa ika-75 percentile nito gamit ang R software package.
Ang orihinal na datos ng RNA sequencing (RNA-seq) ng mga uri ng Nicotiana ay kinuha mula sa NCBI Short Reading Archives (SRA), ang bilang ng proyekto ay PRJNA301787, na iniulat nina Zhou et al. (39) at nagpatuloy gaya ng inilarawan sa (56). Ang hilaw na datos na pinoproseso ng W + W, W + OSM at W + OSS1 na katumbas ng mga uri ng Nicotiana ay pinili para sa pagsusuri sa pag-aaral na ito, at pinoproseso sa sumusunod na paraan: Una, ang hilaw na pagbasa ng RNA-seq ay kinomberte sa format na FASTQ. Kinomberte ng HISAT2 ang FASTQ sa SAM, at kinomberte naman ng SAMtools ang mga SAM file sa mga pinagsunod-sunod na BAM file. Ginagamit ang StringTie upang kalkulahin ang ekspresyon ng gene, at ang paraan ng ekspresyon nito ay mayroong mga fragment bawat libong base fragment bawat milyong sequenced transcription fragment.
Ang Acclaim chromatographic column (150 mm x 2.1 mm; laki ng particle 2.2μm) na ginamit sa pagsusuri at ang 4 mm x 4 mm guard column ay binubuo ng parehong materyal. Ang sumusunod na binary gradient ay ginagamit sa Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) system: 0 hanggang 0.5 minuto, isocratic 90% A [deionized water, 0.1% (v/v) acetonitrile at 0.05% formic acid], 10% B (Acetonitrile at 0.05% formic acid); 0.5 hanggang 23.5 minuto, ang gradient phase ay 10% A at 90% B, ayon sa pagkakabanggit; 23.5 hanggang 25 minuto, isocratic 10% A at 90% B. Ang flow rate ay 400μl/min. Para sa lahat ng pagsusuri ng MS, i-inject ang column eluent sa isang quadrupole at time-of-flight (qTOF) analyzer na may electrospray source na tumatakbo sa positive ionization mode (capillary voltage, 4500 V; capillary outlet 130 V; Temperatura ng pagpapatuyo 200°C; daloy ng hangin sa pagpapatuyo 10 litro/min).
Magsagawa ng pagsusuri ng fragment ng MS / MS (mula rito ay tatawaging MS / MS) na walang kaugnayan o hindi mapag-iba sa datos upang makakuha ng impormasyong istruktural tungkol sa pangkalahatang nakikitang metabolic profile. Ang konsepto ng indiscriminate MS/MS method ay nakasalalay sa katotohanan na ang quadrupole ay may napakalaking mass isolation window [samakatuwid, isaalang-alang ang lahat ng mass-to-charge ratio (m/z) signal bilang mga fragment]. Dahil dito, dahil ang instrumentong Impact II ay hindi nakalikha ng CE tilt, ilang independiyenteng pagsusuri ang isinagawa gamit ang mas mataas na collision-induced dissociation collision energy (CE) values. Sa madaling salita, suriin muna ang sample sa pamamagitan ng UHPLC-electrospray ionization/qTOF-MS gamit ang single mass spectrometry mode (mababang kondisyon ng fragmentation na nabuo ng in-source fragmentation), pag-scan mula m/z 50 hanggang 1500 sa repetition frequency na 5 Hz. Gamitin ang nitrogen bilang collision gas para sa pagsusuri ng MS/MS, at magsagawa ng mga independiyenteng pagsukat sa sumusunod na apat na magkakaibang collision-induced dissociation voltages: 20, 30, 40, at 50 eV. Sa buong proseso ng pagsukat, ang quadrupole ang may pinakamalaking mass isolation window, mula m/z 50 hanggang 1500. Kapag ang front body m/z at isolation width experiment ay nakatakda sa 200, ang mass range ay awtomatikong naa-activate ng operating software ng instrumento at 0 Da. I-scan para sa mga mass fragment tulad ng sa single mass mode. Gamitin ang sodium formate (50 ml isopropanol, 200 μl formic acid at 1 ml 1M NaOH aqueous solution) para sa mass calibration. Gamit ang high-precision calibration algorithm ng Bruker, ang data file ay kinakalkula pagkatapos patakbuhin ang average spectrum sa isang takdang panahon. Gamitin ang export function ng Data Analysis v4.0 software (Brook Dalton, Bremen, Germany) upang i-convert ang mga raw data file sa NetCDF format. Ang MS/MS data set ay na-save sa open metabolomics database na MetaboLights (www.ebi.ac.uk) kasama ang accession number. MTBLS1471.
