Ang artikulo ay bahagi ng paksang pananaliksik na "Mga advanced na teknolohiya ng bioremediation at mga proseso ng pag-recycle ng mga sintetikong organikong compound (SOC). Tingnan ang lahat ng 14 na artikulo.
Ang mga low molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) tulad ng naphthalene at substituted naphthalenes (methylnaphthalene, naphthoic acid, 1-naphthyl-N-methylcarbamate, atbp.) ay malawakang ginagamit sa iba't ibang industriya at genotoxic, mutagenic at/o carcinogenic sa mga organismo. Ang mga synthetic organic compound (SOCs) o xenobiotics na ito ay itinuturing na mga priority pollutant at nagdudulot ng seryosong banta sa pandaigdigang kapaligiran at kalusugan ng publiko. Ang tindi ng mga aktibidad ng tao (hal. coal gasification, oil refining, emissions ng sasakyan at mga aplikasyon sa agrikultura) ang nagtatakda ng konsentrasyon, kapalaran at transportasyon ng mga ubiquitous at persistent compound na ito. Bilang karagdagan sa mga pisikal at kemikal na pamamaraan ng paggamot/pag-alis, ang mga green at environment-friendly na teknolohiya tulad ng bioremediation, na gumagamit ng mga microorganism na may kakayahang ganap na sirain ang mga POC o i-convert ang mga ito sa mga hindi nakakalason na by-product, ay lumitaw bilang isang ligtas, cost-effective at promising na alternatibo. Ang iba't ibang uri ng bacteria na kabilang sa phyla na Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia, at Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus at Paenibacillus), at Actinobacteria (Rhodococcus at Arthrobacter) sa microbiota ng lupa ay nagpakita ng kakayahang sirain ang iba't ibang organikong compound. Ang mga pag-aaral sa metabolic, genomics, at metagenomic analysis ay tumutulong sa atin na maunawaan ang catabolic complexity at diversity na naroroon sa mga simpleng anyong ito ng buhay, na maaaring higit pang mailapat para sa mahusay na biodegradation. Ang pangmatagalang pag-iral ng mga PAH ay nagresulta sa paglitaw ng mga nobelang phenotype ng degradation sa pamamagitan ng horizontal gene transfer gamit ang mga genetic element tulad ng plasmids, transposon, bacteriophages, genomic islands, at integrative conjugative elements. Ang systems biology at genetic engineering ng mga partikular na isolates o model communities (consortia) ay maaaring magbigay-daan sa komprehensibo, mabilis, at mahusay na bioremediation ng mga PAH na ito sa pamamagitan ng mga synergistic effect. Sa pagsusuring ito, tututuon kami sa iba't ibang metabolic pathways at diversity, genetic composition at diversity, at mga cellular responses/adaptation ng naphthalene at substituted na naphthalene-degrading bacteria. Magbibigay ito ng ecological information para sa field application at strain optimization para sa mahusay na bioremediation.
Ang mabilis na pag-unlad ng mga industriya (petrochemical, agrikultura, parmasyutiko, pangkulay sa tela, kosmetiko, atbp.) ay nakapag-ambag sa pandaigdigang kaunlarang pang-ekonomiya at pinabuting pamantayan ng pamumuhay. Ang mabilis na pag-unlad na ito ay nagresulta sa produksyon ng maraming synthetic organic compounds (SOCs), na ginagamit sa paggawa ng iba't ibang produkto. Kabilang sa mga dayuhang compound o SOCs na ito ang polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), pesticides, herbicides, plasticizers, dyes, parmasyutiko, organophosphates, flame retardants, volatile organic solvents, atbp. Ang mga ito ay ibinubuga sa atmospera, aquatic at terrestrial ecosystems kung saan mayroon silang maraming epekto, na nagdudulot ng mga nakapipinsalang epekto sa iba't ibang bioforms sa pamamagitan ng pagbabago ng mga katangiang physicochemical at istruktura ng komunidad (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Maraming aromatic pollutants ang may malakas at mapanirang epekto sa maraming buo at mahalagang ecosystem/biodiversity hotspots (hal. mga coral reef, yelo sa Arctic/Antarctic, matataas na lawa sa bundok, mga sediment sa malalim na dagat, atbp.