Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS. Para sa pinakamahusay na resulta, inirerekomenda namin na gumamit ka ng mas bagong bersyon ng iyong browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site nang walang styling o JavaScript.
Ang propionic acid (PPA) ay ginagamit upang pag-aralan ang papel ng mitochondrial dysfunction sa mga neurodevelopmental disorder tulad ng autism spectrum disorder. Ang PPA ay kilalang nakakagambala sa mitochondrial biogenesis, metabolismo, at turnover. Gayunpaman, ang mga epekto ng PPA sa mitochondrial dynamics, fission at fusion ay nananatiling problematiko dahil sa masalimuot na temporal na katangian ng mga mekanismong ito. Dito, gumagamit kami ng mga komplementaryong quantitative imaging techniques upang siyasatin kung paano nakakaapekto ang PPA sa mitochondrial ultrastructure, morphology, at dynamics sa mga neuron-like SH-SY5Y cells. Ang PPA (5 mM) ay nagdulot ng malaking pagbaba sa mitochondrial area (p < 0.01), Feret diameter at circumference (p < 0.05), at area 2 (p < 0.01). Ang mitochondrial event locator analysis ay nagpakita ng malaking pagtaas (p < 0.05) sa mga fission at fusion event, sa gayon ay pinapanatili ang integridad ng mitochondrial network sa ilalim ng mga kondisyon ng stress. Bukod pa rito, ang mRNA expression ng cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) at OPA1 (p < 0.05) ay lubhang nabawasan. 01). Inilalarawan nito ang remodeling ng mitochondrial morphology, biogenesis at dynamics upang mapanatili ang function sa ilalim ng mga kondisyon ng stress. Ang aming data ay nagbibigay ng bagong pananaw sa mga epekto ng PPA sa mitochondrial dynamics at itinatampok ang gamit ng mga imaging techniques para sa pag-aaral ng mga kumplikadong regulatory mechanism na kasangkot sa mga mitochondrial stress responses.
Ang mitochondria ay mga mahalagang kalahok sa iba't ibang tungkulin ng selula na lampas sa kanilang karaniwang mga tungkulin sa produksyon ng enerhiya at biosynthesis. Ang metabolismo ng mitochondrial ay isang mahalagang regulator ng calcium signaling, metabolic at redox homeostasis, inflammatory signaling, epigenetic modifications, cell proliferation, differentiation at programmed cell death1. Sa partikular, ang metabolismo ng mitochondrial ay mahalaga para sa neuronal development, survival at function at malawak na nasasangkot sa iba't ibang manipestasyon ng neuropathology2,3,4.
Sa nakalipas na dekada, ang metabolic status ay lumitaw bilang isang sentral na regulator ng neurogenesis, differentiation, maturation at plasticity5,6. Kamakailan lamang, ang mitochondrial morphology at dynamics ay naging partikular na mahalagang bahagi ng mitosis, isang dynamic na proseso na nagpapanatili ng isang pool ng malusog na mitochondria sa loob ng mga selula. Ang mitochondrial dynamics ay kinokontrol ng mga kumplikadong interdependent pathways mula sa mitochondrial biogenesis at bioenergetics hanggang sa mitochondrial fission, fusion, transport at clearance7,8. Ang pagkagambala ng alinman sa mga integrative mechanism na ito ay nakakasira sa pagpapanatili ng malusog na mitochondrial network at may malalim na functional na mga kahihinatnan para sa neurodevelopment9,10. Sa katunayan, ang dysregulation ng mitochondrial dynamics ay naoobserbahan sa maraming psychiatric, neurodegenerative at neurodevelopmental disorders, kabilang ang autism spectrum disorders (ASD)11,12.
Ang ASD ay isang heterogeneous neurodevelopmental disorder na may komplikadong genetic at epigenetic architecture. Hindi maikakaila ang heritability ng ASD, ngunit ang pinagbabatayang molecular etiology ay nananatiling hindi gaanong nauunawaan. Ang pag-iipon ng datos mula sa mga preclinical model, clinical studies, at multi-omics molecular datasets ay nagbibigay ng tumataas na ebidensya ng mitochondrial dysfunction sa ASD13,14. Dati kaming nagsagawa ng genome-wide DNA methylation screen sa isang cohort ng mga pasyenteng may ASD at natukoy ang mga differentially methylated genes na nakakumpol sa mitochondrial metabolic pathways15. Kasunod nito ay iniulat namin ang differential methylation ng mga central regulators ng mitochondrial biogenesis at dynamics, na nauugnay sa pagtaas ng mtDNA copy number at binagong urinary metabolic profile sa ASD16. Ang aming datos ay nagbibigay ng tumataas na ebidensya na ang mitochondrial dynamics at homeostasis ay gumaganap ng isang pangunahing papel sa pathophysiology ng ASD. Samakatuwid, ang pagpapabuti ng mechanistic understanding ng relasyon sa pagitan ng mitochondrial dynamics, morphology, at function ay isang pangunahing layunin ng patuloy na pananaliksik sa mga sakit sa neurological na nailalarawan sa pamamagitan ng secondary mitochondrial dysfunction.
Ang mga pamamaraang molekular ay kadalasang ginagamit upang pag-aralan ang papel ng mga partikular na gene sa mga tugon sa stress ng mitochondrial. Gayunpaman, ang pamamaraang ito ay maaaring limitado ng maraming aspeto at temporal na katangian ng mga mekanismo ng mitotic control. Bukod dito, ang magkakaibang pagpapahayag ng mga mitochondrial gene ay isang hindi direktang tagapagpahiwatig ng mga pagbabago sa paggana, lalo na't limitado lamang ang bilang ng mga gene ang karaniwang sinusuri. Samakatuwid, mas direktang mga pamamaraan para sa pag-aaral ng mitochondrial function at bioenergetics ang iminungkahi17. Ang morpolohiya ng mitochondrial ay malapit na nauugnay sa mitochondrial dynamics. Ang hugis, koneksyon, at istraktura ng mitochondrial ay kritikal para sa produksyon ng enerhiya at kaligtasan ng mitochondrial at cell5,18. Bukod dito, ang iba't ibang bahagi ng mitosis ay nakatuon sa mga pagbabago sa mitochondrial morphology, na maaaring magsilbing kapaki-pakinabang na mga endpoint ng mitochondrial dysfunction at magbigay ng batayan para sa mga kasunod na mekanistikong pag-aaral.
Ang morpolohiya ng mitochondrial ay maaaring direktang maobserbahan gamit ang transmission electron microscopy (TEM), na nagpapahintulot sa detalyadong pag-aaral ng cellular ultrastructure. Direktang nakikita ng TEM ang morpolohiya, hugis, at istruktura ng mitochondrial cristae sa resolusyon ng mga indibidwal na mitochondria, sa halip na umasa lamang sa gene transcription, protein expression, o mitochondrial functional parameters sa mga populasyon ng cell17,19,20. Bukod pa rito, pinapadali ng TEM ang pag-aaral ng mga interaksyon sa pagitan ng mitochondria at iba pang mga organelle, tulad ng endoplasmic reticulum at autophagosomes, na gumaganap ng mga pangunahing papel sa mitochondrial function at homeostasis21,22. Kaya, ginagawa nitong isang magandang panimulang punto ang TEM para sa pag-aaral ng mitochondrial dysfunction bago tumuon sa mga partikular na pathway o gene. Habang ang mitochondrial function ay nagiging lalong nauugnay sa neuropathology, mayroong malinaw na pangangailangan na direktang at quantitative na pag-aralan ang mitochondrial morphology at dynamics sa mga in vitro neuronal model.
