Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta para sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga estilo at JavaScript.
Ang mga insulin nanoparticle (NP) na may mataas na loading content ay nakahanap ng iba't ibang aplikasyon sa iba't ibang anyo ng dosis. Nilalayon ng gawaing ito na suriin ang epekto ng mga proseso ng freeze-drying at spray-drying sa istruktura ng mga insulin-loaded chitosan nanoparticle, mayroon o walang mannitol bilang cryoprotectant. Sinuri rin namin ang kalidad ng mga nanoparticle na ito sa pamamagitan ng muling pagtunaw sa mga ito. Bago ang dehydration, ang laki ng particle ng chitosan/sodium tripolyphosphate/insulin cross-linked nanoparticles ay na-optimize na 318 nm, ang PDI ay 0.18, ang encapsulation efficiency ay 99.4%, at ang loading ay 25.01%. Pagkatapos ng reconstitution, lahat ng nanoparticles, maliban sa mga ginawa sa pamamagitan ng freeze-drying method nang walang paggamit ng mannitol, ay napanatili ang kanilang spherical particle structure. Kung ikukumpara sa mga mannitol-containing nanoparticles na na-dehydrate sa pamamagitan ng alinmang spray, ang mannitol-free spray-dried nanoparticles ay nagpakita rin ng pinakamaliit na mean particle size (376 nm) at ang pinakamataas na loading content. (25.02%) na may katulad na encapsulation rate (98.7%) at PDI (0.20) sa pamamagitan ng mga pamamaraan ng pagpapatuyo o freeze-drying. Ang pinatuyong mga nanoparticle sa pamamagitan ng spray drying nang walang mannitol ay nagresulta rin sa pinakamabilis na paglabas ng insulin at pinakamataas na kahusayan ng cellular uptake. Ipinapakita ng pag-aaral na ito na ang spray drying ay maaaring mag-dehydrate ng mga insulin nanoparticle nang hindi nangangailangan ng mga cryoprotectant kumpara sa mga kumbensyonal na pamamaraan ng freeze drying, na lumilikha ng mas malaking kapasidad ng pagkarga, mas mababang mga kinakailangan sa additive at mga gastos sa pagpapatakbo na may malaking bentahe.
Simula nang matuklasan ito noong 19221,2,3, ang insulin at ang mga paghahanda nito sa parmasyutiko ay nakapagligtas ng buhay ng mga pasyenteng may type 1 diabetes (T1DM) at type 2 diabetes (T1DM). Gayunpaman, dahil sa mga katangian nito bilang isang high molecular weight protein, ang insulin ay madaling pinagsama-sama, nabubuwag ng mga proteolytic enzyme, at naaalis sa pamamagitan ng first-pass effect. Ang mga taong nasuring may type 1 diabetes ay nangangailangan ng mga iniksyon ng insulin habang buhay. Maraming mga pasyenteng unang nasuring may type 2 diabetes ang nangangailangan din ng pangmatagalang iniksyon ng insulin. Ang pang-araw-araw na iniksyon ng insulin ay isang seryosong pinagmumulan ng pang-araw-araw na sakit at kakulangan sa ginhawa para sa mga indibidwal na ito, na may mga negatibong epekto sa kalusugan ng isip. Bilang resulta, ang iba pang mga anyo ng pagbibigay ng insulin na nagdudulot ng mas kaunting kakulangan sa ginhawa, tulad ng pagbibigay ng oral insulin, ay malawakang pinag-aaralan5 dahil may potensyal ang mga ito na ibalik ang kalidad ng buhay ng humigit-kumulang 5 bilyong taong may diabetes sa buong mundo.
Ang teknolohiyang nanoparticle ay nagbigay ng isang makabuluhang pagsulong sa mga pagtatangka na kumuha ng oral na insulin4,6,7. Isa na epektibong nagbabalot at nagpoprotekta sa insulin mula sa pagkasira para sa naka-target na paghahatid sa mga partikular na lugar ng katawan. Gayunpaman, ang paggamit ng mga pormulasyon ng nanoparticle ay may ilang mga limitasyon, pangunahin dahil sa mga isyu sa katatagan ng mga suspensyon ng particle. Maaaring mangyari ang ilang pagsasama-sama habang iniimbak, na binabawasan ang bioavailability ng mga nanoparticle na puno ng insulin8. Bilang karagdagan, ang kemikal na katatagan ng polymer matrix ng mga nanoparticle at insulin ay dapat ding isaalang-alang upang matiyak ang katatagan ng mga insulin nanoparticle (NP). Sa kasalukuyan, ang teknolohiyang freeze-drying ang pamantayang ginto para sa paglikha ng mga matatag na NP habang pinipigilan ang mga hindi gustong pagbabago habang iniimbak9.
Gayunpaman, ang freeze-drying ay nangangailangan ng pagdaragdag ng mga cryoprotectant upang maiwasan ang epekto ng mekanikal na stress ng mga kristal ng yelo sa spherical structure ng mga NP. Malaki ang nababawasan nito sa pagkarga ng mga insulin nanoparticle pagkatapos ng lyophilization, dahil ang cryoprotectant ang sumasakop sa halos lahat ng weight ratio. Samakatuwid, ang mga nalilikhang insulin NP ay kadalasang hindi angkop para sa paggawa ng mga dry powder formulation, tulad ng mga oral tablet at oral film, dahil sa pangangailangan para sa malaking dami ng dry nanoparticle upang makamit ang therapeutic window ng insulin.