Maaaring maisakatuparan ang MS/MS assembly sa pamamagitan ng correlation analysis sa pagitan ng MS1 at MS/MS quality signals para sa mababa at mataas na collision energy at mga bagong ipinatupad na rules. Ginagamit ang R script upang maisakatuparan ang correlation analysis ng distribusyon ng precursor sa product, at ginagamit naman ang C# script (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) upang ipatupad ang mga rules.
Upang mabawasan ang mga maling positibong error na dulot ng background noise at maling korelasyon na dulot ng pag-detect ng ilang m/z feature sa iilang sample lamang, ginagamit namin ang "filled peak" function ng R package XCMS (para sa background noise correction). Dapat itong gamitin upang palitan ang "NA" (undetected peak) intensity. Kapag ginamit ang fill peak function, marami pa ring "0" intensity values ​​sa data set na makakaapekto sa pagkalkula ng korelasyon. Pagkatapos, inihahambing namin ang mga resulta ng pagproseso ng data na nakuha kapag ginamit ang filled peak function at kapag hindi ginamit ang filled peak function, at kinakalkula ang background noise value batay sa average na tinantyang halaga, at pagkatapos ay pinapalitan ang mga 0 intensity values ​​na ito ng kinakalkulang background value. Isinaalang-alang din namin ang mga feature na ang intensity ay lumampas sa tatlong beses sa background value at itinuturing ang mga ito bilang "true peaks." Para sa mga kalkulasyon ng PCC, tanging ang mga m/z signal ng sample precursor (MS1) at fragment data set na may hindi bababa sa walong true peaks ang isinasaalang-alang.
Kung ang tindi ng katangian ng kalidad ng precursor sa buong sample ay may makabuluhang kaugnayan sa nabawasang tindi ng parehong katangian ng kalidad na sumasailalim sa mababa o mataas na enerhiya ng banggaan, at ang katangian ay hindi minarkahan bilang isang peak ng isotope ng CAMERA, maaari itong higit pang matukoy. Pagkatapos, sa pamamagitan ng pagkalkula ng lahat ng posibleng pares ng precursor-product sa loob ng 3 segundo (ang tinantyang window ng oras ng pagpapanatili para sa pagpapanatili ng peak), isinasagawa ang pagsusuri ng korelasyon. Kapag ang halaga ng m/z ay mas mababa kaysa sa halaga ng precursor at ang fragmentation ng MS/MS ay nangyayari sa parehong lokasyon ng sample sa set ng datos gaya ng precursor kung saan ito nagmula, saka lamang ito maituturing na isang fragment.
Batay sa dalawang simpleng tuntuning ito, hindi namin isinasama ang mga tinukoy na fragment na may mga halagang m/z na mas malaki kaysa sa m/z ng natukoy na precursor, at batay sa posisyon ng sample kung saan lumalabas ang precursor at ang tinukoy na fragment. Posible ring piliin ang mga katangiang pangkalidad na nabuo ng maraming in-source fragment na nabuo sa MS1 mode bilang mga kandidatong precursor, sa gayon ay bumubuo ng mga kalabisan na MS/MS compound. Upang mabawasan ang kalabisan ng datos na ito, kung ang pagkakatulad ng NDP ng spectra ay lumampas sa 0.6, at kabilang sila sa chromatogram na "pcgroup" na may annotation ng CAMERA, pagsasamahin namin ang mga ito. Panghuli, pagsasamahin namin ang lahat ng apat na resulta ng CE na nauugnay sa precursor at mga fragment sa panghuling deconvoluted composite spectrum sa pamamagitan ng pagpili ng pinakamataas na intensity peak sa lahat ng kandidatong peak na may parehong halagang m/z sa iba't ibang collision energies. Ang mga kasunod na hakbang sa pagproseso ay batay sa konsepto ng composite spectrum at isinasaalang-alang ang iba't ibang mga kondisyon ng CE na kinakailangan upang ma-maximize ang posibilidad ng fragmentation, dahil ang ilang mga fragment ay maaari lamang matukoy sa ilalim ng isang partikular na collision energy.
Ginamit ang RDPI (30) upang kalkulahin ang inducibility ng metabolic profile. Ang metabolic spectrum diversity (Hj index) ay hinango mula sa kasaganaan ng mga MS/MS precursor gamit ang Shannon entropy ng MS/MS frequency distribution gamit ang sumusunod na equation na inilarawan nina Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) kung saan ang Pij ay tumutugma sa relatibong frequency ng ika-i na MS/MS sa ika-j na sample (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2,…, m) t).