Sa artikulong ito, susuriin natin ang mitochondrial dynamics sa isang neuronal model ng mitochondrial dysfunction sa autism spectrum disorder. Nauna na naming iniulat ang differential methylation ng propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) sa ASD15, isang subunit ng mitochondrial propionyl-CoA carboxylase enzyme na PCC. Ang dysregulation ng PCC ay kilalang nagdudulot ng nakalalasong akumulasyon ng propionyl derivatives, kabilang ang propionic acid (PPA)23,24,25. Ang PPA ay naipakita na nakakagambala sa neuronal metabolism at nagbabago sa pag-uugali in vivo at isang itinatag na modelo ng hayop para sa pag-aaral ng mga mekanismo ng neurodevelopmental na kasangkot sa ASD26,27,28. Bukod pa rito, ang PPA ay naiulat na nakakagambala sa mitochondrial membrane potential, biogenesis at respiration in vitro at malawakang ginagamit upang imodelo ang mitochondrial dysfunction sa mga neuron29,30. Gayunpaman, ang epekto ng PPA-induced mitochondrial dysfunction sa mitochondrial morphology at dynamics ay nananatiling hindi gaanong nauunawaan.
Ang pag-aaral na ito ay gumagamit ng mga komplementaryong pamamaraan ng imaging upang masukat ang mga epekto ng PPA sa mitochondrial morphology, dynamics, at function sa mga SH-SY5Y cells. Una, bumuo kami ng isang TEM method upang mailarawan ang mga pagbabago sa mitochondrial morphology at ultrastructure17,31,32. Dahil sa dynamic na katangian ng mitochondria33, gumamit din kami ng mitochondrial event localizer (MEL) analysis upang masukat ang mga pagbabago sa balanse sa pagitan ng mga fission at fusion events, mitochondrial number at volume sa ilalim ng PPA stress. Panghuli, sinuri namin kung ang mitochondrial morphology at dynamics ay nauugnay sa mga pagbabago sa expression ng mga genes na kasangkot sa biogenesis, fission, at fusion. Kung pagsasama-samahin, inilalarawan ng aming data ang hamon ng paglilinaw sa pagiging kumplikado ng mga mekanismo na kumokontrol sa mitochondrial dynamics. Itinatampok namin ang gamit ng TEM sa pag-aaral ng mitochondrial morphology bilang isang masusukat na convergent endpoint ng mitosis sa mga SH-SY5Y cells. Bukod pa rito, itinatampok namin na ang TEM data ay nagbibigay ng pinakamayamang impormasyon kapag isinama sa mga imaging techniques na kumukuha rin ng mga dynamic na kaganapan bilang tugon sa metabolic stress. Ang karagdagang paglalarawan ng mga molecular regulatory mechanism na sumusuporta sa neuronal cell mitosis ay maaaring magbigay ng mahalagang pananaw sa mitochondrial component ng nervous system at mga neurodegenerative disease.
Upang magdulot ng mitochondrial stress, ang mga SH-SY5Y cell ay ginamot gamit ang PPA gamit ang 3 mM at 5 mM sodium propionate (NaP). Bago ang TEM, ang mga sample ay isinailalim sa cryogenic sample preparation gamit ang high-pressure freezing at freezing (Fig. 1a). Bumuo kami ng isang automated mitochondrial image analysis pipeline upang sukatin ang walong morphological parameter ng mitochondrial populations sa tatlong biological replicates. Natuklasan namin na ang paggamot ng PPA ay makabuluhang nagpabago sa apat na parameter: area 2, area, perimeter, at Feret diameter (Fig. 1b–e). Ang Area 2 ay bumaba nang malaki sa parehong 3 mM at 5 mM PPA treatment (p = 0.0183 at p = 0.002, ayon sa pagkakabanggit) (Fig. 1b), habang ang area (p = 0.003), perimeter (p = 0.0106) at Feret diameter ay pawang bumaba nang malaki. Mayroong makabuluhang pagbawas (p = 0.0172) sa 5 mM treatment group kumpara sa control group (Fig. 1c–e). Ang mga makabuluhang pagbawas sa lawak at sirkumperensiya ay nagpakita na ang mga selulang ginamitan ng 5 mM PPA ay may mas maliit at mas bilugan na mitochondria, at ang mga mitochondria na ito ay hindi gaanong pahaba kaysa sa mga nasa control cell. Ito ay naaayon din sa isang makabuluhang pagbaba sa diyametro ng Feret, isang independiyenteng parameter na nagpapahiwatig ng pagbaba sa pinakamalaking distansya sa pagitan ng mga gilid ng particle. Naobserbahan ang mga pagbabago sa ultrastructure ng cristae: ang cristae ay naging hindi gaanong kapansin-pansin sa ilalim ng impluwensya ng stress ng PPA (Fig. 1a, panel B). Gayunpaman, hindi lahat ng mga imahe ay malinaw na sumasalamin sa ultrastructure ng cristae, kaya hindi isinagawa ang isang quantitative analysis ng mga pagbabagong ito. Ang mga datos ng TEM na ito ay maaaring sumasalamin sa tatlong posibleng senaryo: (1) Pinahuhusay ng PPA ang fission o pinipigilan ang fusion, na nagiging sanhi ng pagliit ng laki ng mga umiiral na mitochondria; (2) ang pinahusay na biogenesis ay lumilikha ng bago at mas maliit na mitochondria o (3) nag-induce ng parehong mekanismo nang sabay-sabay. Bagama't ang mga kondisyong ito ay hindi maaaring makilala sa pamamagitan ng TEM, ang mga makabuluhang pagbabago sa morpolohiya ay nagpapahiwatig ng mga pagbabago sa mitochondrial homeostasis at dynamics sa ilalim ng stress ng PPA. Kasunod nito ay sinuri namin ang mga karagdagang parameter upang higit pang makilala ang mga dynamics na ito at ang mga potensyal na mekanismo na pinagbabatayan ng mga ito.
Binabago ng propionic acid (PPA) ang morpolohiya ng mitochondrial. (a) Mga larawan ng representatibong transmission electron microscopy (TEM) na nagpapakita na ang laki ng mitochondrial ay bumababa at ang mitochondria ay nagiging mas maliit at mas bilugan sa pagtaas ng paggamot ng PPA; 0 mM (hindi ginagamot), 3 mM at 5 mM, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga pulang arrow ay nagpapahiwatig ng mitochondria. (b–e) Ang mga SH-SY5Y cell na ginagamot ng PPA sa loob ng 24 na oras ay inihanda para sa TEM at ang mga resulta ay sinuri gamit ang Fiji/ImageJ. Apat sa walong parameter ang nagpakita ng mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng mga control (hindi ginagamot, 0 mM PPA) at mga ginagamot (3 mM at 5 mM PPA) na mga cell. (b) Rehiyon 2, (c) Lugar, (d) Perimeter, (e) Diametro ng Feret. Ang one-way analysis of variance (control vs. treatment) at ang Dunnett's multiple comparison test ay ginamit upang matukoy ang mga makabuluhang pagkakaiba (p < 0.05). Ang mga data point ay kumakatawan sa average na halaga ng mitochondrial para sa bawat indibidwal na cell, at ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± SEM. Ang data na ipinapakita ay kumakatawan sa n = 3, hindi bababa sa 24 na cell bawat replicate; Isang kabuuang 266 na imahe ang sinuri; * ay nagpapahiwatig ng p < 0.05, ** ay nagpapahiwatig ng p < 0.01.
