Ang artikulo ay bahagi ng paksang pananaliksik na "Pagpapabuti ng resistensya ng mga legume sa mga pathogen at peste", tingnan ang lahat ng 5 artikulo
Ang sanhi ng nekrosis ng sakit na fungal plant na Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ay gumagamit ng isang multi-tiered na estratehiya upang mahawahan ang iba't ibang halamang may sakit. Iminumungkahi ng pag-aaral na ito ang paggamit ng diamine L-ornithine, isang non-protein amino acid na nagpapasigla sa synthesis ng iba pang mahahalagang amino acid, bilang isang alternatibong estratehiya sa pamamahala upang mapahusay ang molekular, pisyolohikal at biochemical na mga tugon ng Phaseolus vulgaris L. sa puting amag na dulot ng Pseudomonas sclerotiorum. Ipinakita ng mga in vitro na eksperimento na ang L-ornithine ay makabuluhang pumigil sa paglaki ng mycelial ng S. pyrenoidosa sa isang paraan na nakadepende sa dosis. Bukod dito, maaari nitong makabuluhang bawasan ang kalubhaan ng puting amag sa ilalim ng mga kondisyon ng greenhouse. Bukod dito, pinasigla ng L-ornithine ang paglaki ng mga ginamot na halaman, na nagpapahiwatig na ang mga nasubok na konsentrasyon ng L-ornithine ay hindi phytotoxic sa mga ginamot na halaman. Bukod pa rito, pinahusay ng L-ornithine ang ekspresyon ng mga non-enzymatic antioxidant (total soluble phenolics at flavonoids) at enzymatic antioxidants (catalase (CAT), peroxidase (POX), at polyphenol oxidase (PPO)), at pinataas ang ekspresyon ng tatlong antioxidant-related genes (PvCAT1, PvSOD, at PvGR). Bukod pa rito, ipinakita ng in silico analysis ang presensya ng isang putative oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) protein sa S. sclerotiorum genome, na halos kapareho ng oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) proteins ng Aspergillus fijiensis (AfOAH) at Penicillium sp. (PlOAH) sa mga tuntunin ng functional analysis, conserved domains, at topology. Kapansin-pansin, ang pagdaragdag ng L-ornithine sa potato dextrose broth (PDB) medium ay makabuluhang nagpababa sa ekspresyon ng SsOAH gene sa S. sclerotiorum mycelia. Gayundin, ang panlabas na aplikasyon ng L-ornithine ay makabuluhang nagpababa sa ekspresyon ng SsOAH gene sa fungal mycelia na nakolekta mula sa mga ginamot na halaman. Panghuli, ang aplikasyon ng L-ornithine ay makabuluhang nagpababa sa pagtatago ng oxalic acid sa parehong PDB medium at mga nahawaang dahon. Bilang konklusyon, ang L-ornithine ay gumaganap ng mahalagang papel sa pagpapanatili ng redox status pati na rin ang pagpapahusay ng tugon sa depensa ng mga nahawaang halaman. Ang mga resulta ng pag-aaral na ito ay maaaring makatulong sa pagbuo ng mga makabago at environment-friendly na pamamaraan upang makontrol ang white mold at mapagaan ang epekto nito sa produksyon ng bean at iba pang mga pananim.
Ang puting amag, na dulot ng necrotrophic fungus na Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, ay isang mapaminsala at nakakabawas ng ani na sakit na nagdudulot ng seryosong banta sa pandaigdigang produksiyon ng bean (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Ang Sclerotinia sclerotiorum ay isa sa pinakamahirap kontrolin na mga pathogen ng halamang fungal na dala ng lupa, na may malawak na hanay ng host na mahigit 600 species ng halaman at ang kakayahang mabilis na masira ang mga tisyu ng host sa isang hindi tiyak na paraan (Liang at Rollins, 2018). Sa ilalim ng hindi kanais-nais na mga kondisyon, ito ay sumasailalim sa isang kritikal na yugto ng siklo ng buhay nito, na nananatiling hindi aktibo sa mahabang panahon bilang itim, matigas, at parang buto na mga istrukturang tinatawag na 'sclerotia' sa lupa o bilang puti, malambot na mga bukol sa mycelium o stem pith ng mga nahawaang halaman (Schwartz et al., 2005). Ang S. sclerotiorum ay may kakayahang bumuo ng sclerotia, na nagpapahintulot dito na mabuhay sa mga nahawaang bukid sa mahabang panahon at manatili sa panahon ng sakit (Schwartz et al., 2005). Ang mga sclerotia ay mayaman sa sustansya, maaaring manatili sa lupa sa mahabang panahon, at nagsisilbing pangunahing inoculum para sa mga kasunod na impeksyon (Schwartz et al., 2005). Sa ilalim ng mga kanais-nais na kondisyon, ang sclerotia ay sumisibol at gumagawa ng mga airborne spore na maaaring makahawa sa lahat ng bahagi ng halaman sa itaas ng lupa, kabilang ngunit hindi limitado sa mga bulaklak, tangkay, o pod (Schwartz et al., 2005).
Gumagamit ang Sclerotinia sclerotiorum ng isang multi-tiered na estratehiya upang mahawahan ang mga halamang host nito, na kinasasangkutan ng isang serye ng mga magkakaugnay na kaganapan mula sa sclerotial germination hanggang sa pag-unlad ng sintomas. Sa una, ang S. sclerotiorum ay gumagawa ng mga nakabitin na spore (tinatawag na ascospores) mula sa mga istrukturang parang kabute na tinatawag na apothecia, na lumilipad sa hangin at nagiging non-motile sclerotia sa mga nahawaang labi ng halaman (Bolton et al., 2006). Pagkatapos, ang fungus ay naglalabas ng oxalic acid, isang virulence factor, upang kontrolin ang pH ng plant cell wall, itaguyod ang enzymatic degradation at tissue invasion (Hegedus at Rimmer, 2005), at sugpuin ang oxidative burst ng host plant. Ang proseso ng acidification na ito ay nagpapahina sa plant cell wall, na nagbibigay ng isang kanais-nais na kapaligiran para sa normal at mahusay na operasyon ng fungal cell wall degrading enzymes (CWDEs), na nagpapahintulot sa pathogen na malampasan ang pisikal na hadlang at tumagos sa mga tisyu ng host (Marciano et al., 1983). Kapag nakapasok na, ang S. sclerotiorum ay naglalabas ng ilang CWDE, tulad ng polygalacturonase at cellulase, na nagpapadali sa pagkalat nito sa mga nahawaang tisyu at nagdudulot ng tissue necrosis. Ang paglala ng mga lesyon at hyphal mats ay humahantong sa mga katangiang sintomas ng white mold (Hegedus at Rimmer, 2005). Samantala, kinikilala ng mga halamang nasasakupan ang mga pathogen-associated molecular pattern (PAMP) sa pamamagitan ng mga pattern recognition receptor (PRR), na nagpapalitaw ng isang serye ng mga signaling event na sa huli ay nagpapagana ng mga tugon sa depensa.
Sa kabila ng mga dekada ng pagsisikap na kontrolin ang sakit, nananatili ang kakulangan ng sapat na germplasm na lumalaban sa mga halamang bean, tulad ng sa iba pang mga komersyal na pananim, dahil sa resistensya, kaligtasan, at kakayahang umangkop ng pathogen. Samakatuwid, ang pamamahala ng sakit ay lubhang mahirap at nangangailangan ng isang pinagsamang, maraming aspeto na estratehiya na kinabibilangan ng kombinasyon ng mga kasanayan sa kultura, biyolohikal na kontrol, at mga kemikal na fungicide (O'Sullivan et al., 2021). Ang kemikal na pagkontrol sa puting amag ang pinakaepektibo dahil ang mga fungicide, kapag nailapat nang tama at sa tamang oras, ay maaaring epektibong makontrol ang pagkalat ng sakit, mabawasan ang kalubhaan ng impeksyon, at mabawasan ang pagkawala ng ani. Gayunpaman, ang labis na paggamit at labis na pag-asa sa mga fungicide ay maaaring humantong sa paglitaw ng mga lumalaban na strain ng S. sclerotiorum at negatibong nakakaapekto sa mga organismong hindi target, kalusugan ng lupa, at kalidad ng tubig (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Samakatuwid, ang paghahanap ng mga alternatibo na environment-friendly ay naging isang pangunahing prayoridad.