Ang spray drying ay isang kilalang at murang proseso sa industriya para sa paggawa ng mga tuyong pulbos mula sa mga likidong anyo sa industriya ng parmasyutiko10,11. Ang pagkontrol sa proseso ng pagbuo ng particle ay nagbibigay-daan para sa wastong encapsulation ng ilang bioactive compound12, 13. Bukod pa rito, ito ay naging isang epektibong pamamaraan para sa paghahanda ng mga encapsulated na protina para sa oral administration. Sa panahon ng spray drying, ang tubig ay mabilis na sumisingaw, na nakakatulong na mapanatiling mababa ang temperatura ng particle core11,14, na nagbibigay-daan sa aplikasyon nito upang i-encapsulate ang mga sangkap na sensitibo sa init. Bago ang spray drying, ang materyal na patong ay dapat na lubusang i-homogenize sa solusyon na naglalaman ng mga encapsulated na sangkap11,14. Hindi tulad ng freeze-drying, ang homogenization bago ang encapsulation sa spray-drying ay nagpapabuti sa kahusayan ng encapsulation sa panahon ng dehydration. Dahil ang proseso ng spray-drying encapsulation ay hindi nangangailangan ng mga cryoprotectant, ang spray-drying ay maaaring gamitin upang makagawa ng mga pinatuyong NP na may mataas na loading content.
Iniuulat ng pag-aaral na ito ang produksyon ng mga insulin-loaded NP sa pamamagitan ng cross-linking ng chitosan at sodium tripolyphosphate gamit ang ion gel method. Ang ion gelation ay isang paraan ng paghahanda na nagpapahintulot sa produksyon ng mga nanoparticle sa pamamagitan ng electrostatic interactions sa pagitan ng dalawa o higit pang ionic species sa ilalim ng ilang partikular na kondisyon. Ginamit ang parehong freeze-drying at spray-drying techniques upang ma-dehydrate ang na-optimize na chitosan/sodium tripolyphosphate/insulin cross-linked nanoparticles. Pagkatapos ng dehydration, sinuri ang kanilang morphology gamit ang SEM. Sinuri ang kanilang kakayahan sa recombination sa pamamagitan ng pagsukat ng kanilang size distribution, surface charge, PDI, encapsulation efficiency, at loading content. Sinuri rin ang kalidad ng mga resolubilized nanoparticles na ginawa ng iba't ibang paraan ng dehydration sa pamamagitan ng paghahambing ng kanilang insulin protection, release behavior, at cellular uptake efficacy.
Ang pH ng pinaghalong solusyon at ang ratio ng chitosan at insulin ay dalawang pangunahing salik na nakakaapekto sa laki ng particle at encapsulation efficiency (EE) ng mga huling NP, dahil direktang nakakaapekto ang mga ito sa proseso ng ionotropic gelation. Ang pH ng pinaghalong solusyon ay ipinakita na may mataas na kaugnayan sa laki ng particle at encapsulation efficiency (Fig. 1a). Gaya ng ipinapakita sa Fig. 1a, habang tumataas ang pH mula 4.0 hanggang 6.0, ang average na laki ng particle (nm) ay bumaba at ang EE ay tumaas nang malaki, habang kapag ang pH ay tumaas sa 6.5, ang average na laki ng particle ay nagsimulang tumaas at ang EE ay nanatiling hindi nagbabago. Habang tumataas ang ratio ng chitosan sa insulin, tumataas din ang average na laki ng particle. Bukod pa rito, walang pagbabago sa EE ang naobserbahan nang ang mga nanoparticle ay inihanda sa mass ratio ng chitosan/insulin na mas mataas sa 2.5:1 (w/w) (Fig. 1b). Samakatuwid, ang pinakamainam na mga kondisyon ng paghahanda sa pag-aaral na ito (pH 6.0, chitosan/insulin mass ratio na 2.5:1) ay ginamit upang maghanda ng mga nanoparticle na puno ng insulin para sa karagdagang pag-aaral. Sa ilalim ng kondisyong ito ng paghahanda, ang average na laki ng particle ng mga nanoparticle ng insulin ay na-optimize upang maging 318 nm (Fig. 1c), ang PDI ay 0.18, ang embedding efficiency ay 99.4%, ang zeta potential ay 9.8 mv, at ang insulin loading ay 25.01% (m/m). Batay sa mga resulta ng transmission electron microscopy (TEM), ang mga na-optimize na nanoparticle ay halos spherical at discrete na may medyo pare-parehong laki (Fig. 1d).
Pag-optimize ng mga parameter ng mga nanoparticle ng insulin: (a) ang epekto ng pH sa mean diameter at encapsulation efficiency (EE) ng mga nanoparticle ng insulin (inihanda sa 5:1 mass ratio ng chitosan at insulin); (b) chitosan at Impluwensya ng mass ratio ng insulin sa mean diameter at encapsulation efficiency (EE) ng mga insulin NP (inihanda sa pH 6); (c) distribusyon ng laki ng particle ng mga na-optimize na insulin nanoparticle; (d) TEM micrograph ng mga na-optimize na insulin NP.
Kilalang-kilala na ang chitosan ay isang mahinang polyelectrolyte na may pKa na 6.5. Ito ay may positibong karga sa acidic media dahil ang pangunahing amino group nito ay na-protonate ng mga hydrogen ion15. Samakatuwid, madalas itong ginagamit bilang carrier upang i-encapsulate ang mga negatibong karga na macromolecule. Sa pag-aaral na ito, ginamit ang chitosan upang i-encapsulate ang insulin na may isoelectric point na 5.3. Dahil ang chitosan ay ginagamit bilang isang coating material, sa pagtaas ng proporsyon nito, ang kapal ng panlabas na layer ng mga nanoparticle ay tumataas nang naaayon, na nagreresulta sa mas malaking average na laki ng particle. Bilang karagdagan, ang mas mataas na antas ng chitosan ay maaaring mag-encapsulate ng mas maraming insulin. Sa aming kaso, ang EE ay pinakamataas nang ang ratio ng chitosan at insulin ay umabot sa 2.5:1, at walang makabuluhang pagbabago sa EE nang patuloy na tumataas ang ratio.