Upang higit pang makilala kung paano tumutugon ang mitochondrial dynamics sa PPA, kinulayan namin ang mitochondria gamit ang tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) at gumamit ng time-lapse microscopy at MEL analysis upang matukoy at mabilang ang mitochondria pagkatapos ng 24 na oras sa 3 at 5 mM PPA. Paggamot sa mga pangyayari ng fission at fusion. (Fig. 2a). Pagkatapos ng MEL analysis, ang mitochondria ay sinuri pa upang mabilang ang bilang ng mga istruktura ng mitochondrial at ang kanilang average na volume. Naobserbahan namin ang isang maliit ngunit makabuluhang pagtaas sa bilang ng mga pangyayari ng fission na naganap sa 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] kumpara sa fission [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] at ang mga pangyayari ng fusion [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] at fusion [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] ay tumaas nang malaki sa 5 mM kumpara sa control (Fig. 3b). Ang bilang ng mitochondria ay tumaas nang malaki sa parehong 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] at 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Fig. 3c), habang ang average na volume ng bawat istruktura ng mitochondrial ay nanatiling hindi nagbabago (Fig. 3c). Kung pagsasama-samahin, ipinahihiwatig nito na ang remodeling ng mitochondrial dynamics ay nagsisilbing isang compensatory response na matagumpay na nagpapanatili ng integridad ng mitochondrial network. Ang pagtaas sa bilang ng mga pangyayari sa fission sa 3 mM PPA ay nagmumungkahi na ang pagtaas sa mitochondrial number ay bahagyang dahil sa mitochondrial fission, ngunit dahil ang average na volume ng mitochondrial ay nananatiling halos hindi nagbabago, ang biogenesis ay hindi maaaring isantabi bilang isang karagdagang compensatory response. Gayunpaman, ang mga datos na ito ay naaayon sa mas maliit, bilog na mitochondrial structures na naobserbahan ng TEM at nagpapakita rin ng mga makabuluhang pagbabago sa mitochondrial dynamics na dulot ng PPA.
Ang propionic acid (PPA) ay nagdudulot ng dynamic mitochondrial remodeling upang mapanatili ang integridad ng network. Ang mga SH-SY5Y cell ay kinultura, ginamot gamit ang 3 at 5 mM PPA sa loob ng 24 na oras at kinulayan gamit ang TMRE at Hoechst 33342 na sinundan ng MEL analysis. (a) Mga representatibong time-lapse microscopy na larawan na nagpapakita ng kulay at binarized maximum intensity projections sa oras 2 (t2) para sa bawat kondisyon. Ang mga piling rehiyon na ipinahiwatig sa bawat binary na larawan ay pinahusay at ipinapakita sa 3D sa tatlong magkakaibang time frame (t1-t3) upang ilarawan ang dinamika sa paglipas ng panahon; ang mga fusion event ay naka-highlight sa berde; ang mga fission event ay naka-highlight sa berde. Ipinapakita sa pula. (b) Karaniwang bilang ng mga dynamic na kaganapan bawat kondisyon. (c) Karaniwang bilang ng mga mitochondrial structure bawat cell. (d) Karaniwang volume (µm3) ng bawat mitochondrial structure bawat cell. Ang mga datos na ipinapakita ay kumakatawan sa n = 15 cell bawat treatment group. Ang mga error bar na ipinapakita ay kumakatawan sa mean ± SEM, scale bar = 10 μm, * p < 0.05.
Ang propionic acid (PPA) ay nagdudulot ng transcriptional suppression ng mga gene na nauugnay sa mitochondrial dynamics. Ang mga SH-SY5Y cell ay ginamot gamit ang 3 at 5 mM PPA sa loob ng 24 na oras. Ang relatibong quantipikasyon ng gene ay isinagawa gamit ang RT-qPCR at na-normalize sa B2M. Ang mga mitochondrial biogenesis gene (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 at (d) NFE2L2. Ang mga mitochondrial fusion at fission gene (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 at (i) DRP1. Ang mga makabuluhang pagkakaiba (p < 0.05) ay sinubukan gamit ang one-way ANOVA (control vs. treatment) at Dunnett's multiple comparison test: * ay nagpapahiwatig ng p < 0.05, ** ay nagpapahiwatig ng p < 0.01, at **** ay nagpapahiwatig ng p < 0.0001. Ang mga bar ay kumakatawan sa mean expression ± SEM. Ang datos na ipinapakita ay kumakatawan sa n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), at n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) na mga biyolohikal na replika.
Ang datos mula sa mga pagsusuri ng TEM at MEL ay nagpapahiwatig na ang PPA ay nagbabago sa morpolohiya at dinamika ng mitochondrial. Gayunpaman, ang mga pamamaraan ng imaging na ito ay hindi nagbibigay ng pananaw sa mga pinagbabatayang mekanismo na nagtutulak sa mga prosesong ito. Samakatuwid, sinuri namin ang ekspresyon ng mRNA ng siyam na pangunahing regulator ng mitochondrial dynamics, biogenesis, at mitosis bilang tugon sa paggamot ng PPA. Tinantiya namin ang cell myeloma oncogene (cMYC), nuclear respiratory factor (NRF1), mitochondrial transcription factor 1 (TFAM), NFE2-like transcription factor BZIP (NFE2L2), gastrin-like protein 2 (STOML2), optic nerve atrophy 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) at dynamin-related protein 1 (DRP1) pagkatapos ng 24 na oras ng paggamot gamit ang 3 mM at 5 mM PPA. Naobserbahan namin ang 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 at p < 0.0001, ayon sa pagkakabanggit) at 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) na paggamot gamit ang PPA. (Larawan 3a–c). Ang pagbaba sa ekspresyon ng mRNA ay dose-dependent: ang ekspresyon ng cMYC, NRF1 at TFAM ay bumaba ng 5.7, 2.6 at 1.9 beses sa 3 mM, ayon sa pagkakabanggit, at ng 11.2, 3 at 2.2 beses sa 5 mM. Sa kabaligtaran, ang central redox biogenesis gene na NFE2L2 ay hindi nabago sa anumang konsentrasyon ng PPA, bagama't isang katulad na dose-dependent trend ng pagbaba ng ekspresyon ang naobserbahan (Larawan 3d).
Sinuri rin namin ang ekspresyon ng mga klasikal na gene na kasangkot sa regulasyon ng fission at fusion. Ang STOML2 ay pinaniniwalaang kasangkot sa fusion, mitophagy at biogenesis, at ang ekspresyon nito ay makabuluhang nabawasan (p < 0.0001) ng 3 mM (2.4-fold na pagbabago) at 5 mM (2.8-fold na pagbabago) PPA (Fig. 1). 3d). Katulad nito, ang ekspresyon ng OPA1 fusion gene ay nabawasan sa 3 mM (1.6-fold na pagbabago) at 5 mM (1.9-fold na pagbabago) PPA (p = 0.006 at p = 0.0024, ayon sa pagkakabanggit) (Fig. 3f). Gayunpaman, hindi kami nakakita ng mga makabuluhang pagkakaiba sa ekspresyon ng mga fusion gene na MFN1, MFN2 o fission gene na DRP1 sa ilalim ng 24-h PPA stress (Fig. 3g–i). Bukod pa rito, natuklasan namin na ang mga antas ng apat na fusion at fission protein (OPA1, MFN1, MFN2 at DRP1) ay hindi nagbago sa ilalim ng parehong mga kondisyon (Fig. 4a–d). Mahalagang tandaan na ang mga datos na ito ay sumasalamin sa isang punto sa panahon at maaaring hindi sumasalamin sa mga pagbabago sa ekspresyon ng protina o mga antas ng aktibidad sa mga unang yugto ng stress ng PPA. Gayunpaman, ang mga makabuluhang pagbawas sa ekspresyon ng cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, at OPA1 ay nagpapahiwatig ng makabuluhang transcriptional dysregulation ng mitochondrial metabolism, biogenesis, at dynamics. Bukod pa rito, itinatampok ng mga datos na ito ang gamit ng mga imaging technique upang direktang pag-aralan ang mga end-state na pagbabago sa mitochondrial function.