Ang mga polyamine (PA), tulad ng putrescine, spermidine, spermine, at cadaverine, ay maaaring magsilbing mga promising na alternatibo laban sa mga pathogen ng halaman na dala ng lupa, sa gayon ay ganap o bahagyang binabawasan ang paggamit ng mga mapanganib na kemikal na fungicide (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Sa mga mas matataas na halaman, ang mga PA ay kasangkot sa maraming prosesong pisyolohikal kabilang ang, ngunit hindi limitado sa, paghahati ng selula, pagkakaiba-iba, at tugon sa mga abiotic at biotic stress (Killiny at Nehela, 2020). Maaari silang kumilos bilang mga antioxidant, tumulong sa pag-scave ng reactive oxygen species (ROS), pagpapanatili ng redox homeostasis (Nehela at Killiny, 2023), pag-induce ng mga gene na may kaugnayan sa depensa (Romero et al., 2018), pag-regulate ng iba't ibang metabolic pathways (Nehela at Killiny, 2023), pag-modulate ng endogenous phytohormones (Nehela at Killiny, 2019), pagtatatag ng systemic acquired resistance (SAR), at pag-regulate ng interaksyon ng halaman-pathogen (Nehela at Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Mahalagang tandaan na ang mga partikular na mekanismo at papel ng mga PA sa depensa ng halaman ay nag-iiba depende sa uri ng halaman, mga pathogen, at mga kondisyon sa kapaligiran. Ang pinakamaraming PA sa mga halaman ay biosynthesized mula sa essential polyamine L-ornithine (Killiny at Nehela, 2020).
Ang L-ornithine ay gumaganap ng maraming papel sa paglaki at pag-unlad ng halaman. Halimbawa, ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na sa palay (Oryza sativa), ang ornithine ay maaaring nauugnay sa pag-recycle ng nitrogen (Liu et al., 2018), ani ng palay, kalidad at aroma (Lu et al., 2020), at tugon sa stress sa tubig (Yang et al., 2000). Bukod pa rito, ang exogenous na aplikasyon ng L-ornithine ay makabuluhang nagpahusay sa drought tolerance sa sugar beet (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) at nagpagaan ng stress sa asin sa mga halamang sibuyas (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu at Çavuşoǧlu, 2021) at kasoy (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Ang potensyal na papel ng L-ornithine sa abiotic stress defense ay maaaring dahil sa pagkakasangkot nito sa akumulasyon ng proline sa mga halamang ginamot. Halimbawa, ang mga gene na may kaugnayan sa metabolismo ng proline, tulad ng ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) at proline dehydrogenase (ProDH1 at ProDH2) genes, ay naiulat na dati nang kasangkot sa pagtatanggol ng Nicotiana benthamiana at Arabidopsis thaliana laban sa mga non-host na strain ng Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar at Mysore, 2012). Sa kabilang banda, ang fungal ornithine decarboxylase (ODC) ay kinakailangan para sa paglaki ng pathogen (Singh et al., 2020). Ang pag-target sa ODC ng Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici sa pamamagitan ng host-induced gene silencing (HIGS) ay makabuluhang nagpahusay sa resistensya ng mga halamang kamatis sa Fusarium wilt (Singh et al., 2020). Gayunpaman, ang potensyal na papel ng aplikasyon ng exogenous ornithine laban sa mga biotic stress tulad ng mga phytopathogen ay hindi pa gaanong pinag-aaralan. Higit sa lahat, ang mga epekto ng ornithine sa resistensya sa sakit at ang kaugnay na biokemikal at pisyolohikal na penomena ay nananatiling hindi pa lubusang nasusuri.
Mahalaga ang pag-unawa sa kasalimuotan ng impeksyon ng S. sclerotiorum sa mga legume para sa pagbuo ng epektibong mga estratehiya sa pagkontrol. Sa pag-aaral na ito, nilalayon naming tukuyin ang potensyal na papel ng diamine L-ornithine bilang isang mahalagang salik sa pagpapahusay ng mga mekanismo ng depensa at resistensya ng mga halamang legume sa impeksyon ng Sclerotinia sclerotiorum. Ipinapalagay namin na, bukod sa pagpapahusay ng mga tugon sa depensa ng mga nahawaang halaman, ang L-ornithine ay gumaganap din ng mahalagang papel sa pagpapanatili ng redox status. Iminumungkahi namin na ang mga potensyal na epekto ng L-ornithine ay nauugnay sa regulasyon ng mga enzymatic at non-enzymatic antioxidant defense mechanism at interference sa mga fungal pathogenicity/virulence factor at mga kaugnay na protina. Ang dual functionality na ito ng L-ornithine ay ginagawa itong isang promising candidate para sa isang napapanatiling estratehiya upang mabawasan ang epekto ng white mold at mapahusay ang resistensya ng mga karaniwang pananim na legume sa malakas na fungal pathogen na ito. Ang mga resulta ng kasalukuyang pag-aaral ay maaaring makatulong sa pagbuo ng mga makabago at environment-friendly na pamamaraan upang makontrol ang white mold at mapagaan ang epekto nito sa produksyon ng legume.
Sa pag-aaral na ito, isang madaling kapitan ng panganib na komersyal na uri ng karaniwang sitaw, ang Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), ang ginamit bilang eksperimental na materyal. Ang malulusog na buto ay malugod na ibinigay ng Legume Research Department, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Egypt. Limang buto ang inihasik sa mga plastik na paso (panloob na diyametro 35 cm, lalim 50 cm) na puno ng lupang nahawaan ng S. sclerotiorum sa ilalim ng mga kondisyon ng greenhouse (25 ± 2 °C, relatibong halumigmig 75 ± 1%, 8 oras na maliwanag/16 oras na madilim). Sa loob ng 7-10 araw pagkatapos ng paghahasik (DPS), ang mga punla ay pinipiga upang mag-iwan lamang ng dalawang punla na may pantay na paglaki at tatlong ganap na lumaki na dahon sa bawat paso. Lahat ng mga nakapaso na halaman ay dinidiligan minsan bawat dalawang linggo at nilagyan ng pataba buwan-buwan sa inirerekomendang dami para sa ibinigay na uri.
Upang maghanda ng 500 mg/L na konsentrasyon ng L-ornithinediamine (kilala rin bilang (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany), 50 mg ang unang tinunaw sa 100 mL ng sterile distilled water. Ang stock solution ay pagkatapos ay diluted at ginamit sa mga kasunod na eksperimento. Sa madaling salita, anim na serye ng L-ornithine concentrations (12.5, 25, 50, 75, 100, at 125 mg/L) ang sinubukan in vitro. Bukod pa rito, ang sterile distilled water ay ginamit bilang negatibong kontrol (Mock) at ang komersyal na fungicide na "Rizolex-T" 50% wettable powder (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt) ay ginamit bilang positibong kontrol. Ang komersyal na fungicide na "Rizolex-T" ay sinubukan in vitro sa limang konsentrasyon (2, 4, 6, 8 at 10 mg/L).
