Kasalukuyan *Kasalukuyang address: Cologne 50931, Germany, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Ang neurodegeneration ng mga sakit sa mitochondrial ay itinuturing na hindi na mababawi dahil limitado ang metabolic plasticity ng mga neuron, ngunit ang epekto ng mitochondrial dysfunction sa autonomy ng cell ng neuronal metabolism sa katawan ay hindi pa gaanong nauunawaan. Dito, ipinakikilala namin ang cell-specific proteome ng mga Purkinje neuron na may progresibong kakulangan sa OXPHOS na dulot ng nagambalang mitochondrial fusion dynamics. Natuklasan namin na ang mitochondrial dysfunction ay nagdulot ng malaking pagbabago sa larangan ng proteomics, na sa huli ay humantong sa sunud-sunod na pag-activate ng mga tumpak na metabolic program bago ang pagkamatay ng cell. Hindi inaasahan, natukoy namin ang halatang induction ng pyruvate carboxylase (PCx) at iba pang anti-aging enzymes na nagsusuplemento sa mga intermediate ng TCA cycle. Ang pagsugpo sa PCx ay nagpalala ng oxidative stress at neurodegeneration, na nagpapahiwatig na ang atherosclerosis ay may proteksiyon na epekto sa mga neuron na kulang sa OXPHOS. Ang pagpapanumbalik ng mitochondrial fusion sa mga terminally degenerated neuron ay ganap na binabaligtad ang mga metabolic characteristic na ito, sa gayon ay pinipigilan ang pagkamatay ng cell. Natukoy ng aming mga natuklasan ang mga dating hindi kilalang pathway na nagbibigay ng katatagan sa mitochondrial dysfunction at ipinapakita na ang neurodegeneration ay maaaring mabaliktad kahit na sa mga huling yugto ng sakit.
Ang pangunahing papel ng mitochondria sa pagpapanatili ng metabolismo ng enerhiya ng neuronal ay binibigyang-diin ng malawak na mga sintomas ng neurological na nauugnay sa mga sakit sa mitochondrial ng tao. Karamihan sa mga sakit na ito ay sanhi ng mga mutasyon ng gene na kumokontrol sa ekspresyon ng mitochondrial gene (1, 2) o pagkasira ng gene na may kaugnayan sa mitochondrial dynamics, na hindi direktang nakakaapekto sa katatagan ng mitochondrial DNA (mtDNA) (3, 4). Ipinakita ng pag-aaral sa mga modelo ng hayop na bilang tugon sa mitochondrial dysfunction sa mga nakapalibot na tisyu, ang mga konserbatibong metabolic pathway (5-7) ay maaaring ma-activate, na nagbibigay ng mahalagang impormasyon para sa malalim na pag-unawa sa pathogenesis ng mga kumplikadong sakit na ito. Sa kabaligtaran, ang ating pag-unawa sa mga pagbabago sa metabolismo ng mga partikular na uri ng cell na dulot ng pangkalahatang pagkabigo ng produksyon ng mitochondrial adenosine triphosphate (ATP) sa utak ay mahalaga (8), na nagbibigay-diin sa pangangailangang tukuyin ang mga therapeutic target na maaaring gamitin upang maiwasan o maiwasan ang sakit. Pigilan ang neurodegeneration (9). Ang kakulangan ng impormasyon ay ang katotohanan na ang mga nerve cell ay malawak na itinuturing na may limitadong metabolic flexibility kumpara sa mga uri ng cell ng mga nakapalibot na tisyu (10). Dahil ang mga selulang ito ay gumaganap ng mahalagang papel sa pag-coordinate ng supply ng mga metabolite sa mga neuron upang maisulong ang synaptic transmission at tumugon sa mga kondisyon ng pinsala at sakit, ang kakayahang iakma ang metabolismo ng selula sa mga mapaghamong kondisyon ng tisyu ng utak ay halos limitado sa mga glial cell (11-14). Bukod pa rito, ang likas na cellular heterogeneity ng tisyu ng utak ay higit na humahadlang sa pag-aaral ng mga pagbabago sa metabolismo na nangyayari sa mga partikular na neuronal subgroup. Bilang resulta, kakaunti ang nalalaman tungkol sa eksaktong mga cellular at metabolic na kahihinatnan ng mitochondrial dysfunction sa mga neuron.
Upang maunawaan ang mga metabolic na kahihinatnan ng mitochondrial dysfunction, aming inihiwalay ang mga Purkinje neuron (PN) sa iba't ibang yugto ng neurodegeneration na dulot ng pagkasira ng mitochondrial outer membrane fusion (Mfn2). Bagama't ang mga mutasyon ng Mfn2 sa mga tao ay nauugnay sa isang uri ng hereditary motor sensory neuropathy na kilala bilang Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), ang conditional destruction ng Mfn2 sa mga daga ay isang kilalang induction of oxidation Phosphorylation (OXPHOS) dysfunction method. Ang iba't ibang neuronal subtypes (16-19) at ang nagresultang neurodegenerative phenotype ay sinasamahan ng mga progresibong sintomas ng neurological, tulad ng mga movement disorder (18, 19) o cerebellar ataxia (16). Sa pamamagitan ng paggamit ng kombinasyon ng label-free quantitative (LFQ) proteomics, metabolomics, imaging, at virological methods, ipinapakita namin na ang progresibong neurodegeneration ay malakas na nagdudulot ng pyruvate carboxylase (PCx) at iba pang mga salik na kasangkot sa arteriosclerosis ng mga PN in vivo Ang ekspresyon ng mga enzyme. Upang mapatunayan ang kaugnayan ng natuklasang ito, partikular naming ibinaba ang ekspresyon ng PCx sa mga PN na kulang sa Mfn2, at natuklasan na ang operasyong ito ay nagpalala ng oxidative stress at nagpapabilis ng neurodegeneration, kaya pinatutunayan na ang azoospermia ay nagbibigay ng cell death. Metabolic adaptability. Ang matinding ekspresyon ng MFN2 ay maaaring ganap na magligtas sa terminal degeneration PN na may matinding kakulangan sa OXPHOS, malawakang pagkonsumo ng mitochondrial DNA, at tila sirang mitochondrial network, na lalong nagbibigay-diin na ang ganitong uri ng neurodegeneration ay maaaring gumaling kahit sa advanced stage ng sakit bago ang cell death.
Upang mailarawan ang mitochondria sa Mfn2 knockout PNs, gumamit kami ng isang strain ng daga na nagpapahintulot sa Cre-dependent mitochondria na i-target ang yellow fluorescent protein (YFP) (mtYFP) (20) Cre expression at sinuri ang mitochondrial morphology in vivo. Natuklasan namin na ang pagkasira ng Mfn2 gene sa PNs ay hahantong sa unti-unting paghahati ng mitochondrial network (Figure S1A), at ang pinakamaagang pagbabago ay natagpuan sa 3 linggo ng edad. Sa kabaligtaran, ang malaking pagkabulok ng PN cell layer, gaya ng pinatutunayan ng pagkawala ng Calbindin immunostaining, ay hindi nagsimula hanggang 12 linggo ng edad (Figure 1, A at B). Ang time mismatch sa pagitan ng pinakamaagang pagbabago sa mitochondrial morphology at ang nakikitang pagsisimula ng neuronal death ay nag-udyok sa amin na siyasatin ang mga metabolic change na dulot ng mitochondrial dysfunction bago ang cell death. Bumuo kami ng isang fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based na estratehiya upang ihiwalay ang YFP (YFP+)-expressing PN (Larawan 1C), at sa mga control mice (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), na tatawaging CTRL (Larawan S1B). Ang pag-optimize ng gating strategy batay sa relatibong intensidad ng YFP signal ay nagbibigay-daan sa amin na linisin ang YFP+ body (YFPhigh) ng mga PN mula sa mga non-PN (YFPneg) (Larawan S1B) o mga putative fluorescent axon/dendritic fragment (YFPlow; Larawan S1D, kaliwa), na kinumpirma ng confocal microscope (Larawan S1D, kanan). Upang mapatunayan ang pagkakakilanlan ng classified population, nagsagawa kami ng LFQ proteomics at pagkatapos ay principal component analysis, at natuklasan na mayroong malinaw na paghihiwalay sa pagitan ng mga YFPhigh at YFPneg cells (Larawan S1C). Ang mga selula ng YFPhigh ay nagpakita ng netong pagpapayaman ng mga kilalang marker ng PN (ibig sabihin, Calb1, Pcp2, Grid2 at Itpr3) (21, 22), ngunit walang pagpapayaman ng mga protina na karaniwang ipinapahayag sa mga neuron o iba pang uri ng selula (Larawan 1D)). Ang paghahambing sa pagitan ng mga sample sa mga classified na selula ng YFPhigh na nakolekta sa mga independiyenteng eksperimento ay nagpakita ng koepisyent ng korelasyon na > 0.9, na nagpapakita ng mahusay na reproducibility sa pagitan ng mga biological replicate (Larawan S1E). Sa buod, pinatunayan ng mga datos na ito ang aming plano para sa talamak at tiyak na paghihiwalay ng magagawang PN. Dahil ang ginamit na L7-cre driver system ay nag-induce ng mosaic recombination sa unang linggo pagkatapos ng panganganak (23), sinimulan naming tanggalin ang mga daga mula sa CTRL at conditional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kolektahin ang mga neuron. Pagkatapos makumpleto ang recombination, ito ay tinatawag na Mfn2cKO sa edad na 4 na linggo. Bilang pangwakas na punto, pinili namin ang 8 linggo ng edad kung kailan buo ang PN layer sa kabila ng halatang mitochondrial fragmentation (Figure 1B at Figure S1A). Sa kabuuan, natukoy namin ang kabuuang 3013 na protina, kung saan humigit-kumulang 22% ay batay sa mga anotasyon ng MitoCarta 2.0 batay sa mitochondrial proteome bilang mitochondria (Figure 1E) (Figure 1E) (24). Ang pagsusuri ng differential gene expression na isinagawa sa linggo 8 ay nagpakita na 10.5% lamang ng lahat ng protina ang may makabuluhang pagbabago (Figure 1F at Figure S1F), kung saan 195 na protina ang down-regulated at 120 na protina ang up-regulated (Figure 1F). Mahalagang tandaan na ang "makabagong pagsusuri ng pathway" ng set ng datos na ito ay nagpapakita na ang mga gene na may differentially express ay pangunahing kabilang sa isang limitadong hanay ng mga partikular na metabolic pathway (Figure 1G). Kapansin-pansin, bagama't kinukumpirma ng downregulation ng mga pathway na may kaugnayan sa OXPHOS at calcium signaling ang induction ng mitochondrial dysfunction sa mga PN na kulang sa fusion, ang iba pang mga kategorya na pangunahing kinasasangkutan ng metabolismo ng amino acid ay lubos na tumaas ang regulasyon, na naaayon sa metabolismo na nangyayari sa mga mitochondrial PN. Ang rewiring ay pare-pareho.
(A) Mga representatibong confocal na litrato ng mga cerebellar section ng CTRL at Mfn2cKO na daga na nagpapakita ng progresibong pagkawala ng mga PN (calbindin, gray); ang mga nuclei ay nilagyan ng counterstain gamit ang DAPI. (B) Pagkuwantipika ng (A) (one-way analysis of variance, ***P<0.001; n = 4 hanggang 6 na bilog mula sa tatlong daga). (C) Eksperimental na daloy ng trabaho. (D) Distribusyon ng heat map ng mga marker na partikular sa Purkinje (itaas) at iba pang mga uri ng cell (gitna). (E) Venn diagram na nagpapakita ng bilang ng mga mitochondrial protein na natukoy sa classified PN. (F) Volcano plot ng mga differentially expressed na protina sa mga Mfn2cKO neuron sa 8 linggo (significance cut-off value na 1.3). (G) Ipinapakita ng creativity pathway analysis ang limang pinakamahalagang up-regulation (pula) at down-regulation (asul) na pathway sa Mfn2cKO PN na inuri bilang 8 linggo. Ipinapakita ang average na antas ng ekspresyon ng bawat natukoy na protina. Grayscale heat map: naayos na P value. ns, hindi mahalaga.