Hindi nagbago ang antas ng protina ng fusion at fission factor pagkatapos ng paggamot gamit ang propionic acid (PPA). Ang mga selula ng SH-SY5Y ay ginamot gamit ang 3 at 5 mM PPA sa loob ng 24 na oras. Ang mga antas ng protina ay tinantiya sa pamamagitan ng pagsusuri ng Western blot, at ang mga antas ng ekspresyon ay na-normalize sa kabuuang protina. Ipinapakita ang average na ekspresyon ng protina at mga kinatawan na Western blots ng target at kabuuang protina. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Ang mga bar ay kumakatawan sa mean ± SEM, at ang datos na ipinapakita ay kumakatawan sa n = 3 biological replicates. Isinagawa ang maraming paghahambing (p < 0.05) gamit ang one-way analysis of variance at Dunnett's test. Ang orihinal na gel at blot ay ipinapakita sa Figure S1.
Ang mitochondrial dysfunction ay nauugnay sa mga sakit na multisystem mula sa metabolic, cardiovascular at muscular diseases hanggang sa mga sakit sa neurological1,10. Maraming neurodegenerative at neurodegenerative na sakit ang nauugnay sa mitochondrial dysfunction, na nagpapakita ng kahalagahan ng mga organelle na ito sa buong buhay ng utak. Kabilang sa mga sakit na ito ang Parkinson's disease, Alzheimer's disease at ASD3,4,18. Gayunpaman, mahirap ang pag-access sa tisyu ng utak upang pag-aralan ang mga sakit na ito, lalo na sa antas ng mekanismo, kaya't ang mga cellular model system ay isang kinakailangang alternatibo. Sa pag-aaral na ito, gumagamit kami ng isang cellular model system gamit ang mga PPA-treated SH-SY5Y cells upang muling buuin ang mitochondrial dysfunction na naobserbahan sa mga neuronal disease, lalo na ang mga autism spectrum disorder. Ang paggamit ng PPA model na ito upang pag-aralan ang mitochondrial dynamics sa mga neuron ay maaaring magbigay ng pananaw sa etiology ng ASD.
Sinuri namin ang posibilidad ng paggamit ng TEM upang tingnan ang mga pagbabago sa mitochondrial morphology. Mahalagang tandaan na ang TEM ay dapat gamitin nang tama upang mapakinabangan ang bisa nito. Ang paghahanda ng mga cryo-specimen ay nagbibigay-daan para sa mas mahusay na pangangalaga ng mga neuronal structure sa pamamagitan ng sabay na pag-aayos ng mga cellular component at pagbabawas ng pagbuo ng mga artifact34. Kasabay nito, naobserbahan namin na ang mga neuron-like SH-SY5Y cell ay may buo na mga subcellular organelle at pahabang mitochondria (Fig. 1a). Itinatampok nito ang gamit ng mga cryogenic preparation technique para sa pag-aaral ng mitochondrial morphology sa mga neuronal cell model. Bagama't mahalaga ang mga quantitative measurement para sa obhetibong pagsusuri ng datos ng TEM, wala pa ring pinagkasunduan kung anong mga partikular na parameter ang dapat sukatin upang kumpirmahin ang mga pagbabago sa mitochondrial morphology. Batay sa isang malaking bilang ng mga pag-aaral na quantitatively na sumuri sa mitochondrial morphology17,31,32, bumuo kami ng isang automated mitochondrial image analysis pipeline na sumusukat sa walong morphological parameter, katulad ng: area, area2, aspect ratio, perimeter, circularity, degree, Feret diameter, at roundness.
Kabilang sa mga ito, ang PPA ay makabuluhang nagbawas sa area 2, area, perimeter, at diametro ng Feret (Fig. 1b–e). Ipinakita nito na ang mitochondria ay naging mas maliit at mas bilugan, na naaayon sa mga nakaraang pag-aaral na nagpapakita ng pagbaba sa mitochondrial area pagkatapos ng 72 oras ng PPA30-induced mitochondrial stress. Ang mga katangiang morpolohikal na ito ay maaaring magpahiwatig ng mitochondrial fission, isang kinakailangang proseso upang ihiwalay ang mga nasirang bahagi mula sa mitochondrial network upang maisulong ang kanilang pagkasira sa pamamagitan ng mitophagy35,36,37. Sa kabilang banda, ang pagbaba sa average na laki ng mitochondrial ay maaaring nauugnay sa pagtaas ng biogenesis, na nagreresulta sa pagbuo ng maliliit na bagong silang na mitochondria. Ang pagtaas ng fission o biogenesis ay kumakatawan sa isang compensatory response upang mapanatili ang mitosis laban sa mitochondrial stress. Gayunpaman, ang pagbaba ng mitochondrial growth, impaired fusion, o iba pang mga kondisyon ay hindi maaaring ibukod.
Bagama't ang mga imaheng may mataas na resolusyon na nilikha ng TEM ay nagbibigay-daan sa pagtukoy ng mga katangiang morpolohikal sa antas ng indibidwal na mitochondria, ang pamamaraang ito ay lumilikha ng mga two-dimensional na snapshot sa isang punto ng oras. Upang pag-aralan ang mga dynamic na tugon sa metabolic stress, kinulayan namin ang mitochondria gamit ang TMRE at gumamit ng time-lapse microscopy na may MEL analysis, na nagbibigay-daan sa high-throughput na 3D visualization ng mga pagbabago sa mitochondrial network sa paglipas ng panahon33,38. Naobserbahan namin ang mga banayad ngunit makabuluhang pagbabago sa mitochondrial dynamics sa ilalim ng PPA stress (Fig. 2). Sa 3 mM, ang bilang ng mga fission event ay tumaas nang malaki, habang ang mga fusion event ay nanatiling pareho sa control. Isang pagtaas sa bilang ng parehong fission at fusion event ang naobserbahan sa 5 mM PPA, ngunit ang mga pagbabagong ito ay humigit-kumulang proporsyonal, na nagmumungkahi na ang fission at fusion kinetics ay umaabot sa equilibrium sa mas mataas na konsentrasyon (Fig. 2b). Ang average na mitochondrial volume ay nanatiling hindi nagbabago sa parehong 3 at 5 mM PPA, na nagpapahiwatig na ang integridad ng mitochondrial network ay napanatili (Fig. 2d). Ipinapakita nito ang kakayahan ng mga dynamic mitochondrial network na tumugon sa banayad na metabolic stress upang epektibong mapanatili ang homeostasis nang hindi nagiging sanhi ng pagkapira-piraso ng network. Sa 3 mM PPA, ang pagtaas ng fission ay sapat na upang isulong ang paglipat sa isang bagong equilibrium, ngunit kinakailangan ang mas malalim na kinetic remodeling bilang tugon sa stress na dulot ng mas mataas na konsentrasyon ng PPA.