Ang mga sample ng karaniwang tangkay at pod ng bean na nagpapakita ng mga tipikal na sintomas ng puting amag (infestation rate: 10–30%) ay kinolekta mula sa mga komersyal na sakahan. Bagama't karamihan sa mga nahawaang halaman ay kinilala ayon sa uri/variety (madaling kapitan sa komersyal na uri na Giza 3), ang iba, lalo na ang mga nakuha mula sa mga lokal na pamilihan, ay mula sa mga hindi kilalang uri. Ang mga nakolektang nahawaang materyales ay unang dinidisimpekta sa ibabaw gamit ang 0.5% sodium hypochlorite solution sa loob ng 3 minuto, pagkatapos ay binanlawan nang ilang beses gamit ang sterile distilled water at pinunasan ng sterile filter paper upang maalis ang sobrang tubig. Ang mga nahawaang organo ay hiniwa sa maliliit na piraso mula sa gitnang tisyu (sa pagitan ng malusog at nahawaang tisyu), kinultura sa potato dextrose agar (PDA) medium at in-incubate sa 25 ± 2 °C na may 12 oras na light/12 oras na dark cycle sa loob ng 5 araw upang pasiglahin ang pagbuo ng sclerotia. Ang mycelial tip method ay ginamit din upang linisin ang mga fungal isolate mula sa magkahalong o kontaminadong kultura. Ang purified fungal isolate ay unang kinilala batay sa mga katangiang morpolohikal nito sa kultura at pagkatapos ay kinumpirma na S. sclerotiorum batay sa mga mikroskopikong katangian. Panghuli, lahat ng purified isolates ay sinubukan para sa pathogenicity sa susceptible common bean cultivar na Giza 3 upang matugunan ang mga postulate ni Koch.
Bukod pa rito, ang pinaka-invasive na S. sclerotiorum isolate (isolate #3) ay karagdagang nakumpirma batay sa internal transcribed spacer (ITS) sequencing gaya ng inilarawan nina White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Sa madaling salita, ang mga isolate ay kinultura sa potato dextrose broth (PDB) at in-incubate sa 25 ± 2 °C sa loob ng 5-7 araw. Ang fungal mycelium ay kinolekta, sinala sa pamamagitan ng cheesecloth, hinugasan nang dalawang beses gamit ang sterile na tubig, at pinatuyo gamit ang sterile filter paper. Ang genomic DNA ay inihiwalay gamit ang Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Ang rehiyon ng ITS rDNA ay pagkatapos ay pinalaki gamit ang partikular na pares ng primer na ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; inaasahang laki: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Ang mga pinadalisay na produkto ng PCR ay isinumite para sa sequencing (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Ang mga sequence ng ITS rDNA ay sinundan nang dalawang direksyon gamit ang pamamaraan ng Sanger sequencing. Ang mga pinagsama-samang sequence ng query ay inihambing sa pinakabagong datos sa GenBank at sa National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) gamit ang BLASTn software. Ang sequence ng query ay inihambing sa 20 iba pang S. sclerotiorum strains/isolates na nakuha mula sa pinakabagong datos sa NCBI GenBank (Supplementary Table S1) gamit ang ClustalW sa Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; bersyon 11) (Kumar et al., 2024). Isinagawa ang pagsusuring ebolusyonaryo gamit ang pamamaraang maximum likelihood at ang pangkalahatang time-reversible nucleotide substitution model (Nei at Kumar, 2000). Ipinapakita ang puno na may pinakamataas na log-likelihood. Ang paunang puno para sa heuristic search ay pinipili sa pamamagitan ng pagpili ng puno na may mas mataas na log-likelihood sa pagitan ng neighbor-joining (NJ) tree (Kumar et al., 2024) at ng maximum parsimony (MP) tree. Ang puno ng NJ ay binuo gamit ang isang pairwise distance matrix na kinalkula gamit ang pangkalahatang time-reversible model (Nei at Kumar, 2000).
Ang antibacterial activity ng L-ornithine at ng bactericide na "Rizolex-T" ay natukoy in vitro gamit ang agar diffusion method. Paraan: Kumuha ng angkop na dami ng stock solution ng L-ornithine (500 mg/L) at haluin ito nang mabuti sa 10 ml ng PDA nutrient medium upang maghanda ng mga solusyon na may pangwakas na konsentrasyon na 12.5, 25, 50, 75, 100 at 125 mg/L, ayon sa pagkakabanggit. Limang konsentrasyon ng fungicide na "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 at 10 mg/L) at sterile distilled water ang ginamit bilang control. Matapos tumigas ang medium, isang bagong handang mycelial plug ng Sclerotinia sclerotiorum culture, 4 mm ang diyametro, ang inilipat sa gitna ng Petri dish at kinultura sa 25±2°C hanggang sa matakpan ng mycelium ang buong control Petri dish, at pagkatapos ay naitala ang paglaki ng fungi. Kalkulahin ang porsyento ng pagsugpo sa radial growth ng S. sclerotiorum gamit ang equation 1:
Ang eksperimento ay inulit nang dalawang beses, na may anim na biyolohikal na replika para sa bawat kontrol/eksperimental na grupo at limang paso (dalawang halaman bawat paso) para sa bawat biyolohikal na replika. Ang bawat biyolohikal na replika ay sinuri nang dalawang beses (dalawang teknikal na replika) upang matiyak ang katumpakan, pagiging maaasahan, at kakayahang ulitin ang mga resulta ng eksperimento. Bukod pa rito, ginamit ang probit regression analysis upang kalkulahin ang half-maximal inhibitory concentration (IC50) at IC99 (Prentice, 1976).
Upang masuri ang potensyal ng L-ornithine sa ilalim ng mga kondisyon ng greenhouse, dalawang magkasunod na eksperimento sa paso ang isinagawa. Sa madaling salita, ang mga paso ay pinuno ng isterilisadong lupang luwad-buhangin (3:1) at binakunahan ng bagong inihandang kultura ng S. sclerotiorum. Una, ang pinaka-mapansalakay na isolate ng S. sclerotiorum (isolate #3) ay kinultura sa pamamagitan ng paghiwa ng isang sclerotium sa kalahati, paglalagay nito nang nakaharap sa isang PDA at pag-incubate sa 25°C sa patuloy na kadiliman (24 oras) sa loob ng 4 na araw upang pasiglahin ang paglaki ng mycelial. Apat na 5 mm diameter na agar plug ang kinuha mula sa nangungunang gilid at binakunahan ng 100 g ng isang isterilisadong pinaghalong trigo at rice bran (1:1, v/v) at lahat ng flasks ay incubate sa 25 ± 2 °C sa ilalim ng 12 oras na liwanag/12 oras na dark cycle sa loob ng 5 araw upang pasiglahin ang pagbuo ng sclerotia. Ang mga nilalaman ng lahat ng flasks ay lubusang hinalo upang matiyak ang homogeneity bago idagdag ang lupa. Pagkatapos, 100 g ng pinaghalong bran na naninirahan sa lupa ang idinagdag sa bawat paso upang matiyak ang patuloy na konsentrasyon ng mga pathogen. Ang mga paso na binakunahan ay diniligan upang ma-activate ang paglaki ng fungi at inilagay sa mga kondisyon ng greenhouse sa loob ng 7 araw.
Limang buto ng uri ng Giza 3 ang itinanim sa bawat paso. Para sa mga paso na ginamitan ng L-ornithine at fungicide na Rizolex-T, ang mga isterilisadong buto ay unang ibinabad sa loob ng dalawang oras sa isang may tubig na solusyon ng dalawang compound na may pangwakas na konsentrasyon ng IC99 na humigit-kumulang 250 mg/L at 50 mg/L, ayon sa pagkakabanggit, at pagkatapos ay pinatuyo sa hangin sa loob ng isang oras bago itanim. Sa kabilang banda, ang mga buto ay ibinabad sa isterilisadong distilled water bilang negatibong kontrol. Pagkatapos ng 10 araw, bago ang unang pagdidilig, ang mga punla ay pinanipis, na nag-iiwan lamang ng dalawang malinis na punla sa bawat paso. Bukod pa rito, upang matiyak ang impeksyon ng S. sclerotiorum, ang mga tangkay ng halamang bean sa parehong yugto ng pag-unlad (10 araw) ay pinutol sa dalawang magkaibang lokasyon gamit ang isang isterilisadong panistis at humigit-kumulang 0.5 g ng pinaghalong bran na naninirahan ay inilagay sa bawat sugat, na sinundan ng mataas na humidity upang pasiglahin ang impeksyon at pag-unlad ng sakit sa lahat ng mga halamang binakunahan. Ang mga kontrol na halaman ay sinugatan din nang magkatulad at ang pantay na dami (0.5 g) ng isterilisado at hindi na-kolonisa na pinaghalong bran ay inilagay sa sugat at pinanatili sa ilalim ng mataas na humidity upang gayahin ang kapaligiran para sa pag-unlad ng sakit at matiyak ang pagkakapare-pareho sa pagitan ng mga grupo ng paggamot.