Ipinakita ng datos ng proteomics na unti-unting bumaba ang ekspresyon ng protina ng mga complex I, III, at IV. Ang mga Complex I, III, at IV ay pawang naglalaman ng mahahalagang mtDNA-encoded subunits, habang ang complex II, na nuclear-coded lamang, ay halos hindi naapektuhan (Figure 2A at Figure S2A). . Alinsunod sa mga resulta ng proteomics, ipinakita ng immunohistochemistry ng mga cerebellar tissue section na ang antas ng MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) subunit ng complex IV sa PN ay unti-unting bumaba (Figure 2B). Ang mtDNA-encoded subunit na Mtatp8 ay makabuluhang nabawasan (Figure S2A), habang ang steady-state level ng nuclear-encoded ATP synthase subunit ay nanatiling hindi nagbabago, na naaayon sa kilalang stable ATP synthase subassembly F1 complex kapag ang ekspresyon ng mtDNA ay matatag. Ang pormasyon ay pare-pareho. Interrupt (7). Kinumpirma ng pagsusuri ng antas ng mtDNA sa pinagsunod-sunod na Mfn2cKO PNs sa pamamagitan ng real-time polymerase chain reaction (qPCR) ang unti-unting pagbaba sa bilang ng kopya ng mtDNA. Kung ikukumpara sa control group, sa edad na 8 linggo, humigit-kumulang 20% ​​lamang ng antas ng mtDNA ang napanatili (Figure 2C). Kasabay ng mga resultang ito, ginamit ang confocal microscopy staining ng Mfn2cKO PNs upang matukoy ang DNA, na nagpapakita ng time-dependent na pagkonsumo ng mitochondrial nucleotides (Figure 2D). Natuklasan namin na ilan lamang sa mga kandidato na kasangkot sa mitochondrial protein degradation at stress response ang na-up-regulate, kabilang ang Lonp1, Afg3l2 at Clpx, at OXPHOS complex assembly factors. Walang nakitang makabuluhang pagbabago sa antas ng mga protina na kasangkot sa apoptosis (Figure S2B). Katulad nito, natuklasan namin na ang mitochondria at endoplasmic reticulum channels na kasangkot sa calcium transport ay mayroon lamang maliliit na pagbabago (Figure S2C). Bukod pa rito, ang pagsusuri ng mga protina na may kaugnayan sa autophagy ay walang nakitang makabuluhang pagbabago, na naaayon sa nakikitang induction ng mga autophagosome na naobserbahan in vivo sa pamamagitan ng immunohistochemistry at electron microscopy (Figure S3). Gayunpaman, ang progresibong OXPHOS dysfunction sa mga PN ay sinasamahan ng halatang ultrastructural na mga pagbabago sa mitochondrial. Ang mga mitochondrial cluster ay makikita sa mga cell body at dendritic tree ng mga Mfn2cKO PN na may edad na 5 at 8 linggo, at ang panloob na istraktura ng lamad ay sumailalim sa malalaking pagbabago (Figure S4, A at B). Kasabay ng mga ultrastructural na pagbabagong ito at isang makabuluhang pagbaba sa mtDNA, ang pagsusuri ng mga acute cerebral cerebellar slices na may tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) ay nagpakita na ang mitochondrial membrane potential sa mga Mfn2cKO PN ay makabuluhang nabawasan (Figure S4C).
(A) Pagsusuri sa takbo ng oras ng antas ng ekspresyon ng OXPHOS complex. Isaalang-alang lamang ang mga protina na may P<0.05 sa 8 linggo (two-way ANOVA). Tuldok-tuldok na linya: Walang pagsasaayos kumpara sa CTRL. (B) Kaliwa: Isang halimbawa ng isang cerebellar section na may label na anti-MTCO1 antibody (scale bar, 20 μm). Ang lugar na okupado ng mga Purkinje cell bodies ay natatakpan ng dilaw. Kanan: Pagkuwantipika ng mga antas ng MTCO1 (one-way analysis of variance; n = 7 hanggang 20 cells na sinuri mula sa tatlong daga). (C) qPCR analysis ng mtDNA copy number sa sorted PN (one-way analysis of variance; n = 3 hanggang 7 daga). (D) Kaliwa: Isang halimbawa ng isang cerebellar slice na may label na anti-DNA antibody (scale bar, 20 μm). Ang lugar na okupado ng mga Purkinje cell bodies ay natatakpan ng dilaw. Kanan: Pagkuwantipika ng mga mtDNA lesions (one-way analysis of variance; n = 5 hanggang 9 cells mula sa tatlong daga). (E) Isang halimbawa ng isang acute cerebellar section na nagpapakita ng mitoYFP + Purkinje cells (arrow) sa isang whole-cell patch clamp recording. (F) Pagkuwantipika ng IV curve. (G) Mga representatibong recording ng depolarizing current injection sa CTRL at Mfn2cKO Purkinje cells. Top trace: Ang unang pulso na nag-trigger ng AP. Bottom trace: Pinakamataas na AP frequency. (H) Pagkuwantipika ng postsynaptic spontaneous inputs (sPSPs). Ang representatibong recording trace at ang zoom ratio nito ay ipinapakita sa (I). Sinuri ng one-way analysis of variance ang n = 5 hanggang 20 cells mula sa tatlong daga. Ang datos ay ipinahayag bilang mean±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Mga representatibong trace ng spontaneous AP na naitala gamit ang perforated patch clamp mode. Top trace: Pinakamataas na AP frequency. Bottom trace: zoom ng isang AP. (K) Sukatin ang average at maximum AP frequency ayon sa (J). Mann-Whitney test; n = 5 cells ang sinuri mula sa apat na daga. Ang datos ay ipinapahayag bilang mean±SEM; hindi mahalaga.
Malinaw na nakita ang pinsala ng OXPHOS sa 8-linggong gulang na Mfn2cKO PN, na nagpapahiwatig na ang pisyolohikal na tungkulin ng mga neuron ay lubhang abnormal. Samakatuwid, sinuri namin ang mga passive electrical characteristic ng mga neuron na kulang sa OXPHOS sa ika-4 hanggang ika-5 linggo at ika-7 hanggang ika-8 linggo sa pamamagitan ng pagsasagawa ng mga whole-cell patch clamp recording sa mga acute cerebellar slice (Larawan 2E). Hindi inaasahan, ang average resting membrane potential at input resistance ng mga Mfn2cKO neuron ay katulad ng sa kontrol, bagama't may mga banayad na pagkakaiba sa pagitan ng mga cell (Talahanayan 1). Katulad nito, sa edad na 4 hanggang ika-5 linggo, walang nakitang makabuluhang pagbabago sa current-voltage relationship (IV curve) (Larawan 2F). Gayunpaman, walang Mfn2cKO neuron na 7 hanggang ika-8 linggo ang nakaligtas sa IV regimen (hyperpolarization step), na nagpapahiwatig na mayroong malinaw na sensitivity sa hyperpolarization potential sa huling yugtong ito. Sa kabaligtaran, sa mga neuron na Mfn2cKO, ang mga depolarizing current na nagdudulot ng paulit-ulit na action potential (AP) discharges ay mahusay na kinukunsinti, na nagpapahiwatig na ang kanilang pangkalahatang mga pattern ng discharge ay hindi makabuluhang naiiba sa mga 8-linggong gulang na control neuron (Table 1 at Figure 2G). Gayundin, ang dalas at amplitude ng mga spontaneous postsynaptic currents (sPSCs) ay maihahambing sa mga nasa control group, at ang dalas ng mga pangyayari ay tumaas mula 4 na linggo hanggang 5 linggo hanggang 7 linggo hanggang 8 linggo na may katulad na pagtaas (Figure 2, H at I). Ang panahon ng synaptic maturation sa mga PN (25). Katulad na mga resulta ang nakuha pagkatapos ng mga butas-butas na PN patch. Pinipigilan ng configuration na ito ang posibleng kabayaran ng mga depekto sa cellular ATP, tulad ng maaaring mangyari sa pag-record ng whole-cell patch clamp. Sa partikular, ang resting membrane potential at spontaneous firing frequency ng mga neuron na Mfn2cKO ay hindi naapektuhan (Figure 2, J at K). Sa buod, ipinapahiwatig ng mga resultang ito na ang mga PN na may halatang OXPHOS dysfunction ay kayang makayanan nang maayos ang mga high-frequency discharge pattern, na nagpapahiwatig na mayroong mekanismo ng kompensasyon na nagbibigay-daan sa kanila na mapanatili ang halos normal na mga electrophysiological na tugon.
Ang datos ay ipinapahayag bilang mean ± SEM (one-way analysis of variance, Holm-Sidak's multiple comparison test; *P<0.05). Ang unit number ay ipinapahiwatig ng mga panaklong.
Sinimulan naming siyasatin kung may anumang kategorya sa dataset ng proteomics (Larawan 1G) na kinabibilangan ng mga pathway na maaaring kontrahin ang matinding kakulangan sa OXPHOS, sa gayon ay ipinapaliwanag kung bakit ang apektadong PN ay maaaring mapanatili ang halos normal na electrophysiology (Larawan 2, E hanggang K). Ipinakita ng pagsusuri ng proteomics na ang mga enzyme na kasangkot sa catabolism ng branched chain amino acids (BCAA) ay makabuluhang tumaas (Larawan 3A at Larawan S5A), at ang pangwakas na produkto na acetyl-CoA (CoA) o succinyl CoA ay maaaring magdagdag sa mga tricarboxylates sa arteriosclerosis Acid (TCA) cycle. Natuklasan namin na ang nilalaman ng BCAA transaminase 1 (BCAT1) at BCAT2 ay parehong tumaas. Pinapagana nila ang unang hakbang ng BCAA catabolism sa pamamagitan ng pagbuo ng glutamate mula sa α-ketoglutarate (26). Ang lahat ng mga subunit na bumubuo sa branched chain keto acid dehydrogenase (BCKD) complex ay na-upregulate (ang complex ay nagiging catalyst sa kasunod at hindi na mababaligtad na decarboxylation ng nagresultang BCAA carbon skeleton) (Figure 3A at Figure S5A). Gayunpaman, walang nakitang malinaw na pagbabago sa BCAA mismo sa sorted PN, na maaaring dahil sa pagtaas ng cellular uptake ng mga essential amino acid na ito o sa paggamit ng iba pang mga pinagkukunan (glucose o lactic acid) upang madagdagan ang TCA cycle (Figure S5B). Ang mga PN na kulang sa OXPHOS ay nagpakita rin ng pagtaas ng glutamine decomposition at transamination activities sa edad na 8 linggo, na maaaring maipakita ng up-regulation ng mitochondrial enzymes na glutaminase (GLS) at glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Figure 3, A at C). Mahalagang tandaan na ang pagtaas ng GLS ay limitado sa spliced ​​​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) (ang pagbabago ng Mfn2cKO/CTRL ay humigit-kumulang 4.5 beses, P = 0.05), at ang partikular na pagtaas nito sa mga tisyu ng kanser ay maaaring suportahan ang mitochondrial bioenergy. (27).
(A) Ipinapakita ng heat map ang pagbabago ng fold sa antas ng protina para sa tinukoy na ruta sa loob ng 8 linggo. (B) Halimbawa ng isang cerebellar slice na may label na anti-PCx antibody (scale bar, 20 μm). Ang dilaw na arrow ay nakaturo sa Purkinje cell body. (C) Pagsusuri ng time course protein expression na natukoy bilang isang mahalagang kandidato para sa atherosclerosis (multiple t-test, *FDR <5%; n = 3-5 mice). (D) Sa itaas: Isang eskematiko na diagram na nagpapakita ng iba't ibang paraan ng pagpasok ng may label na carbon na nakapaloob sa [1-13C]pyruvate tracer (ibig sabihin, sa pamamagitan ng PDH o trans-arterial route). Sa ibaba: Ipinapakita ng violin chart ang porsyento ng single-labeled carbon (M1) na na-convert sa aspartic acid, citric acid at malic acid pagkatapos lagyan ng label ang mga acute cerebellar slice gamit ang [1-13C]pyruvate (paired t-test; ** P <0.01). (E) Komprehensibong pagsusuri ng time history ng ipinahiwatig na path. Isaalang-alang lamang ang mga protina na may P<0.05 sa loob ng 8 linggo. Guhit na putol-putol: walang halaga ng pagsasaayos (two-way analysis of variance; * P <0.05; *** P <0.001). Ang datos ay ipinapahayag bilang mean±SEM.
Sa aming pagsusuri, ang BCAA catabolism ay naging isa sa mga pangunahing pathway ng up-regulation. Ang katotohanang ito ay mariing nagmumungkahi na ang volume ng bentilasyon na pumapasok sa TCA cycle ay maaaring mabago sa PN na kulang sa OXPHOS. Maaaring ito ay kumakatawan sa isang pangunahing anyo ng neuronal metabolic rewiring, na maaaring magkaroon ng direktang epekto sa neuronal physiology at survival habang pinapanatili ang matinding OXPHOS dysfunction. Kasabay ng hypothesis na ito, natuklasan namin na ang pangunahing anti-atherosclerotic enzyme na PCx ay up-regulated (ang Mfn2cKO/CTRL ay nagbabago nang humigit-kumulang 1.5 beses; Figure 3A), na siyang nagpapabilis sa conversion ng pyruvate sa oxaloacetate (28), na pinaniniwalaang nasa tisyu ng utak. Ang expression sa ay limitado sa mga astrocytes (29, 30). Kasabay ng mga resulta ng proteomics, ipinakita ng confocal microscopy na ang expression ng PCx ay partikular at makabuluhang tumaas sa mga PN na kulang sa OXPHOS, habang ang reactivity ng PCx ay pangunahing limitado sa katabing Bergmann glial cells ng control (Figure 3B). Upang masubukan nang maayos ang naobserbahang pagtaas ng PCx, ginamit namin ang [1-13C]pyruvate tracer para sa mga acute cerebellar slices. Nang ang pyruvate ay na-oxidize ng pyruvate dehydrogenase (PDH), nawala ang isotope label nito na , Ngunit isinasama ito sa mga intermediate ng TCA cycle kapag ang pyruvate ay na-metabolize ng mga vascular reaction (Figure 3D). Bilang suporta sa aming datos ng proteomics, naobserbahan namin ang malaking bilang ng mga marker mula sa tracer na ito sa aspartic acid ng mga hiwa ng Mfn2cKO, habang ang citric acid at malic acid ay mayroon ding katamtamang trend, bagaman hindi makabuluhan (Figure 3D).