Ang bilang ng mitochondria ay tumaas sa parehong konsentrasyon ng stress ng PPA, ngunit ang average na volume ng mitochondrial ay hindi nagbago nang malaki (Fig. 2c). Maaaring ito ay dahil sa pagtaas ng biogenesis o pagtaas ng dibisyon; gayunpaman, sa kawalan ng isang makabuluhang pagbaba sa mean mitochondrial volume, mas malamang na tumaas ang biosynthesis. Gayunpaman, sinusuportahan ng datos sa Figure 2 ang pagkakaroon ng dalawang mekanismo ng compensatory: isang pagtaas sa bilang ng mga kaganapan ng fission, na naaayon sa upregulation ng mitochondrial fission, at isang pagtaas sa bilang ng mga kaganapan, na naaayon sa mitochondrial biogenesis. Sa huli, ang dynamic compensation para sa mild stress ay maaaring binubuo ng sabay-sabay na mga proseso na kinasasangkutan ng fission, fusion, biogenesis, at mitophagy. Bagama't ipinakita ng mga nakaraang may-akda na pinahuhusay ng PPA ang mitosis30,39 at mitophagy29, nagbibigay kami ng ebidensya para sa remodeling ng mitochondrial fission at fusion dynamics bilang tugon sa PPA. Kinukumpirma ng mga datos na ito ang mga pagbabagong morpolohikal na naobserbahan ng TEM at nagbibigay ng karagdagang pananaw sa mga mekanismo na nauugnay sa PPA-induced mitochondrial dysfunction.
Dahil hindi nagbigay ng direktang ebidensya ang pagsusuri ng TEM o MEL ng mga mekanismo ng regulasyon ng gene na pinagbabatayan ng mga naobserbahang pagbabago sa morpolohiya, sinuri namin ang ekspresyon ng RNA ng mga gene na kasangkot sa metabolismo ng mitochondrial, biogenesis, at dinamika. Ang cMYC proto-oncogene ay isang transcription factor na kasangkot sa regulasyon ng mitochondria, glycolysis, amino acid at metabolismo ng fatty acid40. Bukod pa rito, ang cMYC ay kilalang nagreregula sa ekspresyon ng halos 600 mitochondrial gene na kasangkot sa mitochondrial transcription, translation, at complex assembly, kabilang ang NRF1 at TFAM41. Ang NRF1 at TFAM ay dalawang sentral na regulator ng mitosis, na kumikilos sa ibaba ng PGC-1α upang i-activate ang mtDNA replication. Ang pathway na ito ay na-activate ng cAMP at AMPK signaling at sensitibo sa energy expenditure at metabolic stress. Sinuri rin namin ang NFE2L2, isang redox regulator ng mitochondrial biogenesis, upang matukoy kung ang mga epekto ng PPA ay maaaring namamagitan sa oxidative stress.
Bagama't nanatiling hindi nagbabago ang ekspresyon ng NFE2L2, nakahanap kami ng pare-parehong pagbaba na nakadepende sa dosis sa ekspresyon ng cMYC, NRF1 at TFAM pagkatapos ng 24 na oras ng paggamot gamit ang 3 mM at 5 mM PPA (Fig. 3a–c). Ang pagbaba ng ekspresyon ng cMYC ay naiulat na dati bilang tugon sa mitochondrial stress42, at sa kabaligtaran, ang pagbaba ng ekspresyon ng cMYC ay maaaring magdulot ng mitochondrial dysfunction sa pamamagitan ng pag-remodel ng mitochondrial metabolism, network connectivity, at membrane polarization43. Kapansin-pansin, ang cMYC ay kasangkot din sa regulasyon ng mitochondrial fission at fusion42,43 at kilala na nagpapataas ng DRP1 phosphorylation at mitochondrial localization sa panahon ng cell division44, pati na rin ang namamagitan sa mitochondrial morphological remodeling sa neuronal stem cells45. Sa katunayan, ang mga cMYC-deficient fibroblast ay nagpapakita ng pinababang laki ng mitochondrial, na naaayon sa mga pagbabagong dulot ng stress ng PPA43. Ang mga datos na ito ay naglalarawan ng isang kawili-wili ngunit hindi pa malinaw na relasyon sa pagitan ng cMYC at mitochondrial dynamics, na nagbibigay ng isang kawili-wiling target para sa mga pag-aaral sa hinaharap ng PPA stress-induced remodeling.
Ang pagbawas ng NRF1 at TFAM ay naaayon sa papel ng cMYC bilang isang mahalagang transcriptional activator. Ang mga datos na ito ay naaayon din sa mga nakaraang pag-aaral sa mga selula ng kanser sa colon ng tao na nagpapakita na binawasan ng PPA ang ekspresyon ng NRF1 mRNA sa loob ng 22 oras, na nauugnay sa pagkaubos ng ATP at pagtaas ng ROS46. Iniulat din ng mga may-akdang ito na tumaas ang ekspresyon ng TFAM sa loob ng 8.5 oras ngunit bumalik sa mga baseline level sa loob ng 22 oras. Sa kabaligtaran, ipinakita ni Kim et al. (2019) na ang ekspresyon ng TFAM mRNA ay makabuluhang nabawasan pagkatapos ng 4 na oras ng stress ng PPA sa mga selula ng SH-SY5Y; gayunpaman, pagkatapos ng 72 oras, ang ekspresyon ng protina ng TFAM ay makabuluhang tumaas at ang bilang ng kopya ng mtDNA ay makabuluhang tumaas. Kaya, ang pagbaba sa bilang ng mga mitochondrial biogenesis gene na aming naobserbahan pagkatapos ng 24 na oras ay hindi nagbubukod sa posibilidad na ang pagtaas sa bilang ng mitochondria ay nauugnay sa pag-activate ng biogenesis sa mga naunang punto ng oras. Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang PPA ay makabuluhang nagpapataas ng PGC-1α mRNA at protina sa mga selula ng SH-SY5Y sa loob ng 4 na oras at 30 minuto, habang ang propionic acid ay nagpapahusay sa mitochondrial biogenesis sa mga calf hepatocytes sa pamamagitan ng PGC-1α sa loob ng 12 oras at 39 minuto. Kapansin-pansin, ang PGC-1α ay hindi lamang isang direktang transcriptional regulator ng NRF1 at TFAM, kundi ipinakita rin na kinokontrol nito ang aktibidad ng MFN2 at DRP1 sa pamamagitan ng pag-regulate ng fission at fusion47. Kung pagsasama-samahin, itinatampok nito ang malapit na pagsasama ng mga mekanismo na kumokontrol sa mga tugon ng compensatory ng mitochondrial na dulot ng PPA. Bukod dito, ang aming datos ay sumasalamin sa makabuluhang dysregulation ng transcriptional regulation ng biogenesis at metabolismo sa ilalim ng stress ng PPA.