Bukod sa ratio ng chitosan at insulin, ang pH ay gumanap din ng mahalagang papel sa paghahanda ng mga NP. Pinag-aralan nina Gan et al. 17 ang epekto ng pH sa laki ng particle ng mga nanoparticle ng chitosan. Natagpuan nila ang patuloy na pagbaba sa laki ng particle hanggang sa umabot ang pH sa 6.0, at isang makabuluhang pagtaas sa laki ng particle ang naobserbahan sa pH > 6.0, na naaayon sa aming mga obserbasyon. Ang phenomenon na ito ay dahil sa katotohanan na sa pagtaas ng pH, ang molekula ng insulin ay nakakakuha ng negatibong surface charge, kaya, pinapaboran ang mga electrostatic interaction sa chitosan/sodium tripolyphosphate (TPP) complex, na nagreresulta sa maliit na laki ng particle at mataas na EE. Gayunpaman, nang ang pH ay inayos sa 6.5, ang mga amino group sa chitosan ay na-deprotonate, na nagreresulta sa chitosan folding. Kaya, ang mataas na pH ay nagreresulta sa mas kaunting pagkakalantad ng mga amino ion sa TPP at insulin, na nagreresulta sa mas mababang cross-linking, mas malaking final average na laki ng particle at mas mababang EE.
Ang pagsusuri ng mga katangiang morpolohikal ng mga freeze-dried at spray-dried NP ay maaaring gumabay sa pagpili ng mas mahusay na mga pamamaraan sa dehydration at pagbuo ng pulbos. Ang mas mainam na pamamaraan ay dapat magbigay ng katatagan ng gamot, pare-parehong hugis ng particle, mataas na drug loading at mahusay na solubility sa orihinal na solusyon. Sa pag-aaral na ito, upang mas mahusay na maihambing ang dalawang pamamaraan, ginamit ang mga insulin NP na mayroon o walang 1% mannitol sa panahon ng dehydration. Ang mannitol ay ginagamit bilang bulking agent o cryoprotectant sa iba't ibang dry powder formulations para sa freeze drying at spray drying. Para sa mga lyophilized insulin nanoparticle na walang mannitol, tulad ng ipinapakita sa Figure 2a, isang mataas na porous na istraktura ng pulbos na may malalaki, hindi regular at magaspang na ibabaw ang naobserbahan sa ilalim ng scanning electron microscopy (SEM). Iilang discrete particle ang nakita sa pulbos pagkatapos ng dehydration (Fig. 2e). Ipinahiwatig ng mga resultang ito na karamihan sa mga NP ay nabulok sa panahon ng freeze-drying nang walang anumang cryoprotectant. Para sa mga freeze-dried at spray-dried insulin nanoparticle na naglalaman ng 1% mannitol, naobserbahan ang mga spherical nanoparticle na may makinis na ibabaw (Fig. 2b,d,f,h). Ang mga nanoparticle ng insulin na pinatuyo gamit ang spray-dried nang walang mannitol ay nanatiling spherical ngunit kulubot sa ibabaw (Fig. 2c). Ang mga spherical at kulubot na ibabaw ay higit pang tinalakay sa mga release behavior at cellular uptake test sa ibaba. Batay sa nakikitang anyo ng mga pinatuyong NP, ang parehong spray-dried NP na walang mannitol at NP na pinatuyo gamit ang freeze-dried at spray-dried gamit ang mannitol ay nagbunga ng pinong pulbos ng NP (Fig. 2f,g,h). Kung mas malaki ang surface area sa pagitan ng mga ibabaw ng particle, mas mataas ang solubility at samakatuwid ay mas mataas ang release rate.
Morpolohiya ng iba't ibang dehydrated insulin NPs: (a) Larawan ng SEM ng lyophilized insulin NPs na walang mannitol; (b) Larawan ng SEM ng lyophilized insulin NPs na may mannitol; (c) spray-dried insulin NPs na walang mannitol Larawan ng SEM ng ; (d) Larawan ng SEM ng insulin NPs na spray-dried gamit ang mannitol; (e) larawan ng lyophilized insulin NPs powder na walang mannitol; (f) larawan ng lyophilized insulin NPs na may mannitol; (g) Larawan ng spray-dried insulin NPs powder na walang mannitol; (h) larawan ng spray-dried insulin NPs powder na may mannitol.
Sa panahon ng freeze-drying, ang mannitol ay gumaganap bilang isang cryoprotectant, na pinapanatili ang mga NP sa isang amorphous na anyo at pinipigilan ang pinsala ng mga kristal ng yelo19. Sa kabaligtaran, walang hakbang sa pagyeyelo habang nag-spray ng pagpapatuyo. Samakatuwid, hindi kinakailangan ang mannitol sa pamamaraang ito. Sa katunayan, ang mga spray-dried NP na walang mannitol ay nagbunga ng mas pinong mga NP gaya ng naunang inilarawan. Gayunpaman, ang mannitol ay maaari pa ring magsilbing isang tagapuno sa proseso ng spray-drying upang bigyan ang mga NP ng mas spherical na istraktura20 (Fig. 2d), na nakakatulong upang makakuha ng pare-parehong pag-uugali ng paglabas ng mga naturang encapsulated NP. Bilang karagdagan, malinaw na ang ilang malalaking particle ay maaaring matukoy sa parehong freeze-dried at spray-dried insulin NP na naglalaman ng mannitol (Fig. 2b,d), na maaaring dahil sa akumulasyon ng mannitol sa particle core kasama ng encapsulated insulin. Patong ng chitosan. Mahalagang tandaan na sa pag-aaral na ito, upang matiyak na ang spherical na istraktura ay mananatiling buo pagkatapos ng dehydration, ang ratio ng mannitol at chitosan ay pinananatili sa 5:1, upang ang isang malaking halaga ng filler ay maaari ring magpalaki ng laki ng particle ng mga pinatuyong NP.
Ang Fourier transform infrared attenuated total reflection (FTIR-ATR) spectroscopy ay naglarawan sa pisikal na halo ng libreng insulin, chitosan, chitosan, TPP at insulin. Ang lahat ng dehydrated NPs ay nailalarawan gamit ang FTIR-ATR spectroscopy. Kapansin-pansin, ang band intensities na 1641, 1543 at 1412 cm-1 ay naobserbahan sa mga encapsulated NPs na freeze-dried gamit ang mannitol at sa mga NPs na spray-dried gamit at walang mannitol (Fig. 3). Gaya ng naunang naiulat, ang mga pagtaas ng lakas na ito ay nauugnay sa cross-linking sa pagitan ng chitosan, TPP at insulin. Ang imbestigasyon sa interaksyon sa pagitan ng chitosan at insulin ay nagpakita na sa FTIR spectra ng insulin-loaded chitosan nanoparticles, ang chitosan band ay nag-overlap sa insulin, na nagpapataas ng carbonyl intensity (1641 cm-1) at amine (1543 cm-1) belt. Ang mga tripolyphosphate group ng TPP ay nakaugnay sa mga ammonium group sa chitosan, na bumubuo ng isang band. sa 1412 cm-1.
FTIR-ATR spectra ng libreng insulin, chitosan, mga pisikal na halo ng chitosan/TPP/insulin at mga NP na inalis sa tubig gamit ang iba't ibang pamamaraan.
Bukod pa rito, ang mga resultang ito ay naaayon sa mga ipinakita sa SEM, na nagpakita na ang mga encapsulated na NP ay nanatiling buo kapwa noong inispray at pinatuyo gamit ang mannitol, ngunit sa kawalan ng mannitol, tanging ang spray-drying lamang ang nakagawa ng mga encapsulated na particle. Sa kabaligtaran, ang mga resulta ng FTIR-ATR spectral ng mga NP na pinatuyo gamit ang freeze-dried nang walang mannitol ay halos kapareho ng pisikal na halo ng chitosan, TPP, at insulin. Ipinapahiwatig ng resultang ito na ang mga cross-link sa pagitan ng chitosan, TPP at insulin ay wala na sa mga NP na pinatuyo gamit ang freeze-dried nang walang mannitol. Ang istruktura ng NP ay nawasak habang pinatuyo gamit ang freeze-drying nang walang cryoprotectant, na makikita sa mga resulta ng SEM (Fig. 2a). Batay sa morpolohiya at mga resulta ng FTIR ng mga dehydrated na insulin NP, tanging ang mga lyophilized, spray-dried, at mannitol-free na NP ang ginamit para sa mga eksperimento sa reconstitution at mga mannitol-free na NP dahil sa pagkabulok ng mga mannitol-free na NP habang dehydration. talakayin.
Ang dehydration ay ginagamit para sa pangmatagalang pag-iimbak at muling pagproseso sa iba pang mga pormulasyon. Ang kakayahan ng mga tuyong NP na muling mabuo pagkatapos ng pag-iimbak ay kritikal para sa kanilang paggamit sa iba't ibang pormulasyon tulad ng mga tableta at pelikula. Napansin namin na ang average na laki ng particle ng mga spray-dried insulin NP na walang mannitol ay tumaas lamang nang bahagya pagkatapos ng muling pagbubuo. Sa kabilang banda, ang laki ng particle ng mga spray-dried at freeze-dried insulin nanoparticle na may mannitol ay tumaas nang malaki (Talahanayan 1). Ang PDI at EE ay hindi makabuluhang nagbago (p > 0.05) pagkatapos ng recombination ng lahat ng NP sa pag-aaral na ito (Talahanayan 1). Ang resultang ito ay nagpapahiwatig na ang karamihan sa mga particle ay nanatiling buo pagkatapos ng muling pagkatunaw. Gayunpaman, ang pagdaragdag ng mannitol ay nagresulta sa lubos na pagbawas ng insulin loading ng mga lyophilized at spray-dried mannitol nanoparticle (Talahanayan 1). Sa kabaligtaran, ang insulin load content ng mga NP na spray-dried nang walang mannitol ay nanatiling pareho ng dati (Talahanayan 1).
Kilalang-kilala na ang pagkarga ng mga nanoparticle ay kritikal kapag ginagamit para sa mga layunin ng paghahatid ng gamot. Para sa mga NP na may mababang pagkarga, napakalaking dami ng materyal ang kinakailangan upang maabot ang therapeutic threshold. Gayunpaman, ang mataas na lagkit ng naturang mataas na konsentrasyon ng NP ay humahantong sa abala at kahirapan sa oral na pangangasiwa at mga injectable formulation, ayon sa pagkakabanggit 22. Bilang karagdagan, ang mga insulin NP ay maaari ding gamitin upang gumawa ng mga tableta at malapot na biofilms 23, 24, na nangangailangan ng paggamit ng malalaking dami ng NP sa mababang antas ng pagkarga, na nagreresulta sa malalaking tableta at makapal na biofilms na hindi angkop para sa oral na aplikasyon. Samakatuwid, ang mga dehydrated NP na may mataas na insulin load ay lubos na kanais-nais. Iminumungkahi ng aming mga resulta na ang mataas na insulin load ng mga mannitol-free spray-dried NP ay maaaring mag-alok ng maraming kaakit-akit na bentahe para sa mga alternatibong pamamaraan ng paghahatid na ito.
Ang lahat ng dehydrated NPs ay itinago sa refrigerator sa loob ng tatlong buwan. Ipinakita ng mga resulta ng SEM na ang morpolohiya ng lahat ng dehydrated NPs ay hindi nagbago nang malaki sa loob ng tatlong buwang pag-iimbak (Fig. 4). Pagkatapos ng muling paghahalo sa tubig, lahat ng NPs ay nagpakita ng bahagyang pagbaba sa EE at naglabas ng humigit-kumulang isang maliit na halaga (~5%) ng insulin sa loob ng tatlong buwang panahon ng pag-iimbak (Talahanayan 2). Gayunpaman, ang average na laki ng particle ng lahat ng nanoparticles ay tumaas. Ang laki ng particle ng mga NPs na spray-dried nang walang mannitol ay tumaas sa 525 nm, habang ang sa spray-dried at freeze-dried NPs na may mannitol ay tumaas sa 872 at 921 nm, ayon sa pagkakabanggit (Talahanayan 2).
Morpolohiya ng iba't ibang dehydrated insulin NPs na nakaimbak sa loob ng tatlong buwan: (a) SEM na imahe ng lyophilized insulin NPs na may mannitol; (b) SEM na imahe ng spray-dried insulin nanoparticles na walang mannitol; (c) walang mannitol na SEM na mga imahe ng spray-dried insulin NPs.
Bukod pa rito, nakita ang mga namuong deposito sa mga muling binuong nanoparticle ng insulin na pinatuyo gamit ang mannitol at pinatuyo gamit ang freeze-dried (Fig. S2). Maaaring sanhi ito ng malalaking partikulo na hindi maayos na nakabitin sa tubig. Ipinapakita ng lahat ng mga resulta sa itaas na ang pamamaraan ng spray drying ay maaaring protektahan ang mga nanoparticle ng insulin mula sa dehydration at ang mataas na dami ng mga nanoparticle ng insulin ay maaaring makuha nang walang anumang mga filler o cryoprotectant.
Sinubukan ang pagpapanatili ng insulin sa pH = 2.5 medium na may pepsin, trypsin, at α-chymotrypsin upang ipakita ang kakayahang pangprotekta ng mga NP laban sa enzymatic digestion pagkatapos ng dehydration. Ang pagpapanatili ng insulin ng mga dehydrated na NP ay inihambing sa mga bagong inihandang NP, at ginamit ang free insulin bilang negatibong kontrol. Sa pag-aaral na ito, nagpakita ang free insulin ng mabilis na pag-aalis ng insulin sa loob ng 4 na oras sa lahat ng tatlong enzymatic treatment (Fig. 5a–c). Sa kabaligtaran, ang pagsusuri sa pag-aalis ng insulin ng mga NP na pinatuyo gamit ang mannitol at mga NP na pinatuyo gamit o walang mannitol ay nagpakita ng mas mataas na proteksyon ng mga NP na ito laban sa enzymatic digestion, na katulad ng sa mga bagong inihandang insulin NP (figure 1).5a-c). Sa tulong ng mga nanoparticle sa pepsin, trypsin, at α-chymotrypsin, mahigit sa 50%, 60%, at 75% ng insulin ang maaaring maprotektahan sa loob ng 4 na oras, ayon sa pagkakabanggit (Fig. 5a–c). Ang kakayahang pangprotekta ng insulin na ito ay maaaring nagpapataas ng posibilidad ng mas mataas na pagsipsip ng insulin sa daluyan ng dugo25. Ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang spray drying na mayroon o walang mannitol at freeze-drying na may mannitol ay maaaring mapanatili ang kakayahang protektahan ang insulin ng mga NP pagkatapos ng dehydration.
Proteksyon at pag-uugali ng paglabas ng mga dehydrated na insulin NP: (a) proteksyon ng insulin sa solusyon ng pepsin; (b) proteksyon ng insulin sa solusyon ng trypsin; (c) proteksyon ng insulin sa pamamagitan ng solusyon ng α-chymotrypsin; (d) Ang pag-uugali ng paglabas ng mga dehydrated na NP sa solusyon na pH = 2.5; (e) ang pag-uugali ng paglabas ng mga dehydrated na NP sa solusyon na pH = 6.6; (f) ang pag-uugali ng paglabas ng mga dehydrated na NP sa solusyon na pH = 7.0.
Ang mga bagong inihandang at muling binuong tuyong insulin NP ay in-incubate sa iba't ibang buffer (pH = 2.5, 6.6, 7.0) sa 37 °C, ginagaya ang pH na kapaligiran ng tiyan, duodenum, at itaas na bahagi ng maliit na bituka, upang suriin ang epekto ng insulin sa insulin resistance. Pag-uugali ng paglabas sa iba't ibang kapaligiran. Bahagi ng gastrointestinal tract. Sa pH = 2.5, ang mga insulin-loaded NP at resolubilized dry insulin NP ay nagpakita ng paunang pagsabog ng paglabas sa loob ng unang isang oras, na sinundan ng mabagal na paglabas sa susunod na 5 oras (Fig. 5d). Ang mabilis na paglabas na ito sa simula ay malamang na resulta ng mabilis na pag-desorption sa ibabaw ng mga molekula ng protina na hindi ganap na naka-immobilize sa panloob na istruktura ng particle. Sa pH = 6.5, ang mga insulin-loaded NP at reconstituted dry insulin NP ay nagpakita ng maayos at mabagal na paglabas sa loob ng 6 na oras, dahil ang pH ng test solution ay katulad ng sa solusyon na inihanda ng NP (Fig. 5e). Sa pH = 7, ang mga NP ay hindi matatag at halos ganap na nabubulok sa loob ng unang dalawang oras (Fig. 5f). Ito ay dahil ang deprotonation ng chitosan ay nangyayari sa mas mataas na pH, na nagreresulta sa isang hindi gaanong siksik na polymer network at paglabas ng loaded insulin.
Bukod pa rito, ang mga insulin NP na pinatuyo gamit ang spray-dried na walang mannitol ay nagpakita ng mas mabilis na release profile kaysa sa iba pang mga dehydrated NP (Fig. 5d–f). Gaya ng naunang inilarawan, ang mga reconstituted insulin NP na pinatuyo gamit ang mannitol ay nagpakita ng pinakamaliit na laki ng particle. Ang maliliit na particle ay nagbibigay ng mas malaking surface area, kaya karamihan sa mga kaugnay na gamot ay nasa o malapit sa ibabaw ng particle, na nagreresulta sa mabilis na paglabas ng gamot26.
Ang cytotoxicity ng mga NP ay sinuri gamit ang MTT assay. Gaya ng ipinapakita sa Figure S4, lahat ng dehydrated NP ay natagpuang walang makabuluhang epekto sa cell viability sa mga konsentrasyon na 50–500 μg/ml, na nagmumungkahi na lahat ng dehydrated NP ay maaaring ligtas na gamitin upang maabot ang therapeutic window.
Ang atay ang pangunahing organo kung saan isinasagawa ng insulin ang mga pisyolohikal na tungkulin nito. Ang mga selulang HepG2 ay isang linya ng selula ng hepatoma ng tao na karaniwang ginagamit bilang isang in vitro hepatocyte uptake model. Dito, ginamit ang mga selulang HepG2 upang masuri ang cellular uptake ng mga NP na dehydrated gamit ang mga pamamaraan ng freeze-drying at spray-drying. Ang cellular uptake sa pamamagitan ng confocal laser scanning gamit ang flow cytometry at vision kasunod ng ilang oras ng incubation gamit ang libreng FITC insulin sa konsentrasyon na 25 μg/mL, mga bagong handang FITC insulin-loaded NP at mga dehydrated FITC insulin-loaded NP sa pantay na konsentrasyon ng insulin. Isinagawa ang mga obserbasyon sa quantitative microscopy (CLSM). Ang mga lyophilized NP na walang mannitol ay nawasak habang dehydration at hindi sinuri sa pagsusulit na ito. Ang intracellular fluorescence intensities ng mga bagong handang insulin-loaded NP, lyophilized NP na may mannitol, at spray-dried NP na may at walang mannitol (Fig. 6a) ay 4.3, 2.6, 2.4, at 4.1-fold na mas mataas kaysa sa ang mga libre. FITC-insulin group, ayon sa pagkakabanggit (Fig. 6b). Ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang encapsulated insulin ay mas malakas sa cellular uptake kaysa sa free insulin, pangunahin dahil sa mas maliit na sukat ng insulin-loaded nanoparticles na ginawa sa pag-aaral.
Pagsipsip ng selulang HepG2 pagkatapos ng 4 na oras na inkubasyon gamit ang mga bagong handang NP at mga dehydrated NP: (a) Distribusyon ng pagsipsip ng FITC-insulin ng mga selulang HepG2.(b) Heometrikong mean ng mga intensidad ng fluorescence na sinuri sa pamamagitan ng flow cytometry (n = 3), *P < 0.05 kumpara sa libreng insulin.
Gayundin, ipinakita ng mga imahe ng CLSM na ang mga intensidad ng fluorescence ng FITC ng mga bagong inihandang FITC-insulin-loaded NP at FITC-insulin-loaded spray-dried NP (walang mannitol) ay mas malakas kaysa sa iba pang mga sample (Fig. 6a). Bukod pa rito, sa pagdaragdag ng mannitol, ang mas mataas na lagkit ng solusyon ay nagpataas ng resistensya sa cellular uptake, na nagresulta sa pagbaba ng insulin proliferation. Ipinahihiwatig ng mga resultang ito na ang mga mannitol-free spray-dried NP ay nagpakita ng pinakamataas na cellular uptake efficiency dahil ang kanilang laki ng particle ay mas maliit kaysa sa freeze-dried NP pagkatapos ng muling pagkatunaw.
Ang Chitosan (average molecular weight na 100 KDa, 75–85% deacetylated) ay binili mula sa Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Ang sodium tripolyphosphate (TPP) ay binili mula sa VWR (Radnor, Pennsylvania, USA). Ang recombinant human insulin na ginamit sa pag-aaral na ito ay mula sa Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Ang Fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled human insulin at 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) ay binili mula sa Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Ang HepG2 cell line ay nakuha mula sa ATCC (Manassas, Virginia, USA). Ang lahat ng iba pang reagent ay analytical o chromatographic grade.
Maghanda ng 1 mg/ml na solusyon ng CS sa pamamagitan ng pagtunaw nito sa double distilled water (DD water) na naglalaman ng 0.1% acetic acid. Maghanda ng 1 mg/ml na solusyon ng TPP at insulin sa pamamagitan ng pagtunaw ng mga ito sa DD water at 0.1% acetic acid, ayon sa pagkakabanggit. Ang pre-emulsion ay inihanda gamit ang isang polytron PCU-2-110 high speed homogenizer (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Ang proseso ng paghahanda ay ang mga sumusunod: una, 2ml ng solusyon ng TPP ang idinaragdag sa 4ml ng solusyon ng insulin, at ang timpla ay hinalo sa loob ng 30 minuto at hinalo nang lubusan. Pagkatapos, ang pinaghalong solusyon ay idinagdag nang patak-patak sa solusyon ng CS sa pamamagitan ng isang hiringgilya sa ilalim ng high-speed stirring (10,000 rpm). Ang mga timpla ay pinanatili sa ilalim ng high-speed stirring (15,000 rpm) sa isang ice bath sa loob ng 30 minuto, at inayos ang mga ito sa isang tiyak na pH upang makakuha ng cross-linked insulin NPs. Upang higit pang i-homogenize at bawasan ang laki ng particle ng insulin NPs, ang mga ito ay i-sonicate nang karagdagang 30 minuto sa isang ice bath gamit ang isang probe-type sonicator (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany).
Ang Insulin NPS ay sinubukan para sa Z-average diameter, polydispersity index (PDI) at zeta potential gamit ang mga dynamic light scattering (DLS) measurements gamit ang Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) sa pamamagitan ng pagpapalabnaw sa mga ito sa DD water sa 25°C. Ang morpolohiya at distribusyon ng laki ay kinilala gamit ang isang Hitachi H7600 transmission electron microscope (TEM) (Hitachi, Tokyo, Japan), at ang mga imahe ay sinuri gamit ang Hitachi imaging software (Hitachi, Tokyo, Japan). Upang masuri ang encapsulation efficiency (EE) at loading capacity (LC) ng mga insulin NP, ang mga NP ay inilagay sa mga ultrafiltration tube na may molecular weight cut-off na 100 kDa at sinentrifuga sa 500 xg sa loob ng 30 minuto. Ang unencapsulated insulin sa filtrate ay tinantiya gamit ang isang Agilent 1100 Series HPLC system (Agilent, Santa Clara, California, USA) na binubuo ng isang quaternary pump, autosampler, column pampainit, at detektor ng DAD. Sinuri ang insulin gamit ang isang haliging C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, USA) at natukoy sa 214 nm. Ang mobile phase ay acetonitrile at tubig, na naglalaman ng 0.1% TFA, mga gradient ratio mula 10/90 hanggang 100/0, at pinatakbo sa loob ng 10 minuto. Ang mobile phase ay binomba sa flow rate na 1.0 ml/min. Ang temperatura ng haligi ay itinakda sa 20 °C. Kalkulahin ang mga porsyento ng EE at LC gamit ang mga equation.(1) at Eq.(2).
Sinubukan ang iba't ibang ratio ng CS/insulin mula 2.0 hanggang 4.0 upang ma-optimize ang insulin NP. Iba't ibang dami ng solusyon ng CS ang idinagdag habang inihahanda, habang ang pinaghalong insulin/TPP ay pinananatiling pare-pareho. Ang mga Insulin NP ay inihanda sa hanay ng pH na 4.0 hanggang 6.5 sa pamamagitan ng maingat na pagkontrol sa pH ng pinaghalong pagkatapos idagdag ang lahat ng solusyon (insulin, TPP at CS). Ang EE at laki ng particle ng mga nanoparticle ng insulin ay sinuri sa iba't ibang halaga ng pH at mga ratio ng masa ng CS/insulin upang ma-optimize ang pagbuo ng mga insulin NP.
Ang mga na-optimize na insulin NP ay inilagay sa lalagyang aluminyo at tinakpan ng tissue na hinigpitan ng ilang tape. Kasunod nito, ang mga lalagyang nakatornilyo ay inilagay sa isang Labconco FreeZone freeze dryer (Labconco, Kansas City, MO, USA) na may tray dryer. Ang temperatura at vacuum pressure ay itinakda sa -10 °C, 0.350 Torr sa unang 2 oras, at 0 °C at 0.120 Torr sa natitirang 22 oras ng 24 na oras upang makakuha ng mga tuyong insulin NP.
Ginamit ang Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Switzerland) upang makabuo ng encapsulated insulin. Ang mga napiling parametro ng pagpapatuyo ay: temperaturang 100 °C, daloy ng feed na 3 L/min, at daloy ng gas na 4 L/min.
Ang mga Insulin NP bago at pagkatapos ng dehydration ay kinilala gamit ang FTIR-ATR spectroscopy. Ang mga dehydrated nanoparticle pati na rin ang libreng insulin at chitosan ay sinuri gamit ang isang Spectrum 100 FTIR spectrophotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) na may kasamang universal ATR sampling accessory (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Ang mga signal average ay nakuha mula sa 16 na scan sa resolusyon na 4 cm2 sa frequency range na 4000-600 cm2.
Ang morpolohiya ng mga dry insulin NP ay tinasa gamit ang mga imahe ng SEM ng mga freeze-dried at spray-dried na insulin NP na nakuhanan ng isang Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). Ang pangunahing parametro na ginamit ay boltahe na 5 keV at kasalukuyang 30 mA.
Lahat ng dehydrated insulin NPs ay muling tinunaw sa dd water. Ang laki ng particle, PDI, EE at LC ay sinubukan muli gamit ang parehong pamamaraan na nabanggit kanina upang masuri ang kanilang kalidad pagkatapos ng dehydration. Ang katatagan ng anhydroinsulin NPs ay sinukat din sa pamamagitan ng pagsubok sa mga katangian ng mga NP pagkatapos ng matagal na pag-iimbak. Sa pag-aaral na ito, lahat ng NPs pagkatapos ng dehydration ay iniimbak sa refrigerator sa loob ng tatlong buwan. Pagkatapos ng tatlong buwan ng pag-iimbak, ang mga NP ay sinubukan para sa morphological particle size, PDI, EE at LC.
Tunawin ang 5 mL ng mga reconstituted NP sa 45 mL na naglalaman ng kunwaring gastric fluid (pH 1.2, naglalaman ng 1% pepsin), intestinal fluid (pH 6.8, naglalaman ng 1% trypsin) o chymotrypsin solution (100 g/mL, sa phosphate buffer, pH 7.8) upang masuri ang bisa ng insulin sa pagprotekta sa mga NP pagkatapos ng dehydration. In-incubate ang mga ito sa 37°C na may bilis ng pag-alog na 100 rpm. 500 μL ng solusyon ang nakolekta sa iba't ibang oras at ang konsentrasyon ng insulin ay natukoy sa pamamagitan ng HPLC.
Ang in vitro release behavior ng mga bagong handa at dehydrated na insulin NP ay sinubukan gamit ang dialysis bag method (molecular weight cut-off 100 kDa, Spectra Por Inc.). Ang mga bagong handa at muling binuong tuyong NP ay dina-dialize sa mga likido sa pH 2.5, pH 6.6, at pH 7.0 (0.1 M phosphate-buffered saline, PBS) upang gayahin ang pH environment ng tiyan, duodenum, at upper small intestine, ayon sa pagkakabanggit. Lahat ng sample ay in-incubate sa 37 °C na may patuloy na pag-alog sa 200 rpm. Sipsipin ang likido sa labas ng 5 mL dialysis bag sa mga sumusunod na oras: 0.5, 1, 2, 3, 4, at 6 na oras, at agad na punan ang volume ng sariwang dialysate. Ang kontaminasyon ng insulin sa likido ay sinuri gamit ang HPLC, at ang rate ng paglabas ng insulin mula sa mga nanoparticle ay kinalkula mula sa ratio ng libreng insulin na inilabas sa kabuuang insulin na nakapaloob sa mga nanoparticle (Equation 3).
Ang mga selulang HepG2 ng human hepatocellular carcinoma ay pinalaki sa mga dish na may 60 mm na diyametro gamit ang Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) na naglalaman ng 10% fetal bovine serum, 100 IU/mL penicillin, at 100 μg/mL streptomycin29. Ang mga kultura ay pinanatili sa 37°C, 95% relative humidity, at 5% CO2. Para sa mga uptake assay, ang mga selulang HepG2 ay itinanim sa 1 × 105 cells/ml papunta sa isang 8-well Nunc Lab-Tek chamber slide system (Thermo Fisher, NY, USA). Para sa mga cytotoxicity assay, ang mga ito ay itinanim sa 96-well plates (Corning, NY, USA) sa density na 5 × 104 cells/ml.
Ginamit ang MTT assay upang suriin ang cytotoxicity ng mga bagong handa at dehydrated na insulin NPs30. Ang mga HepG2 cell ay inilagay sa 96-well plates sa density na 5 × 104 cells/mL at kinultura sa loob ng 7 araw bago ang pagsusuri. Ang mga Insulin NP ay diluted sa iba't ibang konsentrasyon (50 hanggang 500 μg/mL) sa culture medium at pagkatapos ay ibinigay sa mga cell. Pagkatapos ng 24 na oras ng incubation, ang mga cell ay hinugasan ng 3 beses gamit ang PBS at incubated sa medium na naglalaman ng 0.5 mg/ml MTT sa loob ng karagdagang 4 na oras. Ang cytotoxicity ay tinasa sa pamamagitan ng pagsukat ng enzymatic reduction ng yellow tetrazolium MTT tungo sa purple formazan sa 570 nm gamit ang isang Tecan infinite M200 pro spectrophotometer plate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland).
Ang kahusayan sa pagsipsip ng mga NP sa pamamagitan ng confocal laser scanning microscopy at flow cytometry analysis ay sinubukan. Ang bawat well ng Nunc Lab-Tek chamber slide system ay ginamot gamit ang libreng FITC-insulin, FITC-insulin-loaded NPs, at muling binubuo ang 25 μg/mL ng dehydrated FITC-insulin NPs sa parehong konsentrasyon at in-incubate sa loob ng 4 na oras. Ang mga cell ay hinugasan ng 3 beses gamit ang PBS at inayos gamit ang 4% paraformaldehyde. Ang mga nuclei ay kinulayan ng 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Ang lokalisasyon ng insulin ay naobserbahan gamit ang isang Olympus FV1000 laser scanning/two-photon confocal microscope (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japan). Para sa flow cytometry analysis, ang parehong konsentrasyon ng 10 μg/mL free FITC-insulin, FITC-insulin-loaded NPs, at resolubilized dehydrated FITC-insulin NPs ay idinagdag sa 96-well plates na nilagyan ng mga HepG2 cells at in-incubate sa loob ng 4 na oras. 4 na oras. Pagkatapos ng 4 na oras ng incubation, ang mga selula ay tinanggal at hinugasan ng 3 beses gamit ang FBS. 5 × 104 na selula bawat sample ay sinuri gamit ang isang BD LSR II flow cytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Estados Unidos).
Ang lahat ng mga halaga ay ipinahayag bilang mean ± standard deviation. Ang mga paghahambing sa pagitan ng lahat ng mga grupo ay tinasa gamit ang one-way ANOVA o t-test sa pamamagitan ng IBM SPSS Statistics 26 para sa Mac (IBM, Endicott, New York, USA) at ang p < 0.05 ay itinuturing na makabuluhan sa istatistika.
Ipinapakita ng pag-aaral na ito ang kakayahang umangkop at kakayahan ng spray drying na mag-dehydrate ng cross-linked chitosan/TPP/insulin nanoparticles na may mas mahusay na reconstitution kumpara sa karaniwang mga pamamaraan ng freeze-drying gamit ang bulking agents o cryoprotectants capacity at mas mataas na load capacity. Ang na-optimize na insulin nanoparticles ay nagbunga ng average na laki ng particle na 318 nm at encapsulation efficiency na 99.4%. Ang mga resulta ng SEM at FTIR pagkatapos ng dehydration ay nagpakita na ang spherical structure ay napanatili lamang sa spray-dried NPs na may at walang mannitol at lyophilized na may mannitol, ngunit ang lyophilized NPs na walang mannitol ay nabulok habang dehydration. Sa reconstitution ability test, ang insulin nanoparticles na spray-dried na walang mannitol ay nagpakita ng pinakamaliit na mean particle size at pinakamataas na loading sa reconstitution. Ang release behaviors ng lahat ng dehydrated NPs na ito ay nagpakita na mabilis silang inilabas sa mga solusyon na pH = 2.5 at pH = 7, at napaka-stable sa solusyon na pH = 6.5. Kung ikukumpara sa iba pang redissolved dehydrated NPs, ang NPs Ang spray-dried na walang mannitol ay nagpakita ng pinakamabilis na paglabas. Ang resultang ito ay naaayon sa naobserbahan sa cellular uptake assay, dahil ang spray-dried NPs na walang mannitol ay halos ganap na napanatili ang cellular uptake efficiency ng mga bagong inihandang NPs. Ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang mga dry insulin nanoparticles na inihanda sa pamamagitan ng mannitol-free spray drying ay pinakaangkop para sa karagdagang pagproseso sa iba pang mga anhydrous dosage form, tulad ng mga oral tablet o bioadhesive films.
Dahil sa mga isyu sa intelektwal na ari-arian, ang mga dataset na nabuo at/o sinuri sa kasalukuyang pag-aaral ay hindi makukuha ng publiko, ngunit makukuha mula sa kani-kanilang mga may-akda kapag may makatwirang kahilingan.
Kagan, A. Type 2 diabetes: mga pinagmulang panlipunan at pang-agham, mga komplikasyong medikal, at mga implikasyon para sa mga pasyente at iba pa. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Ang pag-unlad ng insulin encapsulation: posible na ba ang oral administration ngayon? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Mga kamakailang pagsulong sa mga sistema ng paghahatid ng liposome na puno ng oral insulin para sa paggamot ng diabetes. Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).