Sa mga dopamine neuron ng mga daga ng MitoPark na may mitochondrial dysfunction na dulot ng mga dopamine neuron na partikular na sumisira sa mitochondrial transcription factor A gene (Tfam) (Figure S6B), ang ekspresyon ng PCx ay malaki rin ang na-up-regulate (31), na nagpapahiwatig na ang paglitaw ng sakit ay kinokontrol habang may acetone acid arteriosclerosis sa katawan. Mahalagang tandaan na natuklasan na ang mga natatanging enzyme (32-34) na maaaring maipahayag sa mga neuron na maaaring nauugnay sa arteriosclerosis ay malaki ang na-up-regulate sa mga PN na kulang sa OXPHOS, tulad ng propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), ang Malonyl-CoA ay nagko-convert ng propionyl-CoA sa succinyl-CoA at mitochondrial malic enzyme 3 (ME3), na ang pangunahing papel ay ang pagbawi ng pyruvate mula sa malate (Figure 3, A at C) (33, 35). Bukod pa rito, nakakita kami ng malaking pagtaas sa enzyme na Pdk3, na nagpo-phosphorylate at sa gayon ay nagpapawalang-bisa sa PDH (36), habang walang nakitang pagbabago sa enzyme na Pdp1 na nagpapagana sa PDH o sa mismong enzyme complex ng PDH (Larawan 3A). Kasabay nito, sa Mern2cKO PNs, ang phosphorylation ng α1 subunit α (PDHE1α) subunit ng pyruvate dehydrogenase E1 component ng PDH complex sa Ser293 (kilalang pumipigil sa aktibidad ng enzyme ng PDH) ay pinahusay (Larawan S6C) (Larawan S6C). Walang vascular access ang Pyruvate.
Panghuli, natuklasan namin na ang super pathway ng serine at glycine biosynthesis, ang kaugnay na mitochondrial folate (1C) cycle at proline biosynthesis (Figure 1G at Figure S5C) ay pawang makabuluhang tumaas ang regulasyon, ayon sa mga ulat, sa panahon ng proseso ng pag-activate. Ang mga nakapalibot na tisyu ay na-activate na may mitochondrial dysfunction (5-7). Ang confocal analysis na sumusuporta sa mga datos ng proteomics na ito ay nagpakita na sa PN na walang OXPHOS, ang mga cerebellar slice ng 8-linggong gulang na daga ay isinailalim sa serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), isang pangunahing enzyme ng mitochondrial folate cycle. Makabuluhang tugon ng immune system (Figure S5D). Sa 13 CU-glucose-incubated acute cerebellar slices, ang mga eksperimento sa metabolic tracing ay lalong nagkumpirma sa pagtaas ng regulasyon ng serine at proline biosynthesis, na nagpapahiwatig na ang daloy ng mga carbon isoform sa serine at proline ay tumaas (Figure S5E). Dahil ang mga reaksyong itinataguyod ng GLS at GPT2 ay responsable para sa synthesis ng glutamate mula sa glutamine at ang transamination sa pagitan ng glutamate at α-ketoglutarate, ang kanilang upregulation ay nagpapahiwatig na ang mga neuron na kulang sa OXPHOS ay may mas mataas na demand para sa glutamate. Maaaring ito ay naglalayong mapanatili ang mas mataas na biosynthesis ng proline (Figure S5C). Kabaligtaran sa mga pagbabagong ito, ipinakita ng isang proteomic analysis ng mga cerebellar astrocytes mula sa mga PN-specific Mfn2cKO mice na ang mga pathway na ito (kabilang ang lahat ng antiperoxidases) ay hindi nagbago nang malaki sa expression, kaya ipinapakita na ang metabolic redirection na ito ay pumipili sa degraded PN (Fig. S6, D hanggang G).
Sa buod, ang mga pagsusuring ito ay nagpakita ng makabuluhang magkakaibang mga pattern ng temporal na pag-activate ng mga partikular na metabolic pathway sa mga PN. Bagama't ang abnormal na neuronal mitochondrial function ay maaaring humantong sa maagang atherosclerosis at 1C remodeling (Figure 3E at Figure S5C), at maging sa mga nahuhulaang pagbabago sa ekspresyon ng I at IV complexes, ang mga pagbabago sa serine de novo synthesis ay lumilitaw lamang sa mga huling yugto. Naging maliwanag lamang ito sa mga huling yugto. Ang mga natuklasang ito ay tumutukoy sa isang sunud-sunod na proseso kung saan ang stress-induced mitochondrial (1C cycle) at cytoplasmic (serine biosynthesis) ay tumutugon nang synergistically sa pagtaas ng atherosclerosis sa TCA cycle upang muling hubugin ang neuronal metabolism.
Ang mga 8-linggong gulang na OXPHOS-deficient PN ay maaaring mapanatili ang high-frequency excitation activity at sumailalim sa makabuluhang metabolic reconnection upang mabawi ang mitochondrial dysfunction. Ang pagtuklas na ito ay nagbubunga ng isang kawili-wiling posibilidad na kahit sa sandaling ito, ang mga selulang ito ay maaari ring Makatanggap ng therapeutic intervention upang maantala o maiwasan ang neurodegeneration. Huli na. Nalutas namin ang posibilidad na ito sa pamamagitan ng dalawang independiyenteng interbensyon. Sa unang pamamaraan, dinisenyo namin ang isang Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) vector upang ang MFN2 ay maaaring piliing ipahayag sa OXPHOS-deficient PNs in vivo (Figure S7A). Ang AAV encoding MFN2 at ang fluorescent reporter gene mCherry (Mfn2-AAV) ay na-verify sa mga primary neuron culture in vitro, na naging sanhi ng pag-express ng MFN2 sa isang Cre-dependent na paraan at nailigtas ang mitochondrial morphology, sa gayon ay pinipigilan ang neuromutation sa Mfn2cKO neurons (Figure S7, B, D at E). Sumunod, nagsagawa kami ng mga eksperimentong in vivo upang stereotactically na maihatid ang 8-linggong gulang na Mfn2-AAV sa cerebellar cortex ng Mfn2cKO at mga kontrol na daga, at sinuri ang 12-linggong gulang na daga (Larawan 4A). Ang ginamot na mga daga na Mfn2cKO ay namatay (Larawan 1, A at B) (16). Ang viral transduction in vivo ay nagresulta sa piling pagpapahayag ng PN sa ilang cerebellar circles (Larawan S7, G at H). Ang pag-iniksyon ng control AAV na nagpapahayag lamang ng mCherry (Ctrl-AAV) ay walang makabuluhang epekto sa antas ng neurodegeneration sa mga hayop na Mfn2cKO. Sa kabaligtaran, ang pagsusuri ng mga Mfn2cKO na na-transduce gamit ang Mfn2-AAV ay nagpakita ng isang makabuluhang proteksiyon na epekto ng PN cell layer (Larawan 4, B at C). Sa partikular, ang densidad ng neuron ay tila halos hindi mapag-iba sa mga kontrol na hayop (Larawan 4, B at C, at Larawan S7, H at I). Ang ekspresyon ng MFN1 ngunit hindi ang MFN2 ay pantay na epektibo sa pag-save ng neuronal death (Figure 4C at Figure S7, C at F), na nagpapahiwatig na ang ekspresyon ng ectopic MFN1 ay maaaring epektibong makadagdag sa kakulangan ng MFN2. Ang karagdagang pagsusuri sa iisang antas ng PN ay nagpakita na ang Mfn2-AAV ay higit na nakapagligtas sa ultrastructure ng mitochondria, nag-normalize ng mga antas ng mtDNA, at nagbaliktad ng mataas na ekspresyon ng anti-angiogenesis marker na PCx ​​(Figure 4, C hanggang E). Ang visual na inspeksyon ng mga nailigtas na Mfn2cKO na daga sa isang estado ng pagpapahinga ay nagpakita na ang kanilang postura at mga sintomas ng motor (paggalaw S1 hanggang S3) ay bumuti. Bilang konklusyon, ipinapakita ng mga eksperimentong ito na ang naantalang muling pagpapakilala ng MFN2 sa mga PN na lubhang kulang sa OXPHOS ay sapat na upang baligtarin ang pagkonsumo ng mtDNA at magdulot ng atherosclerosis, sa gayon ay pinipigilan ang axon degeneration at neuronal death in vivo.
(A) Isang iskema na nagpapakita ng iskedyul ng eksperimento para sa pag-iniksyon ng AAV encoding MFN2 kapag ang ipinahiwatig na metabolic pathway ay na-activate. (B) Mga representatibong confocal na imahe ng 12-linggong gulang na cerebellar slices na na-transduce sa ika-8 linggo sa mga daga na Mfn2cKO at nilagyan ng label na anti-Calbindin antibody. Kanan: Pag-scale ng mga hibla ng axon. Ang sukat ng axon zoom ay 450 at 75 μm. (C) Kaliwa: Pagkuwantipika ng densidad ng Purkinje cell sa AAV transduction loop (AAV+) (one-way analysis of variance; n = 3 daga). Kanan: mtDNA focus analysis sa na-transduce na PN sa ika-12 linggo (unpaired t-test; n = 6 na selula mula sa tatlong daga). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mga representatibong transmission electron micrograph ng mga PN ng mga seksyon ng cerebellar na Mfn2cKO na na-transduce kasama ang ipinahiwatig na viral vector. Ang kulay rosas na maskara ay naglalarawan sa lugar na okupado ng mga dendrite, at ang dilaw na tuldok-tuldok na parisukat ay naglalarawan ng zoom na ibinigay sa kanan; ang n ay kumakatawan sa nucleus. Ang scale bar, 1μm. (E) ay nagpapakita ng isang halimbawa ng PCx staining sa PN na na-transduce sa 12 linggo. Scale bar, 20μm. OE, overexpression; FC, fold change.
Panghuli, sinuri namin ang kahalagahan ng peroxidase-induced cell survival sa mga PN na nakaranas ng OXPHOS dysfunction. Bumuo kami ng mCherry encoding na AAV-shRNA (short hairpin RNA) na partikular na nagta-target sa mouse PCx mRNA (AAV-shPCx), at iniksyon ang virus o ang scrambled control nito (AAV-scr) sa cerebellum ng mga Mfn2cKO mice. Isinagawa ang iniksyon sa ikaapat na linggo ng edad (Figure 5A) upang makamit ang epektibong PCx knockdown sa panahon kung kailan tumaas ang PCx expression (Figure 3C) at buo pa rin ang PN cell layer (Figure 1A). Mahalagang tandaan na ang pagbagsak ng PCx (Figure S8A) ay humahantong sa isang makabuluhang pagbilis ng PN death, na limitado sa infected ring (Figure 5, B at C). Upang maunawaan ang mekanismo ng mga metabolic effect na dulot ng PCx up-regulation, pinag-aralan namin ang redox status ng mga PN pagkatapos ng sabay-sabay na pag-express ng PCx knockdown at AAV-mediated optical biosensor na Grx1-roGFP2 (Figure S8, B hanggang D) upang masuri ang glutathione. Ang relatibong pagbabago ng peptide redox potential (38). Pagkatapos, nagsagawa kami ng two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) sa acute brain slices ng 7-week-old na Mfn2cKO o control littermates upang matukoy ang mga potensyal na pagbabago sa cytoplasmic redox status pagkatapos mapatunayan ang mga kondisyon ng FLIM (Figure S8, E hanggang G). Ang pagsusuri ay nagpakita ng isang makabuluhang pagtaas sa oxidation state ng isang Mfn2cKO PN na kulang sa PCx expression, na naiiba sa mga control neuron o Mfn2cKO PN na nagpapahayag lamang ng scrambled shRNA (Figure 5, D at E). Nang ang ekspresyon ng PCx ay ibinaba, ang porsyento ng mga Mfn2cKO PN na nagpapakita ng isang lubos na na-oxidize na estado ay tumaas ng higit sa tatlong beses (Larawan 5E), na nagpapahiwatig na ang pagtaas ng regulasyon ng PCx ay nagpapanatili ng kapasidad ng redox ng mga degenerated na neuron.
(A) Isang iskema na nagpapakita ng iskedyul ng eksperimento para sa pag-iniksyon ng AAV encoding shPCx kapag ang ipinahiwatig na metabolic pathway ay na-activate. (B) Mga representatibong confocal na litrato ng 8-linggong gulang na cerebellar sections sa mga Mfn2cKO na daga na na-transduce at nilagyan ng label na anti-calcineurin antibody sa loob ng 4 na linggo. Scale bar, 450μm. (C) Pagkuwantipika ng Purkinje cell density sa mga AAV-transduced loop (one-way analysis of variance; n = 3 hanggang 4 na daga). Ang datos ay ipinahayag bilang mean±SEM; ***P<0.001. (D) Ang representatibong larawan ng FLIM ay nagpapakita ng average na haba ng buhay ng 7-linggong gulang na PN na nagpapahayag ng glutathione redox sensor na Grx1-roGFP2 sa ilalim ng tinukoy na mga kondisyon ng eksperimento. LUT (look-up table) ratio: survival time interval (sa picoseconds). Scale bar, 25μm. (E) Ipinapakita ng histogram ang distribusyon ng mga halaga ng habang-buhay na Grx1-roGFP2 mula (D) (n=158 hanggang 368 na selula sa dalawang daga sa ilalim ng bawat kondisyon). Ang pie chart sa itaas ng bawat histogram: ay nagpapakita ng bilang ng mga selula na may mas mahaba (pula, na-oxidize) o mas maikli (asul, nabawasan) na mga halaga ng habang-buhay, na lumalagpas sa 1 SD ng average na halaga ng habang-buhay sa CTRL-AAV-scr. (F) Ipinapakita ng iminungkahing modelo ang proteksiyon na epekto ng upregulation ng neuronal PCx.