Ang mga gene na STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 at DRP1 ay kabilang sa mga sentral na regulator ng mitochondrial fission, fusion at dynamics37,48,49. Maraming iba pang mga gene na kasangkot sa mitochondrial dynamics, gayunpaman, ang STOML2, OPA1 at MFN2 ay dati nang natuklasang may iba't ibang methylation sa mga cohort ng ASD,16 at ilang independiyenteng pag-aaral ang nag-ulat ng mga pagbabago sa mga transcription factor na ito bilang tugon sa mitochondrial stress50,51. 52. Ang ekspresyon ng parehong OPA1 at STOML2 ay makabuluhang nabawasan ng 3 mM at 5 mM na paggamot sa PPA (Fig. 3e, f). Ang OPA1 ay isa sa mga klasikong regulator ng mitochondrial fusion sa pamamagitan ng direktang interaksyon sa MFN1 at 2 at gumaganap ng papel sa cristae remodeling at mitochondrial morphology53. Ang tiyak na papel ng STOML2 sa mitochondrial dynamics ay nananatiling hindi malinaw, ngunit ang ebidensya ay nagmumungkahi na ito ay gumaganap ng papel sa mitochondrial fusion, biogenesis, at mitophagy.
Ang STOML2 ay sangkot sa pagpapanatili ng mitochondrial respiratory coupling at pagbuo ng mga respiratory chain complexes54,55 at naipakita na lubos na binabago ang mga metabolic characteristic ng mga cancer cells56. Ipinakita ng mga pag-aaral na ang STOML2 ay nagtataguyod ng mitochondrial membrane potential at biogenesis sa pamamagitan ng interaksyon sa BAN at cardiolipin55, 57, 58. Bukod pa rito, ipinakita ng mga independiyenteng pag-aaral na ang interaksyon sa pagitan ng STOML2 at PINK1 ay nagreregula sa mitophagy59,60. Kapansin-pansin, ang STOML2 ay naiulat na direktang nakikipag-ugnayan at nagpapatatag sa MFN2 at gumaganap din ng mahalagang papel sa pagpapatatag ng mahahabang OPA1 isoforms sa pamamagitan ng pagpigil sa protease na responsable para sa OPA1 degradation53,61,62. Ang pagbawas sa STOML2 expression na naobserbahan sa mga reaksyon ng PPA ay maaaring gawing mas madaling kapitan ang mga fusion protein na ito sa degradation sa pamamagitan ng ubiquitin- at proteasome-dependent pathways48. Bagama't hindi malinaw ang eksaktong papel ng STOML2 at OPA1 sa pabago-bagong tugon sa PPA, ang nabawasang ekspresyon ng mga fusion gene na ito (Larawan 3) ay maaaring makagambala sa balanse sa pagitan ng fission at fusion at humantong sa pagbaba ng laki ng mitochondrial (Larawan 3). 1).
Sa kabilang banda, ang ekspresyon ng protina ng OPA1 ay nanatiling hindi nagbabago pagkatapos ng 24 na oras, habang ang mga antas ng mRNA at protina ng MFN1, MFN2 o DRP1 ay hindi nagbago nang malaki pagkatapos ng paggamot sa PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Maaaring ipahiwatig nito na walang mga pagbabago sa regulasyon ng mga salik na ito na kasangkot sa mitochondrial fusion at fission. Gayunpaman, mahalagang tandaan na ang bawat isa sa apat na gene na ito ay kinokontrol din ng mga posttranscriptional modification (PTM) na kumokontrol sa aktibidad ng protina. Ang OPA1 ay may walong alternatibong variant ng splice na proteolytically cleaved sa mitochondria upang makagawa ng dalawang magkakaibang isoform 63. Ang balanse sa pagitan ng mahaba at maiikling isoform ang siyang nagtatakda sa papel ng OPA1 sa mitochondrial fusion at pagpapanatili ng mitochondrial network 64. Ang aktibidad ng DRP1 ay kinokontrol ng calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) phosphorylation, habang ang DRP1 degradation ay kinokontrol ng ubiquitination at SUMOylation 65. Panghuli, parehong GTPase ang DRP1 at MFN1/2, kaya ang aktibidad ay maaaring maimpluwensyahan ng rate ng produksyon ng GTP sa mitochondria 66. Samakatuwid, bagama't nananatiling pare-pareho ang ekspresyon ng mga protinang ito, maaaring hindi nito maipakita ang hindi nagbabagong aktibidad o lokalisasyon ng protina67,68. Sa katunayan, ang mga umiiral na repertoire ng protina ng PTM ay kadalasang nagsisilbing unang linya ng depensa na responsable para sa pamamagitan ng mga tugon sa matinding stress. Sa pagkakaroon ng katamtamang metabolic stress sa aming modelo, malamang na itinataguyod ng PTM ang pagtaas ng aktibidad ng mga protina ng fusion at fission upang sapat na maibalik ang integridad ng mitochondrial nang hindi nangangailangan ng karagdagang pag-activate ng mga gene na ito sa antas ng mRNA o protina.
Kung pagsasama-samahin, ang mga datos sa itaas ay nagbibigay-diin sa kumplikado at nakadepende sa oras na regulasyon ng morpolohiya ng mitochondrial at ang mga hamon sa paglilinaw ng mga mekanismong ito. Upang mapag-aralan ang ekspresyon ng gene, kinakailangan munang tukuyin ang mga partikular na target na gene sa pathway. Gayunpaman, ipinapakita ng aming datos na ang mga gene sa parehong pathway ay hindi tumutugon sa parehong paraan sa parehong stress. Sa katunayan, ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang iba't ibang gene sa parehong pathway ay maaaring magpakita ng iba't ibang temporal na profile ng tugon30,46. Bilang karagdagan, may mga kumplikadong mekanismo pagkatapos ng transkripsyon na nakakagambala sa ugnayan sa pagitan ng transkripsyon at paggana ng gene. Ang mga pag-aaral ng proteomic ay maaaring magbigay ng pananaw sa epekto ng mga PTM at paggana ng protina, ngunit nagdudulot din ang mga ito ng mga hamon kabilang ang mga pamamaraan na mababa ang throughput, mataas na signal-to-noise ratio, at mahinang resolusyon.
Sa kontekstong ito, ang pag-aaral ng mitochondrial morphology gamit ang TEM at MEL ay may malaking potensyal na tugunan ang mga pangunahing tanong tungkol sa ugnayan sa pagitan ng mitochondrial dynamics at function at kung paano ito nakakaimpluwensya sa sakit. Pinakamahalaga, ang TEM ay nagbibigay ng direktang paraan para sa pagsukat ng mitochondrial morphology bilang isang convergent endpoint ng mitochondrial dysfunction at dynamics51. Nagbibigay din ang MEL ng direktang paraan para sa pagpapakita ng mga kaganapan ng fission at fusion sa isang three-dimensional cellular environment, na nagpapahintulot sa pagkuwantipika ng dynamic mitochondrial remodeling kahit na walang mga pagbabago sa gene expression33. Dito namin itinatampok ang gamit ng mga mitochondrial imaging techniques sa mga secondary mitochondrial disease. Ang mga sakit na ito ay karaniwang nailalarawan sa pamamagitan ng chronic mild metabolic stress na nailalarawan sa pamamagitan ng banayad na remodeling ng mga mitochondrial network sa halip na acute mitochondrial damage. Gayunpaman, ang mitochondrial compensation na kinakailangan upang mapanatili ang mitosis sa ilalim ng chronic stress ay may malalim na functional consequences. Sa konteksto ng neuroscience, ang mas mahusay na pag-unawa sa mga compensatory mechanism na ito ay maaaring magbigay ng mahalagang impormasyon tungkol sa pleiotropic neuropathology na nauugnay sa mitochondrial dysfunction.