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Ipinakita ng mga kamakailang pag-aaral na geomicrobiological na ang pagdedeposito ng sintetikong organikong bagay (hal. mga aromatic pollutants) at ang kanilang mga derivatives sa mga ibabaw ng mga artipisyal na istruktura (built environment) (hal. mga cultural heritage site at mga monumento na gawa sa granite, bato, kahoy at metal) ay nagpapabilis sa kanilang pagkasira (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Ang mga aktibidad ng tao ay maaaring magpalala at magpalala sa biological na pagkasira ng mga monumento at gusali sa pamamagitan ng polusyon sa hangin at pagbabago ng klima (Liu et al. 2020). Ang mga organikong kontaminant na ito ay tumutugon sa singaw ng tubig sa atmospera at nananatili sa istraktura, na nagiging sanhi ng pisikal at kemikal na pagkasira ng materyal. Ang biodegradation ay malawakang kinikilala bilang mga hindi kanais-nais na pagbabago sa hitsura at mga katangian ng mga materyales na dulot ng mga buhay na organismo na nakakaapekto sa kanilang pangangalaga (Pochon at Jaton, 1967). Ang karagdagang aksyong mikrobyo (metabolismo) ng mga compound na ito ay maaaring makabawas sa integridad ng istruktura, bisa ng konserbasyon, at halaga ng kultura (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Sa kabilang banda, sa ilang mga kaso, ang pag-aangkop at pagtugon ng mikrobyo sa mga istrukturang ito ay napatunayang kapaki-pakinabang dahil bumubuo ang mga ito ng mga biofilm at iba pang proteksiyon na crust na nagpapababa sa rate ng pagkabulok/pagkabulok (Martino, 2016). Samakatuwid, ang pagbuo ng epektibong pangmatagalang napapanatiling mga estratehiya sa konserbasyon para sa mga monumento na bato, metal, at kahoy ay nangangailangan ng masusing pag-unawa sa mga pangunahing proseso na kasangkot sa prosesong ito. Kung ikukumpara sa mga natural na proseso (mga prosesong heolohikal, sunog sa kagubatan, pagsabog ng bulkan, mga reaksyon ng halaman at bacteria), ang mga aktibidad ng tao ay nagreresulta sa paglabas ng malalaking volume ng polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) at iba pang organic carbon (OC) sa mga ecosystem. Maraming PAH na ginagamit sa agrikultura (mga insecticide at pestisidyo tulad ng DDT, atrazine, carbaryl, pentachlorophenol, atbp.), industriya (crude oil, oil sludge/waste, mga plastik na galing sa petrolyo, PCB, plasticizer, detergent, disinfectant, fumigant, fragrances at preservatives), mga produktong pang-personal na pangangalaga (sunscreen, disinfectant, insect repellent at polycyclic musk) at mga munition (mga pampasabog tulad ng 2,4,6-TNT) ay mga potensyal na xenobiotics na maaaring makaapekto sa kalusugan ng planeta (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna at Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Maaaring palawakin ang listahang ito upang maisama ang mga compound na galing sa petrolyo (mga fuel oil, lubricant, asphaltene), mga high molecular weight bioplastics, at ionic liquids (Amde et al., 2015). Nakalista sa Talahanayan 1 ang iba't ibang aromatic pollutants at ang kanilang mga aplikasyon sa iba't ibang industriya. Sa mga nakaraang taon, ang mga emisyon ng tao ng mga pabagu-bagong organikong compound, pati na rin ang carbon dioxide at iba pang mga greenhouse gas, ay nagsimulang tumaas (Dvorak et al., 2017). Gayunpaman, ang mga epekto ng tao ay higit na lumalagpas sa mga natural. Bukod pa rito, natuklasan namin na maraming SOC ang nananatili sa maraming kapaligiran at natukoy bilang mga umuusbong