Sa kabuuan, ipinapakita ng datos na aming ibinibigay dito na ang muling pagpapahayag ng MFN2 ay maaaring ganap na magligtas sa advanced na PN na may malubhang kakulangan sa OXPHOS, matinding pagkaubos ng mtDNA, at labis na abnormal na morpolohiya na parang ista, sa gayon ay nagbibigay ng patuloy na pag-unlad kahit sa mga advanced na sakit. Ang neurodegeneration ay nagbibigay ng nababaligtad na ebidensya ng yugto bago ang pagkamatay ng cell. Ang antas ng metabolic flexibility na ito ay higit na binibigyang-diin ng kakayahan ng mga neuron na mag-udyok ng atherosclerosis (isang muling pagsasaayos ng TCA cycle), na pumipigil sa pagpapahayag ng PCx sa mga PN na kulang sa OXPHOS at nagpapahusay sa pagkamatay ng cell, sa gayon ay gumaganap ng isang proteksiyon na papel (Larawan 5F).
Sa pag-aaral na ito, nagbigay kami ng ebidensya na ang tugon ng mga PN sa OXPHOS dysfunction ay unti-unting nagtatagpo sa TCA cycle atherosclerosis sa pamamagitan ng differential activation pathway na pinapagana ng mga metabolic program. Kinumpirma namin ang proteomic analysis gamit ang maraming komplementaryong pamamaraan at isiniwalat na kapag hinamon ng matinding mitochondrial dysfunction, ang mga neuron ay may dating hindi kilalang anyo ng metabolic elasticity. Laking gulat namin, ang buong proseso ng rewiring ay hindi kinakailangang magmarka sa terminal metabolic state na kasama ng neurodegeneration nang paunti-unti at hindi na mababawi, ngunit iminumungkahi ng aming datos na maaari itong bumuo ng isang maintenance neuron kahit na sa yugto bago ang pagkamatay ng cell. Ang functional compensation mechanism ay nagpapahiwatig na ang mga neuron ay may malaking antas ng metabolic plasticity sa katawan. Pinatutunayan ng katotohanang ito na ang mas huling pagpapakilala ng MFN2 ay maaaring baligtarin ang ekspresyon ng mga pangunahing metabolic marker at maiwasan ang PN degeneration. Sa kabaligtaran, pinipigilan nito ang atherosclerosis at pinapabilis ang mga nerbiyos. transsexual.
Isa sa mga pinakakawili-wiling natuklasan sa aming pananaliksik ay ang mga PN na kulang sa OXPHOS ay maaaring baguhin ang metabolismo ng TCA cycle sa pamamagitan ng pag-up-regulate ng mga enzyme na partikular na nagpapasigla sa arteriosclerosis. Ang metabolic rearrangement ay isang karaniwang katangian ng mga selula ng kanser, na ang ilan ay umaasa sa glutamine upang madagdagan ang mga intermediate ng TCA cycle upang makagawa ng mga reducing equivalents, na nagtutulak sa respiratory chain at nagpapanatili ng produksyon ng lipid at nucleotide biosynthesis precursors (39, 40). Ipinakita ng isang kamakailang pag-aaral na sa mga peripheral tissue na nakakaranas ng OXPHOS dysfunction, ang muling pagkakaugnay ng glutamine/glutamate metabolism ay isa ring kilalang katangian (5, 41), kung saan ang direksyon ng pagpasok ng glutamine sa TCA cycle ay nakasalalay sa Dahil sa kalubhaan ng pinsala sa OXPHOS (41). Gayunpaman, walang malinaw na ebidensya sa anumang pagkakatulad ng neuronal metabolic plasticity sa katawan at ang posibleng kaugnayan nito sa konteksto ng sakit. Sa isang kamakailang in vitro na pag-aaral, ipinakita na ang mga pangunahing cortical neuron ay nagpapakilos ng mga glutamate pool para sa neurotransmission, sa gayon ay nagtataguyod ng oxidative metabolism at atherosclerosis sa ilalim ng mga kondisyon ng metabolic stress (42). Mahalagang tandaan na sa ilalim ng pharmacological inhibition ng TCA cycle enzyme na succinate dehydrogenase, pinaniniwalaang pinapanatili ng pyruvate carboxylation ang synthesis ng oxaloacetate sa mga cultured cerebellar granule neurons (34). Gayunpaman, ang physiological relevance ng mga mekanismong ito sa brain tissue (kung saan pinaniniwalaang ang atherosclerosis ay pangunahing nakakulong sa mga astrocytes) ay mayroon pa ring mahalagang physiological significance (43). Sa kasong ito, ipinapakita ng aming datos na ang mga PN na napinsala ng OXPHOS sa katawan ay maaaring ilipat sa BCAA degradation at pyruvate carboxylation, na siyang dalawang pangunahing pinagmumulan ng supplementation ng TCA pool intermediates. Bagama't iminungkahi ang posibleng kontribusyon ng BCAA catabolism sa neuronal energy metabolism, bilang karagdagan sa papel ng glutamate at GABA para sa neurotransmission (44), wala pa ring ebidensya para sa mga mekanismong ito in vivo. Samakatuwid, madaling isipin na ang mga dysfunctional PN ay maaaring awtomatikong makabawi para sa pagkonsumo ng mga TCA intermediates na hinihimok ng proseso ng assimilation sa pamamagitan ng pagtaas ng atherosclerosis. Sa partikular, ang pagtaas ng PCx ay maaaring kailanganin upang mapanatili ang pagtaas ng demand para sa aspartic acid, na iminumungkahi sa mga dumaraming selula na may mitochondrial dysfunction (45). Gayunpaman, ang aming metabolomics analysis ay hindi nagpakita ng anumang makabuluhang pagbabago sa steady-state level ng aspartic acid sa Mfn2cKO PNs (Figure S6A), na marahil ay sumasalamin sa iba't ibang metabolic utilization ng aspartic acid sa pagitan ng mga dumaraming selula at post-mitotic neurons. Bagama't ang eksaktong mekanismo ng pagtaas ng PCx sa mga dysfunctional neurons in vivo ay kailangan pang kilalanin, ipinakita namin na ang napaaga na tugon na ito ay may mahalagang papel sa pagpapanatili ng redox state ng mga neuron, na ipinakita sa mga eksperimento ng FLIM sa mga cerebellar slices. Sa partikular, ang pagpigil sa mga PN mula sa pagtaas ng PCx ay maaaring humantong sa isang mas oxidized state at mapabilis ang pagkamatay ng cell. Ang pag-activate ng BCAA degradation at ang carboxylation ng pyruvate ay hindi mga paraan upang makilala ang mga peripheral tissues ng mitochondrial dysfunction (7). Samakatuwid, tila sila ay isang priority feature ng mga neuron na kulang sa OXPHOS, kahit na hindi lamang ang feature, na mahalaga para sa neurodegeneration. .
Ang sakit na cerebellar ay isang heterogeneous na uri ng sakit na neurodegenerative na karaniwang nagpapakita bilang ataxia at kadalasang nakakasira sa mga PN (46). Ang populasyon ng neuron na ito ay partikular na mahina sa mitochondrial dysfunction dahil ang kanilang selective degeneration sa mga daga ay sapat na upang muling kopyahin ang marami sa mga sintomas ng motor na nagpapakilala sa spinocerebellar ataxia ng tao (16, 47, 48). Ayon sa mga ulat, ang isang transgenic mouse model na may mutant gene ay nauugnay sa spinocerebellar ataxia ng tao at may mitochondrial dysfunction (49, 50), na nagbibigay-diin sa kahalagahan ng pag-aaral ng mga kahihinatnan ng kakulangan ng OXPHOS sa PNPH. Samakatuwid, partikular na angkop na epektibong ihiwalay at pag-aralan ang natatanging populasyon ng neuron na ito. Gayunpaman, dahil ang mga PN ay napaka-sensitibo sa presyon at bumubuo sa isang mababang proporsyon ng buong populasyon ng cerebellar cell, para sa maraming pag-aaral na nakabatay sa omics, ang selective separation ng mga ito bilang buong mga cell ay isang mapaghamong aspeto pa rin. Bagama't halos imposibleng makamit ang ganap na kawalan ng kontaminasyon ng ibang mga uri ng selula (lalo na ang mga tisyu ng nasa hustong gulang), pinagsama namin ang isang epektibong hakbang sa paghihiwalay gamit ang FACS upang makakuha ng sapat na bilang ng mga mabubuhay na neuron para sa pagsusuri ng proteomics sa ibaba ng agos, at mayroon kaming Medyo mataas na saklaw ng protina (mga 3000 protina) kumpara sa umiiral na hanay ng datos ng buong cerebellum (51). Sa pamamagitan ng pagpapanatili ng kakayahang mabuhay ng buong mga selula, ang pamamaraang ibinibigay namin dito ay nagbibigay-daan sa amin hindi lamang upang suriin ang mga pagbabago sa mga metabolic pathway sa mitochondria, kundi pati na rin upang suriin ang mga pagbabago sa mga cytoplasmic counterparts nito, na kumukumpleto sa paggamit ng mga mitochondrial membrane tag upang pagyamanin ang uri ng selula. Ang bagong pamamaraan para sa bilang ng mitochondria sa mga kumplikadong tisyu (52, 53). Ang pamamaraang inilalarawan namin ay hindi lamang nauugnay sa pag-aaral ng mga Purkinje cell, ngunit madaling mailapat sa anumang uri ng selula upang matugunan ang mga pagbabago sa metabolismo sa mga may sakit na utak, kabilang ang iba pang mga modelo ng mitochondrial dysfunction.
Panghuli, natukoy namin ang isang therapeutic window sa prosesong ito ng metabolic rearrangement na maaaring ganap na baligtarin ang mga pangunahing palatandaan ng cellular stress at maiwasan ang neuronal degeneration. Samakatuwid, ang pag-unawa sa mga functional implikasyon ng rewiring na inilarawan dito ay maaaring magbigay ng mga pangunahing pananaw sa mga posibleng paggamot para mapanatili ang neuronal viability sa panahon ng mitochondrial dysfunction. Ang mga pananaliksik sa hinaharap na naglalayong suriin ang mga pagbabago sa metabolismo ng enerhiya sa iba pang mga uri ng selula ng utak ay kinakailangan upang lubos na maipakita ang kakayahang magamit ng prinsipyong ito sa iba pang mga sakit sa neurological.
Nailarawan na ang mga daga ng MitoPark dati (31). Ang mga daga ng C57BL/6N na may mga gene ng loxP na nag-aagawan ng Mfn2 ay nailarawan na dati (18) at nai-cross sa mga daga ng L7-Cre (23). Ang nagresultang double heterozygous na supling ay pagkatapos ay nai-cross sa mga homozygous na daga ng Mfn2loxP/Mfn2loxP upang makabuo ng mga knockout ng gene na partikular sa Purkinje para sa Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Sa isang subset ng pagsasama, ang allele ng SorStop-mito-YFP ng Gt (ROSA26) (stop-mtYFP) ay ipinakilala sa pamamagitan ng mga karagdagang crossing (20). Ang lahat ng mga pamamaraan sa hayop ay isinagawa alinsunod sa mga alituntunin ng Europa, pambansa at institusyon at inaprubahan ng LandesamtfürNatur ng Umwelt at Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany. Ang trabaho sa hayop ay sumusunod din sa gabay ng European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Matapos ma-anesthesia ang cervical dislocation ng buntis, ang embryo ng daga ay ihihiwalay (E13). Ang cortex ay hiniwa sa Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) na may 10 mM Hepes at ipinasa sa Dulbecco's Modified Eagle's Medium na naglalaman ng papain (20 U/ml) at cysteine ​​​​(1μg/ml). I-incubate ang tissue sa DMEM) at i-dissociate ito sa pamamagitan ng enzymatic digestion. Ml) sa 37°C sa loob ng 20 minuto, at pagkatapos ay mekanikal na giniling sa DMEM na may 10% fetal bovine serum. Ang mga cell ay itinanim sa mga glass coverslip na pinahiran ng polylysine sa density na 2×106 bawat 6 cm culture dish o sa density na 0.5×105 cells/cm2 para sa imaging analysis. Pagkatapos ng 4 na oras, ang medium ay pinalitan ng Neurobasal serum-free medium na naglalaman ng 1% B27 supplement at 0.5 mM GlutaMax. Ang mga neuron ay pinanatili sa 37°C at 5% CO2 sa buong eksperimento, at pinakain minsan sa isang linggo. Upang ma-induce ang recombination in vitro, 3μl (24-well culture dish) o 0.5μl (24-well plate) ng sumusunod na AAV9 virus vector ang ginamit upang gamutin ang mga neuron sa ikalawang araw in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, catalog number 105530-AAV9) at AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, catalog number 105545-AAV9).
Ang komplementaryong DNA ng Mouse Mfn1 at Mfn2 (nakuha mula sa Addgene plasmid #23212 at #23213, ayon sa pagkakabanggit) ay minarkahan ng V5 sequence (GKPIPNPLLGLDST) sa C-terminus, at pinag-isa sa mCherry sa frame sa pamamagitan ng T2A sequence. Ang Grx1-roGFP2 ay isang regalo mula sa Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Sa pamamagitan ng pagpapalit ng tdTomato cassette gamit ang mga kumbensyonal na pamamaraan ng cloning, ang cassette ay na-subclone sa pAAV-CAG-FLEX-tdTomato backbone (Addgene reference number 28306) upang makabuo ng pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 at pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vectors. Isang katulad na estratehiya ang ginamit upang makabuo ng control vector na pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Upang makabuo ng AAV-shPCx construct, kinakailangan ang isang plasmid AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), na naglalaman ng DNA sequence na nagko-code sa shRNA targeting mouse PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Sa ilalim ng kontrol ng U6 promoter, ang mCherry ay ginagamit sa ilalim ng kontrol ng CMV promoter. Ang produksyon ng mga auxiliary AAV vector ay isinagawa ayon sa mga tagubilin ng tagagawa (Cell Biolabs). Sa madaling salita, gumamit ng transfer plasmid na may dalang mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) na pansamantalang ginagamit sa transfection ng 293AAV cells-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) coding gene, pati na rin ang pag-code ng AAV1 capsid protein at accessory protein. Ang packaging ng plasmid plasmid ay ginagamit ang calcium phosphate method. Ang crude virus supernatant ay nakuha sa pamamagitan ng freeze-thaw cycles sa isang dry ice/ethanol bath at lysed cells sa phosphate buffered saline (PBS). Ang AAV vector ay pinadalisay sa pamamagitan ng discontinuous iodixanol gradient ultracentrifugation (24 oras sa 32,000 rpm at 4°C) at kinonsentrate gamit ang isang Amicon ultra-15 centrifugal filter. Ang genome titer ng AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genome copy (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX ay gaya ng naunang inilarawan (54), sinukat sa pamamagitan ng real-time quantitative PCR (qPCR)-MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) at AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Ang mga primary neuron ay kinayod sa napakalamig na 1x PBS, ginawang pellet, at pagkatapos ay hinalo sa 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer na naglalaman ng phosphatase at protease inhibitor (Roche). Ang pagkuwantipika ng protina ay isinagawa gamit ang bicinchoninic acid assay (Thermo Fisher Scientific). Ang mga protina ay pinaghiwalay sa pamamagitan ng SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, at pagkatapos ay ini-blot sa isang polyvinylidene fluoride membrane (GE Healthcare). I-block ang mga non-specific site at i-incubate gamit ang primary antibody (tingnan ang Table S1 para sa mga detalye) sa 5% gatas sa TBST (Tris-buffered saline na may Tween), mga hakbang sa paghuhugas at pangalawang antibody sa TBST Incubate. I-incubate gamit ang pangunahing antibody magdamag sa +4°C. Pagkatapos hugasan, ilapat ang pangalawang antibody sa loob ng 2 oras sa temperatura ng silid. Kasunod nito, sa pamamagitan ng pag-incubate sa parehong blot gamit ang isang anti-β-actin antibody, nakumpirma ang parehong loading. Pagtukoy sa pamamagitan ng pag-convert sa chemiluminescence at pagpapahusay ng chemiluminescence (GE Healthcare).
Ang mga neuron na dating inilagay sa mga glass coverslip ay nilagyan ng 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS sa tinukoy na oras sa temperatura ng silid sa loob ng 10 minuto. Ang mga coverslip ay unang nilagyan ng 0.1% Triton X-100/PBS sa loob ng 5 minuto sa temperatura ng silid, at pagkatapos ay sa blocking buffer [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Sa ikalawang araw, ang mga coverslip ay hinugasan gamit ang blocking buffer at in-incubate kasama ang naaangkop na fluorophore-conjugated secondary antibody sa loob ng 2 oras sa temperatura ng silid; panghuli, ang mga sample ay hinugasan nang mabuti sa PBS na may 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) na nilagyan ng counterstain at pagkatapos ay nilagyan ng Aqua-Poly/Mount sa microscope slide.
Ang mga daga (lalaki at babae) ay binigyan ng pampamanhid sa pamamagitan ng intraperitoneal injection ng ketamine (130 mg/kg) at xylazine (10 mg/kg) at ibinigay nang subcutaneous kasama ang carprofen analgesic (5 mg/kg). Inilagay sa isang stereotactic instrument (Kopf) na may mainit na pad. Ilantad ang bungo at gumamit ng dental drill upang manipisin ang bahagi ng cerebellar cortex na katumbas ng mis bone (mula sa lambda: buntot 1.8, lateral 1, na katumbas ng lobules IV at V). Gumamit ng kurbadong karayom ​​para maingat na gumawa ng maliit na butas sa bungo upang maiwasan ang pagkagambala sa vasculature sa ibaba. Pagkatapos, ang manipis na iginuhit na glass capillary ay dahan-dahang ipinasok sa micro-hole (mula -1.3 hanggang -1 sa ventral side ng dura mater), at 200 hanggang 300 nl AAV ang itinurok sa micro-injector (Narishige) gamit ang manual syringes (Narishige) nang ilang beses sa mababang presyon sa loob ng 10 hanggang 20 minuto. Pagkatapos ng pagbubuhos, ilagay ang capillary sa loob ng isa pang 10 minuto upang hayaang kumalat nang tuluyan ang virus. Matapos tanggalin ang mga capillary, maingat na tinahi ang balat upang mabawasan ang pamamaga ng sugat at hayaang gumaling ang hayop. Ang mga hayop ay ginamot gamit ang mga analgesic (caspofen) sa loob ng ilang araw pagkatapos ng operasyon, kung saan sa panahong iyon ay maingat na minomonitor ang kanilang pisikal na kondisyon at pagkatapos ay pinatay sila sa itinakdang oras. Ang lahat ng mga pamamaraan ay isinagawa alinsunod sa mga alituntunin ng Europa, pambansa at institusyon at inaprubahan ng LandesamtfürNatur ng Umwelt at Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany.
Ang mga hayop ay binigyan ng pampamanhid gamit ang ketamine (100 mg/kg) at xylazine (10 mg/kg), at ang puso ay unang nilagyan ng perfume gamit ang 0.1 M PBS, at pagkatapos ay nilagyan ng 4% PFA sa PBS. Ang tisyu ay hiniwa at inayos sa 4% PFA/PBS magdamag sa 4°C. Isang vibrating knife (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) ang ginamit upang ihanda ang mga sagittal section (50 μm ang kapal) mula sa nakapirming utak sa PBS. Maliban kung may ibang tinukoy, ang paglamlam ng mga free-floating section ay isinagawa gaya ng inilarawan sa itaas (13) sa temperatura ng silid at hinahalo. Sa madaling salita, una, ang mga nakuha na hiwa ay nilagyan ng permeabilisasyon gamit ang 0.5% Triton X-100/PBS sa loob ng 15 minuto sa temperatura ng silid; para sa ilang epitopes (Pcx at Shmt2), sa pamamagitan ng in tris-EDTA buffer sa 80°C (PH 9) painitin ang mga hiwa sa loob ng 25 minuto sa halip na ang hakbang na ito. Susunod, ang mga seksyon ay in-incubate kasama ng primary antibody (tingnan ang Table S1) sa blocking buffer (3% BSA/PBS) sa 4°C magdamag habang hinahalo. Kinabukasan, ang mga seksyon ay hinugasan gamit ang blocking buffer at in-incubate kasama ng naaangkop na fluorophore-conjugated secondary antibody sa loob ng 2 oras sa temperatura ng silid; panghuli, ang mga seksyon ay hinugasan nang mabuti sa PBS, nilagyan ng counter-stain gamit ang DAPI, at pagkatapos ay inayos gamit ang AquaPolymount sa isang microscope slide.
Isang laser scanning confocal microscope (TCS SP8-X o TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) na nilagyan ng white light laser at 405 diode ultraviolet laser ang ginamit upang i-imahe ang sample. Sa pamamagitan ng pag-excite sa fluorophore at pagkolekta ng signal gamit ang Hybrid Detector (HyDs), ginamit ang LAS-X software upang mangolekta ng mga stacked image na sumusunod sa Nyquist sampling sa sequential mode: para sa mga non-quantitative panel, ito ay mga highly dynamic signal (halimbawa, sa mga somatic cell at dendrite) (mtYFP) Gamitin ang HyD upang matukoy ang bilang ng mga PN sa BrightR mode). Inilapat ang gating mula 0.3 hanggang 6 ns upang mabawasan ang background.
Real-time na imaging ng mga pinagsunod-sunod na selula. Pagkatapos pag-uri-uriin sa Neurobasal-A medium na naglalaman ng 1% B27 supplement at 0.5 mM GlutaMax, ang mga selula ay agad na inihasik sa mga poly-l-lysine-coated glass slide (μ-Slide8 Well, Ibidi, catalog number 80826), at pagkatapos ay pinanatili ito sa 37°C at 5% CO2 sa loob ng 1 oras upang hayaang tumigas ang mga selula. Isinagawa ang real-time na imaging sa isang Leica SP8 laser scanning confocal microscope na nilagyan ng puting laser, HyD, 63×[1.4 numerical aperture (NA)] oil objective lens at isang heating stage.
Mabilis na binigyan ng pampamanhid ang daga gamit ang carbon dioxide at pinugutan ng ulo, ang utak ay mabilis na tinanggal mula sa bungo, at hiniwa sa 200μm na kapal (para sa eksperimento sa pag-label ng 13C) o 275μm na kapal (para sa dalawang eksperimento sa photon) na sagittal na seksyon na nilagyan ng mga sumusunod na materyales. Ang ice cream (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ay nilagyan ng mga sumusunod na sangkap: 125 mM na malamig, carbon-saturated (95% O2 at 5% CO2) na mababa sa Ca2 + artificial cerebrospinal fluid (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucose, 0.5 mM CaCl2 at 3.5 mM MgCl2 (osmotic pressure na 310 hanggang 330 mmol). Ilipat ang nakuha na mga hiwa ng utak sa isang silid bago ang pagpapapisa ng itlog na naglalaman ng mas mataas na Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 at 2.0 mM MgCl2) Medium) pH 7.4 at 310 hanggang 320 mmol).
Sa proseso ng imaging, ang mga hiwa ay inilipat sa isang nakalaang silid ng imaging, at ang eksperimento ay isinagawa sa ilalim ng patuloy na ACSF perfusion sa isang pare-parehong temperatura na 32° hanggang 33°C. Isang multiphoton laser scanning microscope (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) na nilagyan ng Leica 25x objective lens (NA 0.95, tubig), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) ang ginamit para sa slice imaging. FLIM module (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM ng Grx1-roGFP2. Ang mga pagbabago sa cytoplasmic redox state ng mga PN ay sinukat gamit ang two-photon FLIM sa sagittal brain slices, kung saan tinarget ng Grx1-roGFP2 biosensor ang mga PN. Sa PN layer, ang acquisition field ay pinipili mga 50 hanggang 80 μm sa ibaba ng slice surface upang matiyak na mayroong mabubuhay na PN (ibig sabihin, ang kawalan ng beaded structure o neuronal morphological changes sa kahabaan ng mga dendrite) at ang double positive roGFP2 sensor at AAV encoding shRNA PCx o ang control sequence nito (bawat isa ay co-expressing mCherry). Kolektahin ang mga single-stack na imahe na may 2x digital zoom [excitation wavelength: 890 nm; 512 nm 512 pixels]. Detection: internal HyD, fluorescein isothiocyanate (FITC) filter group] at image averaging sa loob ng 2 hanggang 3 minuto ay ginagamit upang matiyak na sapat na photons ang nakolekta (1000 photons sa kabuuan) para sa curve fitting. Ang sensitibidad ng Grx1-roGFP2 probe at ang pagpapatunay ng mga kondisyon ng FLIM ay isinagawa sa pamamagitan ng pagsubaybay sa lifespan value ng roGFP2 nang idagdag ang exogenous 10 mM H2O2 sa perfusion ACSF (upang ma-maximize ang oksihenasyon, na magreresulta sa mas mahabang lifespan), at pagkatapos ay idagdag ang 2 mM dithiothreitol (binabawasan ang antas ng pagbawas, na magreresulta sa pagbaba ng lifespan) (Figure S8, D hanggang G). Gamitin ang FLIMfit 5.1.1 software upang suriin ang mga nakuhang resulta, iangkop ang single exponential decay curve ng buong imahe sa nasukat na IRF (instrument response function), at ang χ2 ay humigit-kumulang 1. Upang kalkulahin ang lifetime ng isang PN, ang mask sa paligid ng nerve body ay manu-manong iginuhit, at ang average lifetime sa bawat mask ay ginamit para sa quantification.