Paraan ng Paggamot: Ang mga punla ng sitaw ay dinidiligan ng 500 ml ng may tubig na solusyon ng L-ornithine (250 mg/l) o ng fungicide na Rizolex-T (50 mg/l) sa pamamagitan ng pagdidilig sa lupa, pagkatapos ay inulit ang paggamot nang tatlong beses na may pagitan na 10 araw. Ang mga kontrol na ginagamot ng placebo ay dinidiligan ng 500 ml ng isterilisadong distilled water. Lahat ng paggamot ay isinagawa sa ilalim ng mga kondisyon ng greenhouse (25 ± 2°C, 75 ± 1% relative humidity, at photoperiod na 8 oras na maliwanag/16 oras na madilim). Lahat ng paso ay dinidiligan kada dalawang linggo at binuhusan buwan-buwan ng balanseng pataba na NPK (20-20-20, na may 3.6% sulfur at TE microelements; Zain Seeds, Egypt) sa konsentrasyon na 3–4 g/l sa pamamagitan ng foliar spraying ayon sa mga rekomendasyon para sa partikular na uri at mga tagubilin ng tagagawa. Maliban kung iba ang nakasaad, ang ganap na lumawak na mga hinog na dahon (ika-2 at ika-3 dahon mula sa itaas) ay kinolekta mula sa bawat biological replicate 72 oras pagkatapos ng paggamot (hpt), hinalo-halo, pinagsama-sama, at iniimbak sa -80 °C para sa karagdagang pagsusuri kabilang ang, ngunit hindi limitado sa, in situ histochemical localization ng mga oxidative stress indicator, lipid peroxidation, enzymatic at non-enzymatic antioxidants, at gene expression.
Ang tindi ng impeksyon ng puting amag ay tinasa lingguhan 21 araw pagkatapos ng pagbabakuna (dpi) gamit ang iskala na 1–9 (Supplementary Table S2) batay sa Petzoldt at Dickson scale (1996) na binago ni Teran et al. (2006). Sa madaling salita, ang mga tangkay at sanga ng mga halamang bean ay sinuri simula sa punto ng pagbabakuna upang sundan ang pag-usad ng mga sugat sa mga internode at node. Ang distansya ng sugat mula sa punto ng pagbabakuna hanggang sa pinakamalayo na punto sa tangkay o sanga ay sinukat at ang iskor na 1–9 ay itinalaga batay sa lokasyon ng sugat, kung saan (1) ay nagpapahiwatig ng walang nakikitang impeksyon malapit sa punto ng pagbabakuna at (2–9) ay nagpapahiwatig ng unti-unting pagtaas sa laki ng sugat at pag-usad sa mga node/internode (Supplementary Table S2). Ang tindi ng impeksyon ng puting amag ay pagkatapos ay kinomberte sa porsyento gamit ang pormula 2:
Bukod pa rito, ang area under the disease progression curve (AUDPC) ay kinalkula gamit ang pormula (Shaner at Finney, 1977), na kamakailan ay inangkop para sa white rot ng common bean (Chauhan et al., 2020) gamit ang equation 3:
Kung saan ang Yi = tindi ng sakit sa oras na ti, Yi+1 = tindi ng sakit sa susunod na ti+1, ti = oras ng unang pagsukat (sa araw), ti+1 = oras ng susunod na pagsukat (sa araw), n = kabuuang bilang ng mga punto ng oras o mga punto ng obserbasyon. Ang mga parametro ng paglaki ng halamang sitaw kabilang ang taas ng halaman (cm), bilang ng mga sanga bawat halaman, at bilang ng mga dahon bawat halaman ay itinala lingguhan sa loob ng 21 araw sa lahat ng biological replicates.
Sa bawat biyolohikal na replika, ang mga sample ng dahon (pangalawa at pangatlong ganap na nabubuong dahon mula sa itaas) ay kinolekta sa ika-45 araw pagkatapos ng paggamot (15 araw pagkatapos ng huling paggamot). Ang bawat biyolohikal na replika ay binubuo ng limang paso (dalawang halaman bawat paso). Humigit-kumulang 500 mg ng dinurog na tisyu ang ginamit para sa pagkuha ng mga photosynthetic pigment (chlorophyll a, chlorophyll b at carotenoids) gamit ang 80% acetone sa 4 °C sa dilim. Pagkatapos ng 24 na oras, ang mga sample ay isinailalim sa centrifugation at ang supernatant ay kinolekta para sa pagtukoy ng nilalaman ng chlorophyll a, chlorophyll b at carotenoid sa colorimetric na paraan gamit ang isang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) ayon sa pamamaraan ng (Lichtenthaler, 1987) sa pamamagitan ng pagsukat ng absorbance sa tatlong magkakaibang wavelength (A470, A646 at A663 nm). Panghuli, ang nilalaman ng mga photosynthetic pigment ay kinalkula gamit ang mga sumusunod na pormula 4–6 na inilarawan ni Lichtenthaler (1987).
Sa ika-72 oras pagkatapos ng paggamot (hpt), ang mga dahon (pangalawa at pangatlong ganap na nabubuong dahon mula sa itaas) ay kinolekta mula sa bawat biological replicate para sa in situ histochemical localization ng hydrogen peroxide (H2O2) at superoxide anion (O2•−). Ang bawat biological replicate ay binubuo ng limang paso (dalawang halaman bawat paso). Ang bawat biological replicate ay sinuri nang duplikado (dalawang teknikal na replicate) upang matiyak ang katumpakan, pagiging maaasahan, at reproducibility ng pamamaraan. Ang H2O2 at O2•− ay natukoy gamit ang 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) o nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany), ayon sa pagkakabanggit, kasunod ng mga pamamaraang inilarawan nina Romero-Puertas et al. (2004) at Adam et al. (1989) na may kaunting mga pagbabago. Para sa histochemical localization ng H2O2 in situ, ang mga leaflet ay nilagyan ng vacuum infiltration na may 0.1% DAB sa 10 mM Tris buffer (pH 7.8) at pagkatapos ay in-incubate sa temperatura ng silid sa ilalim ng ilaw sa loob ng 60 minuto. Ang mga leaflet ay pinaputi sa 0.15% (v/v) TCA sa 4:1 (v/v) ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) at pagkatapos ay inilantad sa ilaw hanggang sa dumilim ang mga ito. Gayundin, ang mga valve ay nilagyan ng vacuum infiltration na may 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8) na naglalaman ng 0.1 w/v % HBT para sa histochemical localization ng O2•− in situ. Ang mga leaflet ay in-incubate sa ilaw sa temperatura ng silid sa loob ng 20 minuto, pagkatapos ay pinaputi gaya ng nasa itaas, at pagkatapos ay inilawan hanggang sa lumitaw ang mga matingkad na asul/lila na mga batik. Ang tindi ng nagresultang kulay kayumanggi (bilang H2O2 indicator) o asul-lila (bilang O2•− indicator) ay tinasa gamit ang bersyong Fiji ng image processing package na ImageJ (http://fiji.sc; na-access noong ika-7 ng Marso 2024).