Sa huli, itinatampok ng aming datos ang gamit ng mga pamamaraan ng imaging para sa pag-unawa sa mga functional na kahihinatnan ng mga kumplikadong interaksyon sa pagitan ng gene expression, mga pagbabago sa protina, at aktibidad ng protina na kumokontrol sa neuronal mitochondrial dynamics. Ginamit namin ang PPA upang imodelo ang mitochondrial dysfunction sa isang neuronal cell model upang makakuha ng kaalaman sa mitochondrial component ng ASD. Ang mga SH-SY5Y cell na ginagamot ng PPA ay nagpakita ng mga pagbabago sa mitochondrial morphology: ang mitochondria ay naging maliit at bilog, at ang mga cristae ay hindi maganda ang pagkakatukoy kapag naobserbahan ng TEM. Ipinapakita ng MEL analysis na ang mga pagbabagong ito ay nangyayari kasabay ng pagtaas ng mga fission at fusion event upang mapanatili ang mitochondrial network bilang tugon sa mild metabolic stress. Bukod dito, ang PPA ay makabuluhang nakakagambala sa transcriptional regulation ng mitochondrial metabolism at homeostasis. Natukoy namin ang cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, at OPA1 bilang mga pangunahing mitochondrial regulator na naantala ng PPA stress at maaaring gumanap ng papel sa pamamagitan ng mga pagbabagong dulot ng PPA sa mitochondrial morphology at function. Kinakailangan ang mga pag-aaral sa hinaharap upang mas mahusay na makilala ang mga temporal na pagbabago na dulot ng PPA sa gene expression at aktibidad ng protina, lokalisasyon, at mga post-translational modification. Itinatampok ng aming datos ang pagiging kumplikado at pagtutulungan ng mga mekanismo ng regulasyon na namamagitan sa tugon ng mitochondrial stress at ipinapakita ang gamit ng TEM at iba pang mga pamamaraan ng imaging para sa mas naka-target na mga pag-aaral ng mekanismo.
Ang SH-SY5Y cell line (ECACC, 94030304-1VL) ay binili mula sa Sigma-Aldrich. Ang mga SH-SY5Y cell ay pinalaki sa Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 nutrient mixture (DMEM/F-12) at L-glutamine (SC09411, ScienCell) sa 25 cm2 flasks na may 20% fetal bovine serum (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) at 1% penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) sa 37 °C, 5% CO2. Ang mga cell ay isinailalim sa subculture hanggang sa 80% na confluence gamit ang 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), isinailalim sa centrifuge sa 300 g at inilagay sa density na humigit-kumulang 7 × 105 cells/ml. Ang lahat ng eksperimento ay isinagawa sa mga undifferentiated SH-SY5Y cells sa pagitan ng mga passage 19–22. Ang PPA ay ibinibigay bilang NaP. Tunawin ang NaP powder (CAS No. 137-40-6, chemical formula C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) sa maligamgam na MilliQ water hanggang sa konsentrasyon na 1 M at iimbak sa 4 °C. Sa araw ng paggamot, palabnawin ang solusyong ito gamit ang 1 M PPA hanggang sa 3 mM at 5 mM PPA sa serum-free medium (DMEM/F-12 na may L-glutamine). Ang mga konsentrasyon ng paggamot para sa lahat ng eksperimento ay walang PPA (0 mM, control), 3 mM, at 5 mM PPA. Ang mga eksperimento ay isinagawa sa hindi bababa sa tatlong biological replicates.
Ang mga selula ng SH-SY5Y ay inihasik sa 25 cm5 na prasko sa bilis na 5.5 × 105 na selula/ml at pinalaki sa loob ng 24 na oras. Ang paggamot ng PPA ay idinagdag sa prasko bago ang 24 na oras ng incubation. Kolektahin ang mga cell pellet kasunod ng normal na mga protocol ng mammalian tissue subculture (inilarawan sa itaas). Muling i-suspend ang cell pellet sa 100 µl 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS at iimbak sa 4 °C hanggang sa maproseso. Ang mga selula ng SH-SY5Y ay sandaling isinailalim sa centrifuge upang i-pellet ang mga selula at alisin ang 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS solution. Muling i-suspend ang sediment sa isang 4% agarose gel na inihanda sa distilled water (ang ratio ng agarose sa sediment volume ay 1:1). Ang mga piraso ng agarose ay inilagay sa mga grid sa mga patag na plato at binalutan ng 1-hexadecene bago i-freeze sa high-pressure. Ang mga sample ay pinalamig sa 100% dry acetone sa -90°C sa loob ng 24 na oras. Pagkatapos ay itinaas ang temperatura sa -80°C at isang solusyon ng 1% osmium tetroxide at 0.1% glutaraldehyde ang idinagdag. Ang mga sample ay iniimbak sa -80°C sa loob ng 24 na oras. Pagkatapos nito, unti-unting itinaas ang temperatura sa temperatura ng silid sa loob ng ilang araw: mula – 80 °C hanggang – 50 °C sa loob ng 24 na oras, hanggang – 30 °C sa loob ng 24 na oras, hanggang – 10 °C sa loob ng 24 na oras at sa wakas ay hanggang sa temperatura ng silid.
Pagkatapos ng cryogenic preparation, ang mga sample ay binasa ng resin at ang mga ultrathin na seksyon (∼100 nm) ay ginawa gamit ang isang Leica Reichert UltracutS ultramicrotome (Leica Microsystems). Ang mga seksyon ay kinulayan ng 2% uranyl acetate at lead citrate. Ang mga sample ay inobserbahan gamit ang isang FEI Tecnai 20 transmission electron microscope (ThermoFisher (dating FEI), Eindhoven, The Netherlands) na gumagana sa 200 kV (Lab6 transmitter) at isang Gatan CCD camera (Gatan, UK) na nilagyan ng Tridiem energy filter.
Sa bawat teknikal na replika, hindi bababa sa 24 na single cell na imahe ang nakuha, para sa kabuuang 266 na imahe. Lahat ng mga imahe ay sinuri gamit ang Region of Interest (ROI) macro at ang Mitochondria macro. Ang mitochondrial macro ay batay sa mga nailathalang pamamaraan17,31,32 at nagbibigay-daan sa semi-automated batch processing ng mga TEM na imahe sa Fiji/ImageJ69. Sa madaling salita: ang imahe ay binabaligtad at inverted gamit ang rolling ball background subtraction (60 pixel radius) at isang FFT bandpass filter (gamit ang 60 at 8 pixel upper at lower bounds ayon sa pagkakabanggit) at vertical line suppression na may orientation tolerance na 5%. Ang naprosesong imahe ay awtomatikong nilalagay sa threshold gamit ang isang maximum entropy algorithm at isang binary mask ang nabuo. Ang mga rehiyon ng imahe na nauugnay sa manu-manong napiling mga ROI sa mga hilaw na TEM na imahe ay kinuha, na nagpapakilala sa mitochondria at hindi kasama ang plasma membrane at iba pang mga rehiyon na may mataas na contrast. Para sa bawat nakuhang ROI, sinuri ang mga binary particle na mas malaki sa 600 pixel, at ang lawak ng particle, perimeter, major at minor axes, diametro ng Feret, pagiging bilog, at sirkular ay sinukat gamit ang built-in na mga function ng pagsukat ng Fiji/ImageJ. Kasunod ng Merrill, Flippo, at Strack (2017), ang area 2, particle aspect ratio (major to minor axis ratio), at shape factor (FF) ay kinalkula mula sa mga datos na ito, kung saan ang FF = perimeter 2/4pi x area. Ang kahulugan ng parametric formula ay matatagpuan sa Merrill, Flippo, at Strack (2017). Ang mga macro na nabanggit ay makukuha sa GitHub (tingnan ang Data Availability Statement). Sa karaniwan, humigit-kumulang 5,600 particle ang sinuri sa bawat PPA treatment, para sa kabuuang humigit-kumulang 17,000 particle (hindi ipinakita ang datos).