Pagsusuri ng potensyal ng mitochondrial. Matapos i-incubate ang acute section gamit ang 100 nM TMRM na direktang idinagdag sa perfused ACSF sa loob ng 30 minuto, ang mga pagbabago sa potensyal ng mitochondrial ng mga PN ay sinukat gamit ang isang two-photon microscope. Isinagawa ang TMRM imaging sa pamamagitan ng pag-excite ng probe sa 920 nm at paggamit ng internal HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) upang mangolekta ng mga signal; gamit ang parehong excitation wavelength ngunit gamit ang ibang internal HyD (FITC: 525/50) upang i-imahe ang mtYFP. Gamitin ang Image Calculator plug-in ng ImageJ upang suriin ang potensyal ng mitochondrial sa antas ng single cell. Sa madaling salita, ang plug-in equation: signal = min (mtYFP, TMRM) ay ginagamit upang matukoy ang rehiyon ng mitochondrial na nagpapakita ng signal ng TMRM sa Purkinje Somali sa single-stack confocal image ng kaukulang channel. Pagkatapos, ang pixel area sa resultang mask ay binibilang, at pagkatapos ay nio-normalize sa kaukulang threshold single-stack image ng mtYFP channel upang makuha ang mitochondrial fraction na nagpapakita ng mitochondrial potential.
Ang imahe ay pinaghiwalay gamit ang Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) software. Para sa mga na-scan na larawan ng mga tile, ang montage ng isang tile ay ginagawa gamit ang automatic stitching algorithm na ibinigay ng LAS-X software. Pagkatapos ng image calibration, gamitin ang ImageJ at Adobe Photoshop upang higit pang maproseso ang imahe at pantay na isaayos ang brightness at contrast. Gamitin ang Adobe Illustrator para sa paghahanda ng graphic.
Pagsusuri ng pokus ng mtDNA. Ang bilang ng mga lesyon ng mtDNA ay tinantiya sa mga seksyon ng cerebellar na may label na mga antibody laban sa DNA gamit ang confocal microscope. Ang bawat target na lugar ay nilikha para sa katawan ng selula at nucleus ng bawat selula, at ang kani-kanilang lugar ay kinalkula gamit ang Multi Measure plug-in (ImageJ software). Ibawas ang nuclear area mula sa lugar ng katawan ng selula upang makuha ang cytoplasmic area. Panghuli, ang Analyze Particles plug-in (ImageJ software) ay ginamit upang awtomatikong bilangin ang mga cytoplasmic DNA point na nagpapahiwatig ng mtDNA sa threshold image, at ang mga nakuha na resulta ay na-normalize sa PN average ng mga CTRL mice. Ang mga resulta ay ipinahayag bilang average na bilang ng mga nucleosides bawat selula.
Pagsusuri ng ekspresyon ng protina. Gamitin ang plug-in ng Image Calculator ng ImageJ upang suriin ang ekspresyon ng protina sa PN sa antas ng single cell. Sa madaling salita, sa single-layer confocal image ng kaukulang channel, sa pamamagitan ng equation: signal = min (mtYFP, antibody), matutukoy ang rehiyon ng mitochondrial na nagpapakita ng immunoreactivity sa isang partikular na antibody sa Purkina. Pagkatapos, ang pixel area sa nagresultang mask ay tinatantya, at pagkatapos ay ni-normalize sa kaukulang threshold single-stack image ng mtYFP channel upang makuha ang mitochondrial fraction ng ipinapakitang protina.
Pagsusuri ng densidad ng selula ng Purkinje. Ginamit ang Cell Counter plug-in ng ImageJ upang suriin ang densidad ng Purkinje sa pamamagitan ng paghahati ng bilang ng mga selula ng Purkinje na binilang sa haba ng cerebellar ring na okupado ng mga binilang na selula.
Paghahanda at pagkolekta ng sample. Ang mga utak mula sa control group at Mfn2cKO mice ay inayos sa 2% PFA/2.5% glutaraldehyde sa 0.1 M phosphate buffer (PB), at pagkatapos ay inihanda ang mga coronal section gamit ang mga ciliate (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Kapal 50 hanggang 60 μm). Pagkatapos ay inayos sa PB buffer sa 1% os tetraoxide at 1.5% potassium ferrocyanide sa temperatura ng silid sa loob ng 1 oras. Ang mga seksyon ay hinugasan ng tatlong beses gamit ang distilled water, at pagkatapos ay kinulayan ng 70% ethanol na naglalaman ng 1% uranyl acetate sa loob ng 20 minuto. Ang mga seksyon ay pagkatapos ay inalis sa tubig sa graded alcohol at inilagay sa Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, catalog number 14040) sa pagitan ng silicon-coated glass slides, at sa huli sa 60°C ay i-polymerize sa oven sa loob ng 48 oras. Ang cerebellar cortex area ay napili at ang 50 nm ultrathin na mga seksyon ay ginupit sa Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) at kinuha sa isang 2×1 mm copper slit grid na binalutan ng polystyrene film. Ang mga seksyon ay kinulayan ng solusyon ng 4% uranyl acetate sa H2O sa loob ng 10 minuto, hinugasan ng H2O nang ilang beses, pagkatapos ay gamit ang Reynolds lead citrate sa H2O sa loob ng 10 minuto, at pagkatapos ay hinugasan ng H2O nang ilang beses. Ang mga micrograph ay kinuha gamit ang isang transmission electron microscope na Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gamit ang isang TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digital camera (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Germany).
Para sa mga daga na nahawaan ng AAV, ang utak ay pinaghiwalay at hiniwa sa isang 1 mm na kapal na sagittal section, at ang cerebellum ay sinuri gamit ang fluorescence microscope upang matukoy ang singsing na nahawaan ng AAV (ibig sabihin, mCherry expressing). Tanging mga eksperimento kung saan ang iniksyon ng AAV ay nagreresulta sa napakataas na transduction efficiency ng Purkinje cell layer (ibig sabihin, halos ang buong layer) sa hindi bababa sa dalawang magkasunod na cerebellar ring ang ginagamit. Ang AAV-transduced loop ay microdissected para sa magdamag pagkatapos ng fixation (4% PFA at 2.5% glutaraldehyde sa 0.1 M cocoate buffer) at pinoproseso pa. Para sa EPON embedding, ang nakapirming tissue ay hinugasan gamit ang 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem), at in-incubate gamit ang 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) sa 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) sa loob ng 4 na oras, pagkatapos ay hinugasan sa loob ng 2 oras. Ulitin nang 3 beses gamit ang 0.1 M cocamide buffer. Kasunod nito, ang ascending series ng ethanol ay ginamit upang i-incubate ang bawat ethanol solution sa 4°C sa loob ng 15 minuto upang matuyo ang tissue. Ang tissue ay inilipat sa propylene oxide at in-incubate magdamag sa EPON (Sigma-Aldrich) sa 4°C. Ilagay ang tissue sa bagong EPON sa temperatura ng kuwarto sa loob ng 2 oras, at pagkatapos ay i-embed ito sa 62°C sa loob ng 72 oras. Gumamit ng ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) at diamond knife (Diatome, Biel, Switzerland) upang gupitin ang 70 nm ultrathin na mga seksyon, at kulayan ng 1.5% uranyl acetate sa loob ng 15 minuto sa 37°C, at kulayan ng lead citrate solution sa loob ng 4 na minuto. Ang mga electron micrograph ay kinuha gamit ang JEM-2100 Plus transmission electron microscope (JEOL) na may Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) at DigitalMicrograph software (Gatan). Para sa pagsusuri, ang mga electron micrograph ay nakuha gamit ang 5000× o 10,000× digital zoom.
Pagsusuring morpolohikal ng mitochondria. Para sa lahat ng pagsusuri, ang mga contour ng indibidwal na mitochondria ay manu-manong binalangkas sa mga digital na imahe gamit ang ImageJ software. Sinuri ang iba't ibang mga parametrong morpolohikal. Ang densidad ng mitochondrial ay ipinahayag bilang isang porsyento na nakuha sa pamamagitan ng paghahati sa kabuuang lugar ng mitochondrial ng bawat cell sa lugar ng cytoplasm (cytoplasm area = cell area-cell nucleus area) × 100. Ang pagiging bilog ng mitochondria ay kinakalkula gamit ang pormulang [4π∙(area/perimeter 2)]. Ang morpolohiya ng ista ng mitochondria ay sinuri at hinati sa dalawang kategorya (“tubular” at “paltos”) ayon sa kanilang mga pangunahing hugis.
Pagsusuri ng bilang at densidad ng autophagosome/lysosome. Gamitin ang ImageJ software upang manu-manong ibalangkas ang mga contour ng bawat autophagosome/lysosome sa digital na imahe. Ang lugar ng autophagosome/lysosome ay ipinapahayag bilang isang porsyento na kinakalkula sa pamamagitan ng paghahati sa kabuuang lugar ng istruktura ng autophagosome/lysosome ng bawat cell sa lugar ng cytoplasm (cytoplasm area=cell area-nucleus area)×100. Ang densidad ng mga autophagosome/lysosome ay kinakalkula sa pamamagitan ng paghahati sa kabuuang bilang sa bilang ng mga istruktura ng autophagosome/lysosome bawat cell (sa mga tuntunin ng cytoplasmic area) (cytoplasmic area = cell area-nuclear area).
Paglalagay ng label para sa acute sectioning at paghahanda ng sample. Para sa mga eksperimentong nangangailangan ng paglalagay ng label sa glucose, ilipat ang mga acute brain slice sa isang pre-incubation chamber, na naglalaman ng saturated carbon (95% O2 at 5% CO2), mataas na Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 at 2.0 mM MgCl2, inayos sa pH 7.4 at 310 hanggang 320 mOsm), kung saan ang glucose ay 13C6- Glucose substitution (Eurisotop, catalog number CLM-1396). Para sa mga eksperimentong nangangailangan ng paglalagay ng pyruvate label, ilipat ang mga acute brain slices sa mas mataas na Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 at idagdag ang 2.0 mM MgCl2, isaayos sa pH 7.4 at 310 hanggang 320 mOsm), at idagdag ang 1 mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, catalog number CLM-1082). I-incubate ang mga seksyon sa loob ng 90 minuto sa 37°C. Sa pagtatapos ng eksperimento, ang mga seksyon ay mabilis na hinugasan gamit ang isang aqueous solution (pH 7.4) na naglalaman ng 75 mM ammonium carbonate, at pagkatapos ay i-homogenize sa 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: tubig. Matapos i-incubate ang mga seksyon sa yelo sa loob ng 30 minuto, ang mga sample ay isinailalim sa centrifugation sa 21,000 g sa loob ng 10 minuto sa 4°C, at ang malinaw na supernatant ay pinatuyo sa isang SpeedVac concentrator. Ang nagresultang pinatuyong metabolite pellet ay itinago sa -80°C hanggang sa pagsusuri.
Pagsusuri ng Liquid chromatography-mass spectrometry ng 13 C-labeled amino acids. Para sa pagsusuri ng liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), ang metabolite pellet ay muling isinalin sa 75μl ng LC-MS grade water (Honeywell). Pagkatapos ng centrifugation sa 21,000 g sa loob ng 5 minuto sa 4°C, 20 μl ng nilinaw na supernatant ang ginamit para sa pagsusuri ng amino acid flux, habang ang natitirang katas ay agad na ginamit para sa pagsusuri ng anion (tingnan sa ibaba). Isinagawa ang pagsusuri ng amino acid gamit ang naunang inilarawan na benzoyl chloride derivatization protocol (55, 56). Sa unang hakbang, 10μl ng 100 mM sodium carbonate (Sigma-Aldrich) ang idinagdag sa 20μl ng metabolite extract, at pagkatapos ay 10μl ng 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) ang idinagdag sa LC grade ACN. Ang sample ay sandaling ini-vortex at pagkatapos ay sinentrifuga sa 21,000 g sa loob ng 5 minuto sa 20°C. Ilipat ang nalinis na supernatant sa isang 2 ml na autosampler vial na may conical glass insert (200 μl volume). Ang mga sample ay sinuri gamit ang Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) na konektado sa Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) high-resolution precision mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Para sa pagsusuri, 2μl ng derivatized sample ang itinurok sa isang 100×1.0 mm high-strength silica T3 column (Waters) na naglalaman ng 1.8μm na particle. Ang flow rate ay 100μl/min, at ang buffer system ay binubuo ng buffer A (10 mM ammonium formate at 0.15% formic acid sa tubig) at buffer B (ACN). Ang gradient ay ang mga sumusunod: 0%B sa 0 minuto; 0%B. 0 hanggang 15% B sa 0 hanggang 0.1 minuto; 15 hanggang 17% B sa 0.1 hanggang 0.5 minuto; B sa 17 hanggang 55% sa 0.5 hanggang 14 minuto; B sa 55 hanggang 70% sa 14 hanggang 14.5 minuto; sa 14.5 hanggang 70 hanggang 100% B sa 18 minuto; 100% B sa 18 hanggang 19 minuto; 100 hanggang 0% B sa 19 hanggang 19.1 minuto; 0% B sa 19.1 hanggang 28 minuto (55, 56). Ang QE-HF mass spectrometer ay gumagana sa positive ionization mode na may mass range na m/z (mass/charge ratio) na 50 hanggang 750. Ang inilapat na resolution ay 60,000, at ang nakuha na gain control (AGC) ion target ay 3×106, at ang maximum ion time ay 100 milliseconds. Ang heated electrospray ionization (ESI) source ay gumagana sa spray voltage na 3.5 kV, capillary temperature na 250°C, sheath airflow na 60 AU (arbitrary units), at auxiliary airflow na 20 AU. 250°C. Ang S lens ay nakatakda sa 60 AU.
Anion chromatography-MS analysis ng 13C labeled organic acids. Ang natitirang metabolite precipitate (55μl) ay sinuri gamit ang Dionex ion chromatography system (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) na konektado sa isang QE-HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Sa madaling salita, 5μl ng metabolite extract ang itinurok sa isang Dionex IonPac AS11-HC column na may HPLC (2 mm×250 mm, particle size 4μm, Thermo Fisher Scientific) sa push-in partial loop mode na may filling ratio na 1.) Dionex IonPac AG11-HC guard column (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Ang temperatura ng column ay pinapanatili sa 30°C, at ang autosampler ay nakatakda sa 6°C. Gumamit ng potassium hydroxide cartridge na may deionized water upang makabuo ng potassium hydroxide gradient sa pamamagitan ng eluent generator. Paghihiwalay ng mga metabolite sa bilis ng daloy na 380μl/min, gamit ang sumusunod na gradient: 0 hanggang 3 minuto, 10 mM KOH; 3 hanggang 12 minuto, 10 hanggang 50 mM KOH; 12 hanggang 19 minuto, 50 hanggang 100 mM KOH; 19 hanggang 21 minuto, 100 mM KOH; 21 hanggang 21.5 minuto, 100 hanggang 10 mM KOH. Ang column ay muling in-equilibrate sa ilalim ng 10 mM KOH sa loob ng 8.5 minuto.
Ang mga na-elute na metabolite ay pinagsama sa isang 150μl/min isopropanol supplement stream pagkatapos ng column at pagkatapos ay itinuturo sa isang high-resolution mass spectrometer na tumatakbo sa negative ionization mode. Minomonitor ng MS ang mass range mula m/z 50 hanggang 750 na may resolution na 60,000. Ang AGC ay nakatakda sa 1×106, at ang maximum ion time ay pinapanatili sa 100 ms. Ang pinainit na ESI source ay pinatakbo sa spray voltage na 3.5 kV. Ang iba pang mga setting ng ion source ay ang mga sumusunod: capillary temperature 275°C; sheath gas flow, 60 AU; auxiliary gas flow, 20 AU sa 300°C, at S lens setting sa 60 AU.
Pagsusuri ng datos ng mga metabolite na may label na 13C. Gamitin ang TraceFinder software (bersyon 4.2, Thermo Fisher Scientific) para sa pagsusuri ng datos ng isotope ratio. Ang pagkakakilanlan ng bawat compound ay napatunayan ng isang maaasahang reference compound at sinuri nang hiwalay. Upang maisagawa ang isotope enrichment analysis, ang area ng nakuha na ion chromatogram (XIC) ng bawat 13C isotope (Mn) ay kinuha mula sa [M + H] +, kung saan ang n ay ang carbon number ng target compound, na ginagamit upang suriin ang mga amino acid o [MH] + ay ginagamit upang suriin ang mga anion. Ang mass accuracy ng XIC ay mas mababa sa limang bahagi bawat milyon, at ang accuracy ng RT ay 0.05 minuto. Ang enrichment analysis ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagkalkula ng ratio ng bawat natukoy na isotope sa kabuuan ng lahat ng isotope ng kaukulang compound. Ang mga ratio na ito ay ibinibigay bilang mga halaga ng porsyento para sa bawat isotope, at ang mga resulta ay ipinahayag bilang molar percent enrichment (MPE), tulad ng inilarawan dati (42).
Ang nagyelong neuron pellet ay hinalo sa malamig na 80% methanol (v/v), ini-vortex, at in-incubate sa -20°C sa loob ng 30 minuto. I-vortex muli ang sample at haluin sa +4°C sa loob ng 30 minuto. Ang sample ay sinentrifuga sa 21,000 g sa loob ng 5 minuto sa 4°C, at pagkatapos ay kinolekta at pinatuyo ang nagresultang supernatant gamit ang isang SpeedVac concentrator sa 25°C para sa kasunod na pagsusuri. Gaya ng inilarawan sa itaas, isinagawa ang pagsusuri ng LC-MS sa mga amino acid ng mga pinagsunod-sunod na selula. Gamit ang TraceFinder (bersyon 4.2, Thermo Fisher Scientific), isinagawa ang pagsusuri ng datos gamit ang monoisotopic mass ng bawat compound. Ang quantile normalization ng datos ng metabolite ay isinagawa gamit ang preprocessCore software package (57).
Paghahanda ng hiwa. Ang daga ay mabilis na binigyan ng pampamanhid gamit ang carbon dioxide at pinugutan ng ulo, ang utak ay mabilis na tinanggal mula sa bungo, at ginamit ang kutsilyong may yelo na pang-vibrate (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) upang hiwain ito sa 300 hanggang 375 μm na sagittal na mga seksyon. Malamig na carbon gasification (95% O2 at 5% CO2) Mababang Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 at 6.0 mM MgCl2. Ayusin sa pH 7.4 at 310 hanggang 330 mOsm). Ilipat ang nakuha na mga hiwa ng utak sa isang silid na naglalaman ng mas mataas na Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 at mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 at 310 hanggang 320 mOsm). Itabi ang mga hiwa sa loob ng 20 hanggang 30 minuto upang maibalik ang mga ito bago irekord.
pagre-record. Isang microscope stage na may nakapirming recording chamber at 20x water immersion objective lens (Scientifica) ang ginamit para sa lahat ng recording. Ang mga posibleng Purkinje cells ay kinilala sa pamamagitan ng (i) laki ng katawan, (ii) anatomical location ng cerebellum, at (iii) expression ng fluorescent mtYFP reporter gene. Ang patch pipette na may tip resistance na 5 hanggang 11 megohms ay hinihila palabas ng isang borosilicate glass capillary (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) at isang horizontal pipette Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Ang lahat ng recording ay isinagawa gamit ang ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Germany), na kinokontrol ng software na Signal (bersyon 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Ang eksperimento ay naitala sa sampling rate na 12.5 kHz. Ang signal ay sinasala gamit ang dalawang short-pass Bessel filter na may cutoff frequencies na 1.3 at 10 kHz ayon sa pagkakabanggit. Ang capacitance ng membrane at ng pipette ay kino-compensate ng compensation circuit gamit ang amplifier. Ang lahat ng mga eksperimento ay isinagawa sa ilalim ng kontrol ng isang Orca-Flash 4.0 camera (Hamamatsu, Gerden, Germany), na kinokontrol ng Hokawo software (bersyon 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germany).
Regular na konpigurasyon at pagsusuri ng buong selula. Bago irekord, punuin ang pipette ng panloob na solusyon na naglalaman ng mga sumusunod na sangkap: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) at 10.0 mM creatinine phosphate ay inayos sa pH 7.25, at ang osmotic pressure ay 290 mOsm (sucrose). Kaagad pagkatapos maglapat ng puwersang 0 pA upang mabasag ang lamad, sinukat ang resting membrane potential. Ang input resistance ay sinusukat sa pamamagitan ng paglalapat ng hyperpolarized currents na -40, -30, -20, at -10 pA. Sukatin ang magnitude ng voltage response at gamitin ang Ohm's law upang kalkulahin ang input resistance. Ang kusang aktibidad ay naitala sa isang voltage clamp sa loob ng 5 minuto, at ang sPSC ay natukoy at sinukat sa Igor Pro (bersyon 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) gamit ang isang semi-automatic recognition script. Ang IV curve at steady-state current ay sinusukat sa pamamagitan ng pag-clamping sa baterya sa iba't ibang potensyal (simula sa -110 mV) at pagtaas ng boltahe sa 5 mV na hakbang. Ang produksyon ng AP ay sinubukan sa pamamagitan ng paglalapat ng depolarizing current. I-clamp ang cell sa -70 mV habang naglalapat ng depolarizing current pulse. Ayusin ang step size ng bawat recording unit nang hiwalay (10 hanggang 60 pA). Kalkulahin ang maximum na AP frequency sa pamamagitan ng manu-manong pagbibilang ng mga pulse spike na nagdudulot ng pinakamataas na AP frequency. Ang AP threshold ay sinusuri gamit ang pangalawang derivative ng depolarization pulse na unang nagti-trigger ng isa o higit pang mga AP.
Konpigurasyon at pagsusuri ng butas-butas na patch. Magsagawa ng pagtatala ng butas-butas na patch gamit ang mga karaniwang protocol. Gumamit ng pipette na walang ATP at GTP na hindi naglalaman ng mga sumusunod na sangkap: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA at 2 mM MgCl2, at i-adjust sa pH 7.2 (gamit ang KOH). Ang ATP at GTP ay inaalis sa intracellular solution upang maiwasan ang hindi makontrol na permeability ng cell membrane. Ang patch pipette ay pinupuno ng internal solution na naglalaman ng amphotericin (humigit-kumulang 200 hanggang 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) upang makakuha ng punched patch record. Ang amphotericin ay tinunaw sa dimethyl sulfoxide (pinal na konsentrasyon: 0.1 hanggang 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Ang konsentrasyon ng DMSO na ginamit ay walang makabuluhang epekto sa mga neuron na pinag-aralan. Sa proseso ng pagsuntok, ang resistensya ng channel (Ra) ay patuloy na minomonitor, at ang eksperimento ay sinimulan matapos maging matatag ang amplitude ng Ra at AP (20-40 minuto). Ang kusang aktibidad ay sinusukat sa isang boltahe at/o kasalukuyang clamp sa loob ng 2 hanggang 5 minuto. Isinagawa ang pagsusuri ng datos gamit ang Igor Pro (bersyon 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (bersyon 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) at GraphPad Prism (bersyon 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Upang matukoy ang mga kusang AP, ginagamit ang NeuroMatic v3.0c plug-in ng IgorPro. Awtomatikong tinutukoy ang mga AP gamit ang isang ibinigay na threshold, na isa-isang inaayos para sa bawat record. Gamit ang spike interval, tukuyin ang spike frequency na may pinakamataas na instantaneous spike frequency at ang average na spike frequency.
Paghihiwalay ng PN. Sa pamamagitan ng pag-angkop sa naunang nailathalang protocol, ang mga PN ay pinadalisay mula sa cerebellum ng daga sa isang tinukoy na yugto (58). Sa madaling salita, ang cerebellum ay hiniwa at tinadtad sa napakalamig na dissociation medium [walang HBSS Ca2+ at Mg2+, dinagdagan ng 20 mM glucose, penicillin (50 U/ml) at streptomycin (0.05 mg/ml)], at pagkatapos ay dinurog ang medium sa papain [HBSS, dinagdagan ng 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) at deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Ginamot sa loob ng 30 minuto sa 30°C. Una, hugasan ang mga tisyu sa HBSS medium na naglalaman ng egg mucus (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) at DNase (0.1 mg/ml) sa temperatura ng silid upang maiwasan ang enzymatic digestion, at pagkatapos ay sa HBSS medium na naglalaman ng 20 mM glucose. Dahan-dahang dinurog ang HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) at DNase (0.1 mg/ml) ay naglalabas ng mga indibidwal na selula. Ang nagresultang cell suspension ay sinala sa pamamagitan ng isang 70μm cell strainer, pagkatapos ay ang mga selula ay pininturahan sa pamamagitan ng centrifugation (1110 rpm, 5 minuto, 4°C) at muling isinalin sa sorting medium [HBSS, na may kasamang 20 mM glucose, 20% fetal bovine) serum, penicillin (50 U/ml) at streptomycin (0.05 mg/ml)]; suriin ang kakayahang mabuhay ng selula gamit ang propidium iodide at ayusin ang densidad ng selula sa 1×106 hanggang 2×106 cells/ml. Bago ang flow cytometry, ang suspensyon ay sinala gamit ang isang 50 μm cell strainer.
Flow cytometer. Isinagawa ang pag-uuri ng selula sa 4°C gamit ang FACSAria III machine (BD Biosciences) at FACSDiva software (BD Biosciences, bersyon 8.0.1). Ang suspensyon ng selula ay inayos gamit ang isang 100 μm nozzle sa ilalim ng presyon na 20 psi sa rate na ~2800 events/sec. Dahil ang tradisyonal na pamantayan sa gating (laki ng selula, bimodal discrimination, at scattering characteristics) ay hindi matiyak ang tamang paghihiwalay ng PN mula sa ibang mga uri ng selula, ang gating strategy ay itinakda batay sa direktang paghahambing ng intensity ng YFP at autofluorescence sa mitoYFP+ ​​​​at sa control mitoYFP − Mice. Ang YFP ay nae-excite sa pamamagitan ng pag-iilaw sa sample gamit ang isang 488 nm laser line, at ang signal ay nade-detect gamit ang isang 530/30 nm band pass filter. Sa mitoYFP+ ​​​​mice, ang relatibong lakas ng Rosa26-mitoYFP reporter gene ay ginagamit din upang makilala ang mga neuronal body at axon fragment. Ang 7-AAD ay pinasigla gamit ang isang 561 nm yellow laser at na-detect gamit ang isang 675/20 nm bandpass filter upang alisin ang mga patay na selula. Upang sabay na paghiwalayin ang mga astrocytes, ang suspensyon ng selula ay kinulayan ng ACSA-2-APC, pagkatapos ay ang sample ay inilantad sa isang 640 nm laser line, at isang 660/20 nm bandpass filter ang ginamit upang ma-detect ang signal.