Ang malondialdehyde (MDA; bilang marker ng lipid peroxidation) ay natukoy ayon sa pamamaraan nina Du at Bramlage (1992) na may kaunting mga pagbabago. Ang mga dahon mula sa bawat biological replicate (pangalawa at pangatlong ganap na nabubuong dahon mula sa itaas) ay kinolekta 72 oras pagkatapos ng paggamot (hpt). Ang bawat biological replicate ay may kasamang limang paso (dalawang halaman bawat paso). Ang bawat biological replicate ay sinuri nang duplikado (dalawang teknikal na replicate) upang matiyak ang katumpakan, pagiging maaasahan, at kakayahang kopyahin ang pamamaraan. Sa madaling salita, 0.5 g ng giniling na tisyu ng dahon ang ginamit para sa MDA extraction na may 20% trichloroacetic acid (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) na naglalaman ng 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Ang nilalaman ng MDA sa supernatant ay natukoy sa pamamagitan ng colorimetrical na pagsukat ng absorbance sa 532 at 600 nm gamit ang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) at pagkatapos ay ipinahayag bilang nmol g−1 FW.
Para sa pagtatasa ng mga non-enzymatic at enzymatic antioxidant, ang mga dahon (pangalawa at pangatlong ganap na nabubuong dahon mula sa itaas) ay kinolekta mula sa bawat biological replicate 72 oras pagkatapos ng paggamot (hpt). Ang bawat biological replicate ay binubuo ng limang paso (dalawang halaman bawat paso). Ang bawat biological sample ay sinuri nang duplikado (dalawang teknikal na sample). Dalawang dahon ang giniling gamit ang liquid nitrogen at direktang ginamit para sa pagtukoy ng enzymatic at non-enzymatic antioxidants, kabuuang amino acids, proline content, gene expression, at oxalate quantification.
Ang kabuuang natutunaw na phenolics ay natukoy gamit ang Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) na may kaunting pagbabago sa pamamaraang inilarawan nina Kahkonen et al. (1999). Sa madaling salita, humigit-kumulang 0.1 g ng homogenized na tisyu ng dahon ang kinuha gamit ang 20 ml 80% methanol sa dilim sa loob ng 24 oras at ang supernatant ay kinolekta pagkatapos ng centrifugation. Ang 0.1 ml ng sample extract ay hinaluan ng 0.5 ml Folin-Ciocalteu reagent (10%), inalog sa loob ng 30 segundo at iniwan sa dilim sa loob ng 5 minuto. Pagkatapos, ang 0.5 ml ng 20% ​​sodium carbonate solution (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) ay idinagdag sa bawat tubo, hinalo nang mabuti at in-incubate sa temperatura ng silid sa dilim sa loob ng 1 oras. Pagkatapos ng incubation, ang absorbance ng reaction mixture ay sinukat sa 765 nm gamit ang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Ang konsentrasyon ng total soluble phenols sa sample extracts ay natukoy gamit ang gallic acid calibration curve (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) at ipinahayag bilang milligrams ng gallic acid equivalent kada gramo ng fresh weight (mg GAE g-1 fresh weight).
Ang kabuuang soluble flavonoid content ay natukoy ayon sa pamamaraan nina Djeridane et al. (2006) na may kaunting mga pagbabago. Sa madaling salita, ang 0.3 ml ng nabanggit na methanol extract ay hinalo sa 0.3 ml ng 5% aluminum chloride solution (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), masiglang hinalo at pagkatapos ay in-incubate sa temperatura ng silid sa loob ng 5 minuto, kasunod ang pagdaragdag ng 0.3 ml ng 10% potassium acetate solution (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), lubusang hinalo at in-incubate sa temperatura ng silid sa loob ng 30 minuto sa dilim. Pagkatapos ng incubation, ang absorbance ng reaction mixture ay sinukat sa 430 nm gamit ang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Ang konsentrasyon ng kabuuang soluble flavonoids sa mga sample extract ay natukoy gamit ang rutin calibration curve (TCI America, Portland, OR, USA) at pagkatapos ay ipinahayag bilang milligrams ng rutin equivalent kada gramo ng fresh weight (mg RE g-1 fresh weight).
Ang kabuuang nilalaman ng libreng amino acid ng mga dahon ng sitaw ay natukoy gamit ang isang binagong ninhydrin reagent (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) batay sa pamamaraang iminungkahi nina Yokoyama at Hiramatsu (2003) at binago nina Sun et al. (2006). Sa madaling salita, 0.1 g ng giniling na tisyu ang kinuha gamit ang pH 5.4 buffer, at 200 μL ng supernatant ang nireact sa 200 μL ng ninhydrin (2%) at 200 μL ng pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), in-incubate sa isang kumukulong tubig sa loob ng 30 minuto, pagkatapos ay pinalamig at sinukat sa 580 nm gamit ang isang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Sa kabilang banda, ang proline ay natukoy gamit ang pamamaraang Bates (Bates et al., 1973). Ang proline ay kinuha gamit ang 3% sulfosalicylic acid (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) at pagkatapos ng centrifugation, 0.5 ml ng supernatant ay hinaluan ng 1 ml glacial acetic acid (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) at ninhydrin reagent, in-incubate sa 90°C sa loob ng 45 minuto, pinalamig at sinukat sa 520 nm gamit ang parehong spectrophotometer gaya ng nasa itaas. Ang kabuuang free amino acids at proline sa mga katas ng dahon ay natukoy gamit ang glycine at proline calibration curves (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), ayon sa pagkakabanggit, at ipinahayag bilang mg/g fresh weight.
Upang matukoy ang enzymatic activity ng mga antioxidant enzyme, humigit-kumulang 500 mg ng homogenized tissue ang kinuha gamit ang 3 ml ng 50 mM Tris buffer (pH 7.8) na naglalaman ng 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) at 7.5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), isinailalim sa centrifuge sa 10,000 × g sa loob ng 20 minuto sa ilalim ng refrigeration (4 °C), at ang supernatant (crude enzyme extract) ay kinolekta (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ang Catalase (CAT) ay muling nilagyan ng 2 ml ng 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) at 100 μl ng 269 mM H2O2 solution upang matukoy ang enzymatic activity nito ayon sa pamamaraan ni Aebi (1984) na may kaunting mga pagbabago (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ang enzymatic activity ng Guaiacol-dependent peroxidase (POX) ay natukoy gamit ang pamamaraan ni Harrach et al. (2009). (2008) na may kaunting mga pagbabago (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) at ang enzymatic activity ng polyphenol oxidase (PPO) ay natukoy pagkatapos ng reaksyon sa 2.2 ml ng 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), 100 μl ng guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) at 100 μl ng 12 mM H2O2. Ang pamamaraan ay bahagyang binago mula sa (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ang assay ay isinagawa pagkatapos ng reaksyon sa 3 ml ng catechol solution (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) na bagong handa sa 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0). Ang aktibidad ng CAT ay sinukat sa pamamagitan ng pagsubaybay sa dekomposisyon ng H2O2 sa 240 nm (A240), ang aktibidad ng POX ay sinukat sa pamamagitan ng pagsubaybay sa pagtaas ng absorbance sa 436 nm (A436), at ang aktibidad ng PPO ay sinukat sa pamamagitan ng pagtatala ng mga pagbabago-bago ng absorbance sa 495 nm (A495) bawat 30 segundo sa loob ng 3 minuto gamit ang isang UV-160A spectrophotometer (Shimadzu, Japan).
Ginamit ang real-time RT-PCR upang matukoy ang mga antas ng transcript ng tatlong gene na may kaugnayan sa antioxidant, kabilang ang peroxisomal catalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), at glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), sa mga dahon ng sitaw (ang pangalawa at pangatlong ganap na nabubuong dahon mula sa itaas) 72 oras pagkatapos ng huling paggamot. Sa madaling salita, ang RNA ay inihiwalay gamit ang Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) ayon sa protocol ng gumawa. Pagkatapos, ang cDNA ay na-synthesize gamit ang TOP script™ cDNA Synthesis Kit ayon sa mga tagubilin ng gumawa. Ang mga primer sequence ng tatlong gene sa itaas ay nakalista sa Supplementary Table S3. Ang PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) ay ginamit bilang housekeeping gene at ang relative gene expression ay kinalkula gamit ang 2-ΔΔCT method (Livak at Schmittgen, 2001). Naipakita ang estabilidad ng actin sa ilalim ng biotic stress (hindi magkatugmang interaksyon sa pagitan ng mga karaniwang legume at ng anthracnose fungus na Colletotrichum lindemuthianum) at abiotic stress (tagtuyot, kaasinan, mababang temperatura) (Borges et al., 2012).
Sa simula, nagsagawa kami ng genome-wide in silico analysis ng oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) proteins sa S. sclerotiorum gamit ang protein-protein BLAST tool (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Sa madaling salita, ginamit namin ang OAH mula sa Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 amino acids) at Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank accession number XP_056833920.1; 316 amino acids) bilang query sequences upang i-map ang homologous protein sa S. sclerotiorum (taxide: 5180). Isinagawa ang BLASTp laban sa pinakabagong makukuhang datos ng genome ng S. sclerotiorum sa GenBank sa website ng National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Bukod pa rito, ang hinulaang gene na OAH mula sa S. sclerotiorum (SsOAH) at ang evolutionary analysis at phylogenetic tree ng AfOAH mula sa A. fijiensis CBS 313.89 at PlOAH mula sa P. lagena ay hinuha gamit ang maximum likelihood method sa MEGA11 (Tamura et al., 2021) at ang JTT matrix-based model (Jones et al., 1992). Ang phylogenetic tree ay pinagsama sa multiple alignment analysis ng mga protein sequence ng lahat ng hinulaang gene na OAH (SsOAH) mula sa S. sclerotiorum at ang query sequence gamit ang Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos at Agarwala, 2007). Bukod pa rito, ang pinakamahusay na pagtutugma ng mga sequence ng amino acid ng SsOAH mula sa S. sclerotiorum ay inihanay sa mga sequence ng query (AfOAH at PlOAH) (Larkin et al., 2007) gamit ang ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), at ang mga napreserbang rehiyon sa pagkakahanay ay nakita gamit ang ESPript tool (bersyon 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Bukod pa rito, ang mga hinulaang functional representative domain at conserved sites ng S. sclerotiorum SsOAH ay interactive na inuri sa iba't ibang pamilya gamit ang InterPro tool (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Panghuli, ang three-dimensional (3D) structure modeling ng hinulaang S. sclerotiorum SsOAH ay isinagawa gamit ang Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) at napatunayan gamit ang SWISS-MODEL server (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Ang hinulaang mga istrukturang three-dimensional (PDB format) ay interactive na ipinakita gamit ang UCSF-Chimera package (bersyon 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Ginamit ang quantitative real-time fluorescence PCR upang matukoy ang transcriptional level ng oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) sa mycelia ng Sclerotinia sclerotiorum. Sa madaling salita, ang S. sclerotiorum ay ini-inoculate sa isang flask na naglalaman ng PDB at inilagay sa isang shaking incubator (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) sa 25 ± 2 °C sa loob ng 24 oras sa 150 rpm at sa palaging kadiliman (24 oras) upang pasiglahin ang paglaki ng mycelial. Pagkatapos nito, ang mga cell ay ginamot gamit ang L-ornithine at ang fungicide na Rizolex-T sa panghuling konsentrasyon ng IC50 (humigit-kumulang 40 at 3.2 mg/L, ayon sa pagkakabanggit) at pagkatapos ay kinultura pa ng 24 oras sa ilalim ng parehong mga kondisyon. Pagkatapos ng incubation, ang mga kultura ay isinailalim sa centrifuge sa 2500 rpm sa loob ng 5 minuto at ang supernatant (fungal mycelium) ay kinolekta para sa pagsusuri ng ekspresyon ng gene. Gayundin, ang fungal mycelium ay kinolekta sa 0, 24, 48, 72, 96, at 120 oras pagkatapos ng impeksyon mula sa mga nahawaang halaman na bumuo ng puting amag at cottony mycelium sa ibabaw ng mga nahawaang tisyu. Ang RNA ay kinuha mula sa fungal mycelium at pagkatapos ay ang cDNA ay na-synthesize gaya ng inilarawan sa itaas. Ang mga primer sequence para sa SsOAH ay nakalista sa Supplementary Table S3. Ang SsActin (GenBank accession number: XM_001589919.1) ay ginamit bilang housekeeping gene, at ang relative gene expression ay kinalkula gamit ang 2-ΔΔCT method (Livak at Schmittgen, 2001).
Ang oxalic acid ay natukoy sa potato dextrose broth (PDB) at mga sample ng halaman na naglalaman ng fungal pathogen na Sclerotinia sclerotiorum ayon sa pamamaraan nina Xu at Zhang (2000) na may kaunting mga pagbabago. Sa madaling salita, ang mga isolate ng S. sclerotiorum ay ini-inoculate sa mga flasks na naglalaman ng PDB at pagkatapos ay kinultura sa isang shaking incubator (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) sa 150 rpm sa 25 ± 2 °C sa loob ng 3-5 araw sa palaging kadiliman (24 oras) upang pasiglahin ang paglaki ng mycelial. Pagkatapos ng incubation, ang fungal culture ay unang sinala sa pamamagitan ng Whatman #1 filter paper at pagkatapos ay sinentrifuga sa 2500 rpm sa loob ng 5 minuto upang alisin ang natitirang mycelium. Ang supernatant ay kinolekta at iniimbak sa 4°C para sa karagdagang quantitative determination ng oxalate. Para sa paghahanda ng mga sample ng halaman, humigit-kumulang 0.1 g ng mga piraso ng tissue ng halaman ang kinuha nang tatlong beses gamit ang distilled water (2 ml bawat beses). Ang mga sample ay isinailalim sa centrifugation sa 2500 rpm sa loob ng 5 minuto, ang supernatant ay sinala nang tuyo gamit ang Whatman No. 1 filter paper at kinolekta para sa karagdagang pagsusuri.
Para sa quantitative analysis ng oxalic acid, ang reaction mixture ay inihanda sa isang glass stoppered tube sa sumusunod na pagkakasunud-sunod: 0.2 ml ng sample (o PDB culture filtrate o oxalic acid standard solution), 0.11 ml ng bromophenol blue (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 ml ng 1 M sulfuric acid (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) at 0.176 ml ng 100 mM potassium dichromate (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), at pagkatapos ay ang solusyon ay hinaluan ng 4.8 ml gamit ang distilled water, hinalo nang mabuti, at agad na inilagay sa isang 60 °C water bath. Pagkatapos ng 10 minuto, ang reaksyon ay itinigil sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 0.5 ml ng sodium hydroxide solution (NaOH; 0.75 M). Ang absorbance (A600) ng reaction mixture ay sinukat sa 600 nm gamit ang UV-160 spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Ang PDB at distilled water ay ginamit bilang mga kontrol para sa quantification ng mga culture filtrate at mga sample ng halaman, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga konsentrasyon ng oxalic acid sa mga culture filtrate, na ipinahayag bilang micrograms ng oxalic acid bawat milliliter ng PDB medium (μg.mL−1), at sa mga leaf extracts, na ipinahayag bilang micrograms ng oxalic acid bawat gramo ng fresh weight (μg.g−1 FW), ay natukoy gamit ang oxalic acid calibration curve (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Sa buong pag-aaral, lahat ng eksperimento ay dinisenyo sa isang ganap na randomized design (CRD) na may anim na biological replicates bawat treatment at limang paso bawat biological replicate (dalawang halaman bawat paso) maliban kung may ibang nakasaad. Ang mga biological replicates ay sinuri nang duplicate (dalawang teknikal na replicates). Ginamit ang mga teknikal na replicates upang suriin ang reproducibility ng parehong eksperimento ngunit hindi ginamit sa statistical analysis upang maiwasan ang mga spurious replicates. Ang datos ay sinuri nang istatistikal gamit ang analysis of variance (ANOVA) na sinundan ng Tukey-Kramer honestly significant difference (HSD) test (p ≤ 0.05). Para sa mga in vitro experiments, ang mga halaga ng IC50 at IC99 ay kinalkula gamit ang probit model at ang 95% confidence intervals ay kinalkula.
Isang kabuuang apat na isolate ang nakolekta mula sa iba't ibang bukirin ng soybean sa El Ghabiya Governorate, Egypt. Sa PDA medium, lahat ng isolate ay nakagawa ng creamy white mycelium na mabilis na naging parang cotton white (Figure 1A) at pagkatapos ay beige o brown sa yugto ng sclerotium. Ang mga sclerotia ay karaniwang siksik, itim, spherical o irregular ang hugis, 5.2 hanggang 7.7 mm ang haba at 3.4 hanggang 5.3 mm ang diyametro (Figure 1B). Bagama't apat na isolate ang nakabuo ng marginal pattern ng sclerotia sa gilid ng culture medium pagkatapos ng 10-12 araw ng incubation sa 25 ± 2 °C (Fig. 1A), ang bilang ng sclerotia bawat plato ay makabuluhang naiiba sa kanila (P < 0.001), kung saan ang isolate 3 ang may pinakamataas na bilang ng sclerotia (32.33 ± 1.53 sclerotia bawat plato; Fig. 1C). Gayundin, ang isolate #3 ay nakagawa ng mas maraming oxalic acid sa PDB kaysa sa ibang mga isolate (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fig. 1D). Ang Isolate #3 ay nagpakita ng tipikal na morpolohikal at mikroskopikong katangian ng phytopathogenic fungus na Sclerotinia sclerotiorum. Halimbawa, sa PDA, ang mga kolonya ng isolate #3 ay mabilis na lumaki, ay krema ang puti (Figure 1A), reverse beige o light salmon yellow-brown, at kinailangan ng 6-7 araw sa 25 ± 2°C upang ganap na matakpan ang ibabaw ng isang 9 cm na diyametrong plato. Batay sa mga nabanggit na morpolohikal at mikroskopikong katangian, ang isolate #3 ay kinilala bilang Sclerotinia sclerotiorum.
Pigura 1. Mga katangian at pathogenicity ng mga isolate ng S. sclerotiorum mula sa mga karaniwang pananim na legume. (A) Paglago ng mycelial ng apat na isolate ng S. sclerotiorum sa PDA medium, (B) sclerotia ng apat na isolate ng S. sclerotiorum, (C) bilang ng sclerotia (bawat plato), (D) oxalic acid secretion sa PDB medium (μg.mL−1), at (E) kalubhaan ng sakit (%) ng apat na isolate ng S. sclerotiorum sa susceptible commercial legume cultivar na Giza 3 sa ilalim ng mga kondisyon ng greenhouse. Ang mga halaga ay kumakatawan sa mean ± SD ng limang biological replicates (n = 5). Ang iba't ibang letra ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa istatistika sa pagitan ng mga paggamot (p < 0.05). (F–H) Ang mga tipikal na sintomas ng puting amag ay lumitaw sa mga tangkay at silique sa itaas ng lupa, ayon sa pagkakabanggit, 10 araw pagkatapos ng pagbabakuna gamit ang isolate #3 (dpi). (I) Ang ebolusyonaryong pagsusuri ng internal transcribed spacer (ITS) na rehiyon ng S. sclerotiorum isolate #3 ay isinagawa gamit ang maximum likelihood method at inihambing sa 20 reference isolates/strains na nakuha mula sa National Center for Biotechnology Information (NCBI) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ang mga numero sa itaas ng mga clustering lines ay nagpapahiwatig ng sakop ng rehiyon (%), at ang mga numero sa ibaba ng mga clustering lines ay nagpapahiwatig ng haba ng sanga.
Bukod pa rito, upang kumpirmahin ang pathogenicity, apat na nakuhang S. sclerotiorum isolates ang ginamit upang i-inoculate ang susceptible commercial bean cultivar na Giza 3 sa ilalim ng mga kondisyon ng greenhouse, na naaayon sa Koch's postulates (Fig. 1E). Bagama't lahat ng nakuhang fungal isolates ay pathogenic at maaaring makahawa sa green bean (cv. Giza 3), na nagdudulot ng mga tipikal na sintomas ng white mold sa lahat ng bahagi sa itaas ng lupa (Fig. 1F), lalo na sa mga tangkay (Fig. 1G) at mga pod (Fig. 1H) sa 10 araw pagkatapos ng inoculation (dpi), ang isolate 3 ang pinakaagresibo na isolate sa dalawang independiyenteng eksperimento. Ang Isolate 3 ang may pinakamataas na tindi ng sakit (%) sa mga halamang bean (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, at 76.7 ± 3.1 sa 7, 14, at 21 araw pagkatapos ng impeksyon, ayon sa pagkakabanggit; Figure 1F).
Ang pagtukoy sa pinaka-invasive na S. sclerotiorum isolate #3 ay karagdagang nakumpirma batay sa internal transcribed spacer (ITS) sequencing (Fig. 1I). Ang phylogenetic analysis sa pagitan ng isolate #3 at 20 reference isolates/strains ay nagpakita ng mataas na pagkakatulad (>99%) sa pagitan nila. Mahalagang tandaan na ang S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) ay may mataas na pagkakatulad sa American S. sclerotiorum isolate LPM36 na nakahiwalay mula sa mga tuyong buto ng gisantes (GenBank accession number MK896659.1; 540 bp) at sa Chinese S. sclerotiorum isolate YKY211 (GenBank accession number OR206374.1; 548 bp), na nagdudulot ng violet (Matthiola incana) stem rot, na lahat ay magkakahiwalay na naka-grupo sa tuktok ng dendrogram (Figure 1I). Ang bagong sequence ay idineposito na sa NCBI database at pinangalanang “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank accession number PV202792). Makikita na ang isolate 3 ang pinaka-invasive isolate; samakatuwid, ang isolate na ito ang napili para sa pag-aaral sa lahat ng kasunod na mga eksperimento.
Ang antibacterial activity ng diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) sa iba't ibang konsentrasyon (12.5, 25, 50, 75, 100 at 125 mg/L) laban sa S. sclerotiorum isolate 3 ay sinuri in vitro. Kapansin-pansin na ang L-ornithine ay nagdulot ng antibacterial effect at unti-unting pumigil sa radial growth ng S. sclerotiorum hyphae sa isang dose-dependent na paraan (Figure 2A, B). Sa pinakamataas na konsentrasyon na sinubukan (125 mg/L), ang L-ornithine ay nagpakita ng pinakamataas na mycelial growth inhibition rate (99.62 ± 0.27%; Figure 2B), na katumbas ng commercial fungicide na Rizolex-T (inhibition rate 99.45 ± 0.39%; Figure 2C) sa pinakamataas na konsentrasyon na sinubukan (10 mg/L), na nagpapahiwatig ng katulad na efficacy.
Pigura 2. In vitro antibacterial activity ng L-ornithine laban sa Sclerotinia sclerotiorum. (A) Paghahambing ng antibacterial activity ng iba't ibang konsentrasyon ng L-ornithine laban sa S. sclerotiorum gamit ang komersyal na fungicide na Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Rate ng pagsugpo (%) ng paglaki ng mycelial ng S. sclerotiorum pagkatapos ng paggamot gamit ang iba't ibang konsentrasyon ng L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 at 125 mg/L) o Rizolex-T (2, 4, 6, 8 at 10 mg/L), ayon sa pagkakabanggit. Ang mga halaga ay kumakatawan sa mean ± SD ng limang biological replicates (n = 5). Ang iba't ibang letra ay nagpapahiwatig ng mga istatistikal na pagkakaiba sa pagitan ng mga paggamot (p < 0.05). (D, E) Pagsusuri ng regresyon ng modelo ng Probit ng L-ornithine at komersyal na fungicide na Rizolex-T, ayon sa pagkakabanggit. Ang linya ng regresyon ng probit model ay ipinapakita bilang isang solidong asul na linya, at ang confidence interval (95%) ay ipinapakita bilang isang putol-putol na pulang linya.
Bukod pa rito, isinagawa ang probit regression analysis at ang mga kaukulang plot ay ipinapakita sa Table 1 at Figures 2D,E. Sa madaling salita, ang katanggap-tanggap na slope value (y = 2.92x − 4.67) at ang mga kaugnay na makabuluhang estadistika (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 at p < 0.0001; Figure 2D) ng L-ornithine ay nagpahiwatig ng pinahusay na antifungal activity laban sa S. sclerotiorum kumpara sa komersyal na fungicide na Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 at p < 0.0001) (Table 1).
Talahanayan 1. Mga halaga ng kalahating pinakamataas na konsentrasyon ng inhibitory (IC50) at IC99 (mg/l) ng L-ornithine at komersyal na fungicide na "Rizolex-T" laban sa S. sclerotiorum.
Sa pangkalahatan, ang L-ornithine (250 mg/L) ay makabuluhang nagpababa sa pag-unlad at kalubhaan ng puting amag sa mga ginamot na halamang karaniwang sitaw kumpara sa mga hindi ginamot na halamang nahawaan ng S. sclerotiorum (kontrol; Larawan 3A). Sa madaling salita, bagama't unti-unting tumaas ang kalubhaan ng sakit ng mga hindi ginamot na nahawaang halamang kontrol (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, at 92.33 ± 3.06%), ang L-ornithine ay makabuluhang nagpababa sa kalubhaan ng sakit (%) sa buong eksperimento (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, at 26.36 ± 3.07) sa 7, 14, at 21 araw pagkatapos ng paggamot (dpt), ayon sa pagkakabanggit (Larawan 3A). Gayundin, nang ang mga halamang butil na nahawaan ng S. sclerotiorum ay ginamot gamit ang 250 mg/L L-ornithine, ang area under the disease progression curve (AUDPC) ay bumaba mula 1274.33 ± 33.13 sa hindi ginamot na kontrol patungong 281.03 ± 7.95, na bahagyang mas mababa kaysa sa positibong kontrol na 50 mg/L Rizolex-T fungicide (183.61 ± 7.71; Fig. 3B). Ang parehong trend ay naobserbahan sa pangalawang eksperimento.
Larawan 3. Epekto ng panlabas na aplikasyon ng L-ornithine sa pag-unlad ng puting bulok ng karaniwang sitaw na dulot ng Sclerotinia sclerotiorum sa ilalim ng mga kondisyon ng greenhouse. (A) Kurba ng paglala ng sakit ng puting amag ng karaniwang sitaw pagkatapos ng paggamot gamit ang 250 mg/L L-ornithine. (B) Kurba ng paglala ng lawak sa ilalim ng sakit (AUDPC) ng puting amag ng karaniwang sitaw pagkatapos ng paggamot gamit ang L-ornithine. Ang mga halaga ay kumakatawan sa mean ± SD ng limang biological replicates (n = 5). Ang magkakaibang letra ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa istatistika sa pagitan ng mga paggamot (p < 0.05).
Ang exogenous na aplikasyon ng 250 mg/L L-ornithine ay unti-unting nagpataas ng taas ng halaman (Fig. 4A), bilang ng mga sanga bawat halaman (Fig. 4B), at bilang ng mga dahon bawat halaman (Fig. 4C) pagkatapos ng 42 araw. Bagama't ang komersyal na fungicide na Rizolex-T (50 mg/L) ang may pinakamalaking epekto sa lahat ng mga parameter ng nutrisyon na pinag-aralan, ang exogenous na aplikasyon ng 250 mg/L L-ornithine ang may pangalawang pinakamalaking epekto kumpara sa mga hindi ginagamot na kontrol (Figs. 4A–C). Sa kabilang banda, ang paggamot ng L-ornithine ay walang makabuluhang epekto sa nilalaman ng mga photosynthetic pigment na chlorophyll a (Fig. 4D) at chlorophyll b (Fig. 4E), ngunit bahagyang nagpataas sa kabuuang nilalaman ng carotenoid (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) kumpara sa negatibong kontrol (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) at positibong kontrol (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Sa pangkalahatan, ipinapahiwatig ng mga resultang ito na ang L-ornithine ay hindi phytotoxic sa mga ginamot na legume at maaari pa ngang pasiglahin ang kanilang paglaki.
Larawan 4. Epekto ng aplikasyon ng exogenous na L-ornithine sa mga katangian ng paglaki at mga photosynthetic pigment ng mga dahon ng bean na nahawaan ng Sclerotinia sclerotiorum sa ilalim ng mga kondisyon ng greenhouse. (A) Taas ng halaman (cm), (B) Bilang ng mga sanga bawat halaman, (C) Bilang ng mga dahon bawat halaman, (D) Nilalaman ng chlorophyll a (mg g-1 fr wt), (E) Nilalaman ng chlorophyll b (mg g-1 fr wt), (F) Kabuuang nilalaman ng carotenoid (mg g-1 fr wt). Ang mga halaga ay ang mean ± SD ng limang biological replicates (n = 5). Ang iba't ibang letra ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa istatistika sa pagitan ng mga paggamot (p < 0.05).
Ang in situ histochemical localization ng reactive oxygen species (ROS; ipinahayag bilang hydrogen peroxide [H2O2]) at mga free radical (ipinahayag bilang superoxide anions [O2•−]) ay nagpakita na ang exogenous application ng L-ornithine (250 mg/L) ay makabuluhang nagbawas sa akumulasyon ng H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) at O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) kumpara sa akumulasyon ng parehong hindi ginagamot na nahawaang halaman (173.31 ± 12.06 at 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, ayon sa pagkakabanggit) at mga halamang ginamot gamit ang 50 mg/L ng komersyal na fungicide na Rizolex-T (170.12 ± 9.50 at 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, ayon sa pagkakabanggit) sa 72 oras. Mataas na antas ng H2O2 at O2•− ang naipon sa ilalim ng hpt (Fig. 5A, B). Katulad nito, ipinakita ng TCA-based malondialdehyde (MDA) assay na ang mga halamang bean na nahawaan ng S. sclerotiorum ay nakaipon ng mas mataas na antas ng MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) sa kanilang mga dahon (Fig. 5C). Gayunpaman, ang exogenous na aplikasyon ng L-ornithine ay makabuluhang nagbawas ng lipid peroxidation gaya ng pinatutunayan ng pagbaba ng nilalaman ng MDA sa mga halamang ginamot (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Epekto ng exogenous na aplikasyon ng L-ornithine sa mga pangunahing marker ng oxidative stress at mga non-enzymatic antioxidant defense mechanism sa mga dahon ng bean na nahawaan ng S. sclerotiorum 72 oras pagkatapos ng impeksyon sa ilalim ng mga kondisyon ng greenhouse. (A) Hydrogen peroxide (H2O2; nmol g−1 FW) sa 72 hpt, (B) superoxide anion (O2•−; nmol g−1 FW) sa 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) sa 72 hpt, (D) total soluble phenols (mg GAE g−1 FW) sa 72 hpt, (E) total soluble flavonoids (mg RE g−1 FW) sa 72 hpt, (F) total free amino acids (mg g−1 FW) sa 72 hpt, at (G) proline content (mg g−1 FW) sa 72 hpt. Ang mga halaga ay kumakatawan sa mean ± standard deviation (mean ± SD) ng 5 biological replicates (n = 5). Ang iba't ibang letra ay nagpapahiwatig ng mga makabuluhang pagkakaiba sa istatistika sa pagitan ng mga paggamot (p < 0.05).