Ang metabolic specificity (Si index) ay binibigyang kahulugan bilang ang ekspresyong pagkakakilanlan ng isang ibinigay na MS/MS kaugnay ng dalas sa pagitan ng mga sample na isinasaalang-alang. Ang MS/MS specificity ay kinakalkula bilang Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Gamitin ang sumusunod na pormula upang sukatin ang metabolome-specific δj index ng bawat j sample, at ang average ng MS/MS specificity δj = ∑i = 1mPijSi
Ang mga MS/MS spectra ay nakahanay nang pares, at ang pagkakatulad ay kinakalkula batay sa dalawang iskor. Una, gamit ang karaniwang NDP (kilala rin bilang cosine correlation method), gamitin ang sumusunod na equation upang makuha ang segment similarity sa pagitan ng spectra. NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 kung saan ang S1 at S2. Kaugnay nito, para sa spectrum 1 at spectrum 2, pati na rin ang WS1, i at WS2, ang i ay kumakatawan sa bigat batay sa peak intensity kung saan ang pagkakaiba ng i-th common peak sa pagitan ng dalawang spectra ay mas mababa sa 0.01 Da. Ang bigat ay kinakalkula tulad ng sumusunod: W = [peak intensity] m [quality] n, m = 0.5, n = 2, gaya ng iminungkahi ng MassBank.
Isang pangalawang paraan ng pagmamarka ang ipinatupad, na kinabibilangan ng pagsusuri sa pinagsasaluhang NL sa pagitan ng MS/MS. Para dito, ginamit namin ang 52 listahan ng NL na madalas na matatagpuan sa proseso ng MS fragmentation nang sabay-sabay, at ang mas espesipikong NL (data file S1) na dati nang na-annotate para sa MS/MS spectrum ng mga pangalawang metabolite ng pinahinang uri ng Nepenthes (9, 26). Gumawa ng binary vector na 1 at 0 para sa bawat MS/MS, na tumutugma sa kasalukuyan at wala ng ilang NL ayon sa pagkakabanggit. Batay sa Euclidean distance similarity, ang NL similarity score ay kinakalkula para sa bawat pares ng binary NL vectors.
Para maisagawa ang dual clustering, ginamit namin ang R package na DiffCoEx, na batay sa extension ng Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Gamit ang NDP at NL scoring matrices ng MS/MS spectra, ginamit namin ang DiffCoEx para kalkulahin ang comparative correlation matrix. Isinasagawa ang binary clustering sa pamamagitan ng pagtatakda ng parameter na "cutreeDynamic" sa method = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, at minClusterSize = 10. Ang R source code ng DiffCoEx ay na-download mula sa karagdagang file 1 nina Tesson et al. (57); Ang kinakailangang R WGCNA software package ay matatagpuan sa https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Upang maisagawa ang pagsusuri ng MS/MS molecular network, kinalkula namin ang ipinares na spectral connectivity batay sa mga uri ng pagkakatulad ng NDP at NL, at ginamit ang Cytoscape software upang mailarawan ang topolohiya ng network gamit ang organic layout sa CyFilescape yFiles layout algorithm extension application.
Gamitin ang R bersyon 3.0.1 upang magsagawa ng pagsusuring istatistikal sa datos. Ang kahalagahang istatistikal ay tinasa gamit ang two-way analysis of variance (ANOVA), na sinundan ng Tukey's honestly significant difference (HSD) post-hoc test. Upang masuri ang pagkakaiba sa pagitan ng paggamot na herbivorous at ng kontrol, ang two-tailed distribution ng dalawang grupo ng mga sample na may parehong variance ay sinuri gamit ang Student's t test.
Para sa mga karagdagang materyales para sa artikulong ito, pakitingnan ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Ito ay isang artikulong maaaring gamitin sa bukas na pag-access na ipinamamahagi sa ilalim ng mga tuntunin ng Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, na nagpapahintulot sa paggamit, pamamahagi, at pagpaparami sa anumang midyum, hangga't ang pangwakas na paggamit ay hindi para sa komersyal na pakinabang at ang premise ay tama ang orihinal na akda. Sanggunian.
Paalala: Hinihiling lang namin sa iyo na ibigay ang iyong email address upang malaman ng taong irerekomenda mo sa pahina na gusto mong makita nila ang email at hindi ito spam. Hindi kami kukuha ng anumang email address.
Ang tanong na ito ay ginagamit upang subukan kung ikaw ay isang bisita at maiwasan ang awtomatikong pagpapadala ng spam.
Ang teorya ng impormasyon ay nagbibigay ng isang unibersal na paraan para sa paghahambing ng mga espesyal na metabolome at ang paghula ng mga teorya ng depensa sa pagsubok.
Ang teorya ng impormasyon ay nagbibigay ng isang unibersal na paraan para sa paghahambing ng mga espesyal na metabolome at ang paghula ng mga teorya ng depensa sa pagsubok.
©2021 American Association for the Advancement of Science. lahat ng karapatan ay nakalaan. Ang AAAS ay partner ng HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef at COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.