Ang mga SH-SH5Y cell ay inilagay sa mga 8-chamber culture dish (ThermoFisher, #155411) upang payagan ang pagdikit nang magdamag at pagkatapos ay in-incubate gamit ang TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) at Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Ang mga imahe ay nakuha gamit ang 405 nm at 561 nm lasers sa loob ng 10 minutong kapaligiran, at ang mga raw na imahe ay nakuha bilang mga z-stack na naglalaman ng 10 image micrograph na may az step na 0.2 μm sa pagitan ng mga frame ng imahe sa 12 kasunod na time point. Ang mga imahe ay kinolekta gamit ang isang Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 super-resolution platform (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) gamit ang isang LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 lens. Sinuri ang mga imahe sa ImageJ gamit ang isang naunang inilarawang pipeline at ang ImageJ plugin upang sukatin ang mga kaganapan ng fusion at fission, average na bilang ng mga istrukturang mitochondrial, at average na dami ng mitochondrial bawat cell33. Ang mga MEL macro ay makukuha sa GitHub (tingnan ang Data Availability Statement).
Ang mga selulang SH-SY5Y ay pinalaki sa mga six-well plate sa density na 0.3 × 106 na selula/mL sa loob ng 24 oras bago ang paggamot. Ang RNA ay kinuha gamit ang Quick-RNA™ Miniprep protocol (ZR R1055, Zymo Research) na may kaunting mga pagbabago: magdagdag ng 300 μl ng RNA lysis buffer sa bawat balon bago alisin at i-lyse ang bawat sample bilang pangwakas na hakbang gamit ang 30 μl ng DNase/RNase elution. -free water. Ang lahat ng mga sample ay sinuri para sa dami at kalidad gamit ang isang NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. Ang kabuuang protina mula sa mga cell lysate ay nakuha gamit ang 200 μl RIPA lysis buffer, at ang konsentrasyon ng protina ay tinantiya gamit ang Bradford protein assay70.
Isinagawa ang sintesis ng cDNA gamit ang Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) ayon sa mga tagubilin ng gumawa na may ilang mga pagbabago. Ang cDNA ay na-synthesize sa 20-μl na mga reaksyon gamit ang 0.7 hanggang 1 μg ng kabuuang RNA. Ang mga primer ay pinili mula sa mga naunang nailathalang papel 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Table S1) at ang mga kasamang probe ay dinisenyo gamit ang PrimerQuest tool mula sa Integrated DNA Technologies. Lahat ng gene na interesado ay na-normalize sa nuclear B2M gene. Ang ekspresyon ng gene ng STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC at OPA1 ay sinukat gamit ang RT-qPCR. Kasama sa master mix ang LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM forward at reverse primers, cDNA, at PCR-grade na tubig upang magbunga ng pangwakas na volume na 10 μL para sa bawat reaksyon. Ang ekspresyon ng division at fission genes (DRP1, MFN1/2) ay sinukat gamit ang TaqMan multiplex assays. Ginamit ang Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) ayon sa mga tagubilin ng tagagawa na may kaunting mga pagbabago. Kasama sa multiplex RT-qPCR master mix ang 1X LUNA Taq polymerase, 10 μM forward at reverse primers, 10 μM probe, cDNA, at PCR-grade na tubig, na nagresulta sa pangwakas na volume na 20 μL para sa bawat reaksyon. Isinagawa ang RT-qPCR gamit ang Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—serial number: R0618110). Ang mga kondisyon ng cycling ay ipinapakita sa Table S1. Ang lahat ng mga sample ng cDNA ay pinalaki nang tatlong beses at isang standard curve ang nabuo gamit ang isang serye ng sampung beses na dilutions. Ang mga outlier sa mga triplicate na sample na may cycle threshold standard deviation (Ct) >0.5 ay tinanggal mula sa pagsusuri upang matiyak ang reproducibility ng datos30,72. Ang relatibong ekspresyon ng gene ay kinalkula gamit ang 2-ΔΔCt79 na pamamaraan.
Ang mga sample ng protina (60 μg) ay hinaluan ng Laemmli loading buffer sa 2:1 ratio at pinatakbo sa isang 12% walang kulay na protein gel (Bio-Rad #1610184). Ang mga protina ay inilipat sa isang PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane (#170-84156, Bio-Rad) gamit ang Trans-Blot Turbo system (#170-4155, Bio-Rad). Ang membrane ay hinarangan at in-incubate kasama ang mga naaangkop na primary antibodies (OPA1, MFN1, MFN2, at DRP1) (diluted 1:1000) sa loob ng 48 oras, na sinundan ng incubation kasama ang mga secondary antibodies (1:10,000) sa loob ng 1 oras. Ang mga membrane ay kinunan ng imahe gamit ang Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) at nirekord gamit ang isang Bio-Rad ChemiDoc MP system. Ginamit ang ImageLab bersyon 6.1 para sa Western blot analysis. Ang orihinal na gel at blot ay ipinapakita sa Figure S1. Ang impormasyon tungkol sa antibody ay ibinibigay sa Table S2.
Ang mga set ng datos ay ipinapakita bilang mean at standard error ng mean (SEM) ng hindi bababa sa tatlong independiyenteng sample. Sinubukan ang mga set ng datos para sa normalidad gamit ang Shapiro-Wilks test (maliban kung iba ang nakasaad) bago ipagpalagay ang isang Gaussian distribution at pantay na standard deviations at magpatuloy sa mga pagsusuri. Bukod pa sa pagsusuri ng set ng datos gamit ang Fisher's MEL LSD (p < 0.05), one-way ANOVA (treatment vs. control mean), at Dunnett's multiple comparison test upang matukoy ang kahalagahan (p < 0.05). Ang mga makabuluhang p value ay ipinapakita sa graph bilang *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Lahat ng statistical analyses at graphs ay isinagawa at binuo gamit ang GraphPad Prism 9.4.0.
Ang mga Fiji/ImageJ macro para sa pagsusuri ng imahe ng TEM ay pampublikong makukuha sa GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Ang Mitochondrial Event Locator (MEL) macro ay pampublikong makukuha sa GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM at Vijaya A. Mitochondria: mga pangunahing regulator ng metabolismo, homeostasis, stress, pagtanda at epigenetics. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Maraming aspetong mitochondrial dysfunction sa schizophrenia, complex I bilang isang posibleng pathological target. Schizophrenia. mapagkukunan. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. at Beal, MF Mitochondrial dysfunction sa Parkinson's disease. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG at Mehta V. Stressed mitochondria: mga target ng pagsalakay sa sakit na Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF at Ferreira GK Mitochondria at ang utak: bioenergetics at iba pa. Neurotoxins. mapagkukunan. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Pleiotropic mitochondria: ang epekto ng mitochondria sa pag-unlad ng neuron at sakit. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. at Morais, VA Mitochondrial biogenesis sa mga neuron: paano at saan. internasyonalidad. J. Mohr. ang agham. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. at Zhao, J. Regulasyon ng dinamika ng mitochondrial ng mga mammal: mga oportunidad at hamon. harapan. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. at Slack, RS Dinamika ng Mitochondrial sa regulasyon ng neurogenesis: mula sa pag-unlad hanggang sa pag-unlad ng utak ng nasa hustong gulang. dinamiko. 247, 47–53 (2018).