na pollutant na may masamang epekto sa mga biome (Larawan 1). Isinama ng mga ahensya sa kapaligiran tulad ng United States Environmental Protection Agency (USEPA) ang marami sa mga pollutant na ito sa kanilang listahan ng prayoridad dahil sa kanilang mga cytotoxic, genotoxic, mutagenic, at carcinogenic na katangian. Samakatuwid, kinakailangan ang mahigpit na mga regulasyon sa pagtatapon at epektibong mga estratehiya para sa paggamot/pag-alis ng basura mula sa mga kontaminadong ecosystem. Iba't ibang pisikal at kemikal na pamamaraan ng paggamot tulad ng pyrolysis, oxidative thermal treatment, air aeration, landfilling, incineration, atbp. ay hindi epektibo at magastos at lumilikha ng mga kinakaing unti-unti, nakalalason at mahirap gamutin na mga by-product. Dahil sa pagtaas ng pandaigdigang kamalayan sa kapaligiran, ang mga mikroorganismo na may kakayahang sirain ang mga pollutant na ito at ang kanilang mga derivatives (tulad ng halogenated, nitro, alkyl at/o methyl) ay nakakakuha ng tumataas na atensyon (Fennell et al., 2004; Haritash at Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Ang paggamit ng mga katutubong kandidatong mikroorganismo na ito nang mag-isa o sa mga halo-halong kultura (mga kolonya) para sa pag-alis ng mga aromatic pollutant ay may mga bentahe sa mga tuntunin ng kaligtasan sa kapaligiran, gastos, kahusayan, bisa, at pagpapanatili. Sinusuri rin ng mga mananaliksik ang pagsasama ng mga proseso ng microbial sa mga electrochemical redox method, katulad ng bioelectrochemical systems (BES), bilang isang promising na teknolohiya para sa paggamot/pag-alis ng pollutant (Huang et al., 2011). Ang teknolohiyang BES ay nakaakit ng tumataas na atensyon dahil sa mataas na kahusayan, mababang gastos, kaligtasan sa kapaligiran, operasyon sa temperatura ng silid, mga materyales na biocompatible, at ang kakayahang mabawi ang mahahalagang by-product (hal., kuryente, gasolina, at mga kemikal) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Ang pagdating ng mga high-throughput genome sequencing at omics tools/methods ay nagbigay ng maraming bagong impormasyon tungkol sa genetic regulation, proteomics, at fluxomics ng mga reaksyon ng iba't ibang degrader microorganisms. Ang pagsasama-sama ng mga tool na ito sa systems biology ay lalong nagpahusay sa ating pag-unawa sa pagpili at pagpino ng mga target catabolic pathways sa mga microorganism (ibig sabihin, metabolic design) upang makamit ang mahusay at epektibong biodegradation. Upang magdisenyo ng mga epektibong estratehiya sa bioremediation gamit ang mga angkop na candidate microorganism, kailangan nating maunawaan ang biochemical potential, metabolic diversity, genetic composition, at ecology (autoecology/synecology) ng mga microorganism.
Larawan 1. Mga pinagmumulan at landas ng mga low-molecular PAH sa iba't ibang kapaligiran at iba't ibang salik na nakakaapekto sa biota. Ang mga putol-putol na linya ay kumakatawan sa mga interaksyon sa pagitan ng mga elemento ng ekosistema.
Sa pagsusuring ito, sinubukan naming ibuod ang datos tungkol sa pagkasira ng mga simpleng PAH tulad ng naphthalene at mga substituted naphthalene ng iba't ibang bacterial isolates na sumasaklaw sa mga metabolic pathway at diversity, mga enzyme na kasangkot sa pagkasira, komposisyon/nilalaman at diversity ng gene, mga tugon ng cellular at iba't ibang aspeto ng bioremediation. Ang pag-unawa sa mga antas ng biochemical at molekular ay makakatulong sa pagtukoy ng mga angkop na host strain at ang kanilang karagdagang genetic engineering para sa epektibong bioremediation ng mga naturang priority pollutant. Makakatulong ito sa pagbuo ng mga estratehiya para sa pagtatatag ng site-specific bacterial consortia para sa epektibong bioremediation.