Ang mga nakolektang selula ay kinalkal sa pamamagitan ng centrifugation (1110 rpm, 5 minuto, 4°C) at iniimbak sa -80°C hanggang sa gamitin. Ang mga daga na Mfn2cKO at ang kanilang mga tuta ay inuri sa parehong araw upang mabawasan ang pagkakaiba-iba ng pamamaraan. Ang presentasyon at pagsusuri ng datos ng FACS ay isinagawa gamit ang FlowJo software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Gaya ng nabanggit sa itaas (59), ginagamit ang real-time PCR upang ihiwalay ang DNA mula sa mga pinagsunod-sunod na neuron para sa kasunod na mtDNA quantification. Ang linearity at threshold sensitivity ay unang sinubukan sa pamamagitan ng pagpapatakbo ng qPCR sa iba't ibang bilang ng mga cell. Sa madaling salita, mangolekta ng 300 PN sa isang lysis buffer na binubuo ng 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 at proteinase K (200 ng/ml) at i-incubate sa 55°C sa loob ng 120 minuto. Ang mga cell ay karagdagang in-incubate sa 95°C sa loob ng 10 minuto upang matiyak ang kumpletong inactivation ng proteinase K. Gamit ang isang TaqMan probe (Thermo Fisher) na partikular sa mt-Nd1, ang mtDNA ay sinukat sa pamamagitan ng semi-quantitative PCR sa 7900HT Real-Time PCR system (Thermo Fisher Scientific). Agham, numero ng katalogo na Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numero ng katalogo na AIVI3E8) at 18S (Thermo Fisher Scientific, numero ng katalogo na Hs99999901_s1) na mga gene.
Paghahanda ng sample ng proteome. Sa pamamagitan ng pagpapainit ng solusyon sa 95°C sa loob ng 10 minuto at pag-sonicate, sa lysis buffer [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide at 100 mM tris-Lyse frozen neuron pellets sa HCl]. Sa Bioruptor (Diagenode) sa loob ng 10 minuto (30 segundong pulse / 30 segundong pause period). Ang sample ay diluted 1:10 sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0), hinaluan ng 300 ng trypsin gold (Promega), at in-incubate magdamag sa 37°C upang makamit ang kumpletong digestion. Sa ikalawang araw, ang sample ay sinentrifuga sa 20,000 g sa loob ng 20 minuto. Ang supernatant ay diluted na may 0.1% formic acid, at ang solusyon ay inalis ang asin gamit ang sariling gawang StageTips. Ang sample ay pinatuyo sa isang instrumentong SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) sa 45°C, at pagkatapos ay ang peptide ay sinuspinde sa 0.1% formic acid. Ang lahat ng sample ay sabay-sabay na inihanda ng iisang tao. Upang masuri ang mga sample ng astrocyte, 4 μg na desalted peptides ay nilagyan ng label na tandem mass tag (TMT10plex, catalog number 90110, Thermo Fisher Scientific) na may peptide to TMT reagent ratio na 1:20. Para sa paglalagay ng label sa TMT, 0.8 mg ng TMT reagent ay muling sinuspinde sa 70 μl ng anhydrous ACN, at ang pinatuyong peptide ay muling hinalo sa 9 μl ng 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), kung saan idinagdag ang 7 μl ng TMT reagent sa ACN. Ang konsentrasyon ay 43.75%. Pagkatapos ng 60 minutong incubation, ang reaksyon ay pinalamig gamit ang 2 μl ng 5% hydroxylamine. Ang mga may label na peptide ay tinipon, pinatuyo, muling isinalin sa 200μl ng 0.1% formic acid (FA), hinati sa dalawa, at pagkatapos ay inalis ang asin gamit ang sariling gawang StageTips. Gamit ang UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), isa sa dalawang kalahati ay pinagpira-piraso sa isang 1mm x 150mm Acquity chromatographic column na puno ng 130Å1.7μm C18 particles (Waters, catalog No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Paghiwalayin ang mga peptide sa flow rate na 30μl/min, paghiwalayin mula sa 1% hanggang 50% buffer B sa loob ng 85 minuto na may stepwise gradient na 96 minuto, mula sa 50% hanggang 95% buffer B sa loob ng 3 minuto, pagkatapos ay 8 minuto para sa 95% Buffer B; Ang buffer A ay 5% ACN at 10 mM ammonium bicarbonate (ABC), at ang buffer B ay 80% ACN at 10 mM ABC. Kolektahin ang mga fraction kada 3 minuto at pagsamahin ang mga ito sa dalawang grupo (1 + 17, 2 + 18, atbp.) at patuyuin ang mga ito sa isang vacuum centrifuge.
Pagsusuri ng LC-MS/MS. Para sa mass spectrometry, ang mga peptide (bilang r119.aq) ay pinaghiwalay sa isang 25 cm, 75 μm na panloob na diyametro ng PicoFrit analytical column (bagong objective lens, part number PF7508250) na nilagyan ng 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat), Gamitin ang EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germany). Ang column ay pinanatili sa 50°C. Ang mga buffer A at B ay 0.1% formic acid sa tubig at 0.1% formic acid sa 80% ACN, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga peptide ay pinaghiwalay mula sa 6% hanggang 31% buffer B sa loob ng 65 minuto at mula sa 31% hanggang 50% buffer B sa loob ng 5 minuto na may gradient na 200 nl/min. Ang mga na-elute na peptide ay sinuri sa isang Orbitrap Fusion mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Ang pagsukat ng peptide precursor m/z ay isinasagawa na may resolusyon na 120,000 sa hanay na 350 hanggang 1500 m/z. Gamit ang 27% normalized collision energy, ang pinakamalakas na precursor na may charge state na 2 hanggang 6 ay pinili para sa high energy C trap dissociation (HCD) cleavage. Ang cycle time ay nakatakda sa 1 s. Ang m/z value ng peptide fragment ay sinukat sa ion trap gamit ang pinakamaliit na AGC target na 5×104 at ang maximum injection time na 86 ms. Pagkatapos ng fragmentation, ang precursor ay inilagay sa dynamic exclusion list sa loob ng 45 s. Ang mga peptide na may label na TMT ay pinaghiwalay sa isang 50 cm, 75 μm na Acclaim PepMap column (Thermo Fisher Scientific, catalog number 164942), at ang mga migration spectra ay sinuri sa isang Orbitrap Lumos Tribrid mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) na nilagyan ng high-field asymmetric waveform ions (FAIMS) equipment (Thermo Fisher Scientific) na gumagana sa dalawang compensation voltages na −50 at −70 V. Ang MS3 na napili batay sa synchronization precursor ay ginagamit para sa pagsukat ng TMT report ion signal. Ang peptide separation ay isinagawa sa EASY-nLC 1200, gamit ang 90% linear gradient elution, na may buffer concentration na 6% hanggang 31%; ang buffer A ay 0.1% FA, at ang buffer B ay 0.1% FA at 80% ACN. Ang analytical column ay pinapatakbo sa 50°C. Gamitin ang FreeStyle (bersyon 1.6, Thermo Fisher Scientific) upang hatiin ang orihinal na file ayon sa FAIMS compensation voltage.
Pagtukoy at pagkuwantipika ng protina. Gamit ang integrated Andromeda search engine, sinuri ang orihinal na datos gamit ang MaxQuant bersyon 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Bukod sa mga sequence ng Cre recombinase at YFP na nakuha mula sa Aequorea victoria, hinanap ang peptide fragment spectra para sa canonical sequence at isoform sequence ng mouse reference proteome (Proteome ID UP000000589, na-download mula sa UniProt noong Mayo 2017). Ang methionine oxidation at protein N-terminal acetylation ay itinakda bilang variable modifications; ang cysteine ​​​​carbamoyl methylation ay itinakda bilang fixed modifications. Ang mga digestion parameter ay nakatakda sa "specificity" at "trypsin/P". Ang minimum na bilang ng mga peptide at razor peptide na ginamit para sa pagtukoy ng protina ay 1; ang minimum na bilang ng mga natatanging peptide ay 0. Sa ilalim ng mga kondisyon ng peptide map matching, ang protein identification rate ay 0.01. Ang opsyong "Second Peptide" ay pinagana. Gamitin ang opsyong “match between runs” upang ilipat ang matagumpay na pagkakakilanlan sa pagitan ng iba't ibang orihinal na file. Gamitin ang LFQ minimum ratio count 1 para sa label-free quantification (LFQ) (60). Ang LFQ intensity ay sinasala para sa hindi bababa sa dalawang wastong halaga sa hindi bababa sa isang genotype group sa bawat punto ng oras, at ini-extrapolate mula sa isang normal na distribusyon na may lapad na .0.3 at bumababa sa 1.8. Gamitin ang Perseus computing platform (https://maxquant.net/perseus/) at R (https://r-project.org/) upang suriin ang mga resulta ng LFQ. Isang two-way moderate t test mula sa limma software package ang ginamit para sa differential expression analysis (61). Ang exploratory data analysis ay isinagawa gamit ang ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally at pheatmap. Ang TMT-based proteomics data ay sinuri gamit ang MaxQuant version 1.6.10.43. Maghanap ng hilaw na datos ng proteomics mula sa database ng human proteomics ng UniProt, na na-download noong Setyembre 2018. Kasama sa pagsusuri ang isotope purity correction factor na ibinigay ng tagagawa. Gamitin ang limma sa R ​​para sa differential expression analysis. Ang orihinal na datos, mga resulta ng paghahanap sa database, at daloy ng trabaho at mga resulta ng pagsusuri ng datos ay nakaimbak lahat sa ProteomeXchange alliance sa pamamagitan ng PRIDE partner repository na may data set identifier na PXD019690.
Pinapayaman ng mga functional annotation ang pagsusuri. Ginamit ang tool na Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) upang matukoy ang kayamanan ng mga termino ng functional annotation ng set ng datos sa ika-8 linggo (Larawan 1). Sa madaling salita, ang listahan ng quantitative protein na nakuha mula sa pagsusuri ng datos ng LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) ay ginagamit gamit ang mga sumusunod na pamantayan sa pagsala: Ang Mus musculus ay napili bilang species at background, at ipinapakita ng kategorya na ang P value na inayos ni Benjamini para sa enrichment na 0.05 o mas mababa ay itinuturing na makabuluhan. Para sa graph na ito, ipinapakita ang nangungunang limang excess categories sa bawat cluster batay sa inayos na P value. Gamit ang multiple t-test, gamit ang two-stage linear boost program nina Benjamini, Krieger, at Yekutieli (Q = 5%), isinasagawa ang time-course protein expression analysis sa mga mahahalagang kandidato na natukoy sa bawat kategorya, at ang bawat row ay sinusuri nang hiwalay. Hindi na kailangang gumamit ng isang consistent SD.
Upang maihambing ang mga resulta ng pag-aaral na ito sa mga nailathalang database at makabuo ng isang Venn diagram sa Figure 1, pinagsama namin ang listahan ng quantitative protein sa mga anotasyon ng MitoCarta 2.0 (24). Gamitin ang online tool na Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) upang makabuo ng diagram.
Para sa detalyadong impormasyon tungkol sa mga pamamaraang pang-estadistika na ginagamit para sa pagsusuri ng proteomics, mangyaring sumangguni sa kaukulang seksyon ng Mga Materyales at Paraan. Para sa lahat ng iba pang mga eksperimento, ang detalyadong impormasyon ay matatagpuan sa kaukulang legend. Maliban kung may ibang tinukoy, ang lahat ng datos ay ipinahayag bilang mean ± SEM, at lahat ng pagsusuring pang-estadistika ay isinagawa gamit ang GraphPad Prism 8.1.2 software.
Para sa mga karagdagang materyales para sa artikulong ito, pakitingnan ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ito ay isang artikulong maaaring gamitin sa bukas na pag-access na ipinamamahagi sa ilalim ng mga tuntunin ng Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, na nagpapahintulot sa paggamit, pamamahagi, at pagpaparami sa anumang midyum, hangga't ang pangwakas na paggamit ay hindi para sa komersyal na pakinabang at ang premise ay tama ang orihinal na akda. Sanggunian.
Paalala: Hinihiling lang namin sa iyo na ibigay ang iyong email address upang malaman ng taong irerekomenda mo sa pahina na gusto mong makita nila ang email at hindi ito spam. Hindi kami kukuha ng anumang email address.
Ang tanong na ito ay ginagamit upang subukan kung ikaw ay isang bisita at maiwasan ang awtomatikong pagpapadala ng spam.
Ni E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Ang pagsusuri ng proteomics ng mga dysfunctional neuron ay nagsiwalat na ang mga metabolic program ay isinaaktibo upang kontrahin ang neurodegeneration.
Ni E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Ang pagsusuri ng proteomics ng mga dysfunctional neuron ay nagsiwalat na ang mga metabolic program ay isinaaktibo upang kontrahin ang neurodegeneration.
©2020 American Association for the Advancement of Science. lahat ng karapatan ay nakalaan. Ang AAAS ay partner ng HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef at COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.