Ang pagkakaroon ng malaking bilang ng mga nakalalason at mapanganib na aromatic compound (na sumusunod sa Huckel rule na 4n + 2π electrons, n = 1, 2, 3, …) ay nagdudulot ng seryosong banta sa iba't ibang kapaligiran tulad ng hangin, lupa, sediments, at ibabaw at tubig sa lupa (Puglisi et al., 2007). Ang mga compound na ito ay may iisang benzene rings (monocyclic) o maraming benzene rings (polycyclic) na nakaayos sa linear, angular o cluster form at nagpapakita ng stability (katatagan/kawalang-tatag) sa kapaligiran dahil sa mataas na negative resonance energy at inertness (inertness), na maaaring ipaliwanag sa pamamagitan ng kanilang hydrophobicity at reduced state. Kapag ang aromatic ring ay higit pang pinalitan ng methyl (-CH3), carboxyl (-COOH), hydroxyl (-OH), o sulfonate (-HSO3) groups, ito ay nagiging mas matatag, may mas malakas na affinity para sa macromolecules, at bioaccumulative sa mga biological system (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Ang ilang low molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons (LMWAHs), tulad ng naphthalene at mga derivatives nito [methylnaphthalene, naphthoic acid, naphthalenesulfonate, at 1-naphthyl N-methylcarbamate (carbaryl)], ay isinama sa listahan ng mga priority organic pollutants ng US Environmental Protection Agency bilang genotoxic, mutagenic, at/o carcinogenic (Cerniglia, 1984). Ang paglabas ng ganitong uri ng NM-PAHs sa kapaligiran ay maaaring magresulta sa bioaccumulation ng mga compound na ito sa lahat ng antas ng food chain, sa gayon ay nakakaapekto sa kalusugan ng mga ecosystem (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Ang mga pinagmumulan at landas ng mga PAH patungo sa biota ay pangunahing sa pamamagitan ng migrasyon at mga interaksyon sa pagitan ng iba't ibang bahagi ng ecosystem tulad ng lupa, tubig sa lupa, tubig sa ibabaw, mga pananim at atmospera (Arey at Atkinson, 2003). Ipinapakita ng Figure 1 ang mga interaksyon at distribusyon ng iba't ibang low molecular weight PAH sa mga ecosystem at ang kanilang mga landas patungo sa biota/pagkakalantad ng tao. Ang mga PAH ay idinedeposito sa mga ibabaw bilang resulta ng polusyon sa hangin at sa pamamagitan ng migrasyon (drift) ng mga emisyon ng sasakyan, mga industrial exhaust gas (coal gasification, combustion at produksyon ng coke) at ang kanilang deposition. Ang mga gawaing industriyal tulad ng paggawa ng mga sintetikong tela, tina at pintura; preserbasyon ng kahoy; pagproseso ng goma; mga aktibidad sa paggawa ng semento; produksyon ng pestisidyo; at mga aplikasyon sa agrikultura ay mga pangunahing pinagmumulan ng mga PAH sa mga terrestrial at aquatic system (Bamforth at Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Ipinakita ng mga pag-aaral na ang mga lupa sa mga suburban at urban na lugar, malapit sa mga highway, at sa malalaking lungsod ay mas madaling kapitan ng polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) dahil sa mga emisyon mula sa mga planta ng kuryente, residential heating, mga karga ng trapiko sa hangin at kalsada, at mga aktibidad sa konstruksyon (Suman et al., 2016). Ipinakita ng (2008) na ang mga PAH sa lupa malapit sa mga kalsada sa New Orleans, Louisiana, USA ay kasingtaas ng 7189 μg/kg, samantalang sa bukas na espasyo, ito ay 2404 μg/kg lamang. Katulad nito, ang mga antas ng PAH na kasingtaas ng 300 μg/kg ay naiulat sa mga lugar na malapit sa mga lugar ng coal gasification sa ilang lungsod sa US (Kanaly at Harayama, 2000; Bamforth at Singleton, 2005). Ang mga lupa mula sa iba't ibang lungsod sa India tulad ng Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni at Venkataraman, 2000) at Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) ay naiulat na naglalaman ng mataas na konsentrasyon ng PAHs. Ang mga aromatic compound ay mas madaling masipsip sa mga particle ng lupa, organikong bagay at mga mineral na luwad, kaya nagiging pangunahing carbon sink sa mga ecosystem (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Ang mga pangunahing pinagmumulan ng PAHs sa mga aquatic ecosystem ay ang presipitasyon (basa/tuyong presipitasyon at singaw ng tubig), urban runoff, wastewater discharge, groundwater recharge atbp. (Srogi, 2007). Tinatayang humigit-kumulang 80% ng mga PAHs sa mga marine ecosystem ay nagmumula sa presipitasyon, sedimentation, at waste discharge (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Ang mas mataas na konsentrasyon ng mga PAH sa tubig sa ibabaw o leachate mula sa mga lugar ng pagtatapon ng solidong basura ay kalaunan ay tumatagas sa tubig sa lupa, na nagdudulot ng malaking banta sa kalusugan ng publiko dahil mahigit 70% ng populasyon sa Timog at Timog-Silangang Asya ang umiinom ng tubig sa lupa (Duttagupta et al., 2019). Isang kamakailang pag-aaral ni Duttagupta et al. (2020) sa mga pagsusuri sa ilog (32) at tubig sa lupa (235) mula sa West Bengal, India, ang natagpuan na tinatayang 53% ng mga residente sa lungsod at 44% ng mga residente sa kanayunan (na may kabuuang 20 milyong residente) ay maaaring malantad sa naphthalene (4.9–10.6 μg/L) at mga derivatives nito. Ang magkakaibang mga pattern ng paggamit ng lupa at pagtaas ng pagkuha ng tubig sa lupa ay itinuturing na mga pangunahing salik na kumokontrol sa patayong transportasyon (advection) ng mga low molecular weight PAH sa ilalim ng lupa. Ang mga agricultural runoff, mga discharge ng wastewater sa munisipyo at industriya, at mga discharge ng solidong basura/basura ay natagpuang apektado ng mga PAH sa mga basin ng ilog at mga sediment sa ilalim ng lupa. Ang presipitasyon sa atmospera ay lalong nagpapalala sa polusyon ng PAH. Mataas na konsentrasyon ng mga PAH at ng kanilang mga alkyl derivatives (51 sa kabuuan) ang naiulat sa mga ilog/watershed sa buong mundo, tulad ng Fraser River, Louan River, Denso River, Missouri River, Anacostia River, Ebro River, at Delaware River (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Sa mga sediment ng Ganges River basin, ang naphthalene at phenanthrene ang natagpuang pinakamahalaga (natukoy sa 70% ng mga sample) (Duttagupta et al., 2019). Bukod dito, ipinakita ng mga pag-aaral na ang chlorination ng inuming tubig ay maaaring humantong sa pagbuo ng mas nakalalasong oxygenated at chlorinated PAHs (Manoli at Samara, 1999). Ang mga PAH ay naiipon sa mga cereal, prutas, at gulay bilang resulta ng pagsipsip ng mga halaman mula sa mga kontaminadong lupa, tubig sa lupa, at presipitasyon (Fismes et al., 2002). Maraming organismo sa tubig tulad ng isda, tahong, tulya, at hipon ang nahawahan ng mga PAH sa pamamagitan ng pagkonsumo ng kontaminadong pagkain at tubig-dagat, pati na rin sa pamamagitan ng mga tisyu at balat (Mackay at Fraser, 2000). Ang mga pamamaraan ng pagluluto/pagproseso tulad ng pag-iihaw, pag-iihaw, pagpapausok, pagprito, pagpapatuyo, pagbe-bake, at pagluluto gamit ang uling ay maaari ring humantong sa malaking dami ng mga PAH sa pagkain. Ito ay higit na nakasalalay sa pagpili ng materyal na pagpapausok, nilalaman ng phenolic/aromatic hydrocarbon, pamamaraan ng pagluluto, uri ng pampainit, nilalaman ng kahalumigmigan, suplay ng oxygen, at temperatura ng pagkasunog (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Ang mga polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) ay natukoy din sa gatas sa iba't ibang konsentrasyon (0.75–2.1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Ang akumulasyon ng mga PAH na ito sa pagkain ay nakadepende rin sa mga katangiang pisiko-kemikal ng pagkain, habang ang kanilang mga nakalalasong epekto ay may kaugnayan sa mga tungkuling pisyolohikal, aktibidad na metaboliko, pagsipsip, distribusyon at pamamahagi ng katawan (Mechini et al., 2011).
Matagal nang alam ang toxicity at mapaminsalang epekto ng polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) (Cherniglia, 1984). Ang low molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons (LMW-PAHs) (dalawa hanggang tatlong singsing) ay maaaring covalently bind sa iba't ibang macromolecules tulad ng DNA, RNA at mga protina at carcinogenic (Santarelli et al., 2008). Dahil sa kanilang hydrophobic na katangian, ang mga ito ay pinaghihiwalay ng mga lipid membrane. Sa mga tao, ang cytochrome P450 monooxygenases ay nag-o-oxidize ng mga PAH sa mga epoxide, na ang ilan ay lubos na reactive (hal., baediol epoxide) at maaaring humantong sa pagbabago ng mga normal na selula sa mga malignant (Marston et al., 2001). Bilang karagdagan, ang mga produkto ng pagbabago ng mga PAH tulad ng mga quinones, phenols, epoxides, diols, atbp. ay mas nakakalason kaysa sa mga parent compound. Ang ilang PAH at ang kanilang mga metabolic intermediate ay maaaring makaapekto sa mga hormone at iba't ibang enzyme sa metabolismo, kaya negatibong nakakaapekto sa paglaki, sa central nervous system, sa reproductive at immune system (Swetha at Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Ang panandaliang pagkakalantad sa mga low molecular weight PAH ay naiulat na nagdudulot ng kapansanan sa paggana ng baga at thrombosis sa mga may hika at nagpapataas ng panganib ng mga kanser sa balat, baga, pantog at gastrointestinal (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Ipinakita rin ng mga pag-aaral sa hayop na ang pagkakalantad sa PAH ay maaaring magkaroon ng masamang epekto sa paggana at pag-unlad ng reproduktibo at maaaring magdulot ng katarata, pinsala sa bato at atay, at paninilaw ng balat. Ang iba't ibang produkto ng biotransformation ng PAH tulad ng mga diol, epoxide, quinone at free radical (cation) ay naipakita na bumubuo ng mga DNA adduct. Naipakita na binabago ng mga matatag na adduct ang makinarya ng replikasyon ng DNA, samantalang ang mga hindi matatag na adduct ay maaaring mag-depurinate ng DNA (pangunahin sa adenine at kung minsan sa guanine); parehong maaaring makabuo ng mga error na humahantong sa mga mutasyon (Schweigert et al. 2001). Bukod pa rito, ang mga quinone (benzo-/pan-) ay maaaring makabuo ng reactive oxygen species (ROS), na nagdudulot ng nakamamatay na pinsala sa DNA at iba pang macromolecule, sa gayon ay nakakaapekto sa function/viability ng tissue (Ewa at Danuta 2017). Ang talamak na pagkakalantad sa mababang konsentrasyon ng pyrene, biphenyl at naphthalene ay naiulat na nagdudulot ng kanser sa mga eksperimental na hayop (Diggs et al. 2012). Dahil sa kanilang nakamamatay na toxicity, ang paglilinis/pag-alis ng mga PAH na ito mula sa mga apektado/kontaminadong lugar ay isang prayoridad.
Iba't ibang pisikal at kemikal na pamamaraan ang ginamit upang alisin ang mga PAH mula sa mga kontaminadong lugar/kapaligiran. Ang mga proseso tulad ng incineration, dechlorination, UV oxidation, fixation, at solvent extraction ay may maraming disbentaha, kabilang ang pagbuo ng mga nakalalasong by-product, pagiging kumplikado ng proseso, mga isyu sa kaligtasan at regulasyon, mababang kahusayan, at mataas na gastos. Gayunpaman, ang microbial biodegradation (tinatawag na bioremediation) ay isang promising na alternatibong pamamaraan na kinabibilangan ng paggamit ng mga mikroorganismo sa anyo ng mga purong kultura o kolonya. Kung ikukumpara sa mga pisikal at kemikal na pamamaraan, ang prosesong ito ay environment-friendly, hindi invasive, cost-effective, at sustainable. Ang bioremediation ay maaaring isagawa sa apektadong lugar (in situ) o sa isang espesyal na inihandang lugar (ex situ) at samakatuwid ay itinuturing na isang mas sustainable na pamamaraan ng remediation kaysa sa tradisyonal na pisikal at kemikal na pamamaraan (Juhasz at Naidu, 2000; Andreoni at Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Ang pag-unawa sa mga microbial metabolic steps na kasangkot sa pagkasira ng mga aromatic pollutant ay may napakalaking implikasyon sa agham at ekonomiya para sa ekolohikal at pangkapaligiran na pagpapanatili. Tinatayang 2.1×1018 gramo ng carbon (C) ang nakaimbak sa mga sediment at organic compound (ibig sabihin, langis, natural gas, at karbon, ibig sabihin, mga fossil fuel) sa buong mundo, na nagbibigay ng malaking kontribusyon sa pandaigdigang siklo ng carbon. Gayunpaman, ang mabilis na industriyalisasyon, pagkuha ng fossil fuel, at mga aktibidad ng tao ay nakakabawas sa mga lithospheric carbon reservoir na ito, na naglalabas ng tinatayang 5.5×1015 g ng organic carbon (bilang mga pollutant) sa atmospera taun-taon (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Karamihan sa organic carbon na ito ay pumapasok sa mga terrestrial at marine ecosystem sa pamamagitan ng sedimentation, transportasyon, at runoff. Bilang karagdagan, ang mga bagong sintetikong pollutant na nagmula sa mga fossil fuel, tulad ng mga plastik, plasticizer at plastic stabilizer (phthalates at ang kanilang mga isomer), ay seryosong nagpaparumi sa mga marine, soil at aquatic ecosystem at kanilang biota, sa gayon ay nagpapalala sa mga panganib sa klima sa buong mundo. Iba't ibang uri ng microplastics, nanoplastics, plastic fragments at ang kanilang mga nakalalasong monomer products na nagmula sa polyethylene terephthalate (PET) ang naipon sa Karagatang Pasipiko sa pagitan ng Hilagang Amerika at Timog-silangang Asya, na bumubuo sa "Great Pacific Garbage Patch", na pumipinsala sa buhay-dagat (Newell et al., 2020). Napatunayan ng mga siyentipikong pag-aaral na hindi posibleng alisin ang mga naturang pollutant/basura sa pamamagitan ng anumang pisikal o kemikal na pamamaraan. Sa kontekstong ito, ang mga pinakakapaki-pakinabang na mikroorganismo ay ang mga may kakayahang oxidatively metabolizing pollutants tungo sa carbon dioxide, kemikal na enerhiya at iba pang hindi nakalalasong by-products na kalaunan ay papasok sa iba pang mga proseso ng nutrient cycling (H, O, N, S, P, Fe, atbp.). Kaya naman, ang pag-unawa sa microbial ecophysiology ng aromatic pollutant mineralization at ang kontrol nito sa kapaligiran ay mahalaga para sa pagtatasa ng microbial carbon cycle, net carbon budget at mga panganib sa klima sa hinaharap. Dahil sa agarang pangangailangan na alisin ang mga naturang compound mula sa kapaligiran, lumitaw ang iba't ibang eco-industries na nakatuon sa malinis na teknolohiya. Bilang kahalili, ang pagpapahalaga sa mga basurang industriyal/mga kemikal na naipon sa mga ecosystem (ibig sabihin, ang pamamaraang waste to wealth) ay itinuturing na isa sa mga haligi ng circular economy at mga layunin sa sustainable development (Close et al., 2012). Samakatuwid, ang pag-unawa sa metabolic, enzymatic at genetic na aspeto ng mga potensyal na kandidato ng degradasyon ay napakahalaga para sa epektibong pag-alis at bioremediation ng mga naturang aromatic pollutant.
Sa maraming aromatic pollutants, binibigyan namin ng espesyal na atensyon ang mga low-molecular-weight PAH tulad ng naphthalene at substituted naphthalenes. Ang mga compound na ito ay pangunahing bahagi ng mga petroleum-derived fuels, textile dyes, consumer products, pesticides (mothballs at insect repellents), plasticizers at tannins at samakatuwid ay laganap sa maraming ecosystem (Preuss et al., 2003). Itinatampok ng mga kamakailang ulat ang akumulasyon ng mga konsentrasyon ng naphthalene sa mga aquifer sediments, groundwater at subsurface soils, vadose zones at river beds, na nagmumungkahi ng bioaccumulation nito sa kapaligiran (Duttagupta et al., 2019, 2020). Binubuod ng Table 2 ang mga physicochemical properties, applications at mga epekto sa kalusugan ng naphthalene at mga derivatives nito. Kung ikukumpara sa iba pang high-molecular-weight PAHs, ang naphthalene at mga derivatives nito ay hindi gaanong hydrophobic, mas natutunaw sa tubig at malawak na ipinamamahagi sa mga ecosystem, kaya madalas itong ginagamit bilang model substrates upang pag-aralan ang metabolismo, genetics at metabolic diversity ng mga PAH. Maraming mikroorganismo ang kayang mag-metabolize ng naphthalene at mga derivatives nito, at may makukuhang komprehensibong impormasyon tungkol sa kanilang mga metabolic pathway, enzymes, at regulatory features (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Bukod pa rito, ang naphthalene at mga derivatives nito ay itinalaga bilang mga prototype compound para sa pagtatasa ng polusyon sa kapaligiran dahil sa kanilang mataas na kasaganaan at bioavailability. Tinatantya ng US Environmental Protection Agency na ang average na antas ng naphthalene ay 5.19 μg bawat cubic meter mula sa usok ng sigarilyo, pangunahin mula sa hindi kumpletong pagkasunog, at 7.8 hanggang 46 μg mula sa sidestream smoke, habang ang pagkakalantad sa creosote at naphthalene ay 100 hanggang 10,000 beses na mas mataas (Preuss et al. 2003). Ang naphthalene sa partikular ay natuklasang may respiratory toxicity at carcinogenicity na partikular sa species, region, at sex. Batay sa mga pag-aaral sa hayop, inuri ng International Agency for Research on Cancer (IARC) ang naphthalene bilang isang "posibleng human carcinogen" (Group 2B)1. Ang pagkakalantad sa mga substituted na naphthalene, pangunahin sa pamamagitan ng paglanghap o parenteral (oral) na pagbibigay, ay nagdudulot ng pinsala sa tissue ng baga at nagpapataas ng insidente ng mga tumor sa baga sa mga daga at bubwit (National Toxicology Program 2). Kabilang sa mga talamak na epekto ang pagduduwal, pagsusuka, pananakit ng tiyan, pagtatae, sakit ng ulo, pagkalito, labis na pagpapawis, lagnat, tachycardia, atbp. Sa kabilang banda, ang broad-spectrum carbamate insecticide na carbaryl (1-naphthyl N-methylcarbamate) ay naiulat na nakakalason sa mga aquatic invertebrates, amphibians, honey bees at mga tao at ipinakita na pumipigil sa acetylcholinesterase na nagdudulot ng paralisis (Smulders et al., 2003; Bulen at Distel, 2011). Samakatuwid, ang pag-unawa sa mga mekanismo ng microbial degradation, genetic regulation, enzymatic at cellular reactions ay mahalaga para sa pagbuo ng mga estratehiya sa bioremediation sa mga kontaminadong kapaligiran.
Talahanayan 2. Detalyadong impormasyon tungkol sa mga katangiang pisiko-kemikal, gamit, mga pamamaraan ng pagtukoy at mga kaugnay na sakit ng naphthalene at mga derivatives nito.
Sa mga maruming nitso, ang mga hydrophobic at lipophilic aromatic pollutant ay maaaring magdulot ng iba't ibang epekto sa cellular microbiome (komunidad) ng kapaligiran, tulad ng mga pagbabago sa membrane fluidity, membrane permeability, lipid bilayer swelling, pagkagambala sa paglipat ng enerhiya (electron transport chain/proton motive force), at aktibidad ng mga membrane-associated protein (Sikkema et al., 1995). Bukod pa rito, ang ilang soluble intermediates tulad ng catechols at quinones ay bumubuo ng reactive oxygen species (ROS) at bumubuo ng mga adduct kasama ng DNA at mga protina (Penning et al., 1999). Kaya naman, ang kasaganaan ng mga naturang compound sa mga ecosystem ay nagdudulot ng selective pressure sa mga microbial community upang maging mahusay na mga degrader sa iba't ibang antas ng physiological, kabilang ang uptake/transport, intracellular transformation, assimilation/utilization, at compartmentalization.
Isang paghahanap sa Ribosomal Database Project-II (RDP-II) ang nagsiwalat na may kabuuang 926 na uri ng bacteria ang nahiwalay mula sa media o mga enrichment culture na kontaminado ng naphthalene o mga derivatives nito. Ang grupong Proteobacteria ang may pinakamataas na bilang ng mga kinatawan (n = 755), kasunod ang Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10), at unclassified bacteria (8) (Figure 2). Ang mga kinatawan ng γ-Proteobacteria (Pseudomonadales at Xanthomonadales) ang nangibabaw sa lahat ng Gram-negative groups na may mataas na G+C content (54%), habang ang Clostridiales at Bacillales (30%) ay Gram-positive groups na may mababang G+C content. Ang Pseudomonas (ang pinakamataas na bilang, 338 na uri) ay naiulat na kayang sirain ang naphthalene at ang mga methyl derivatives nito sa iba't ibang maruming ecosystem (coal tar, petroleum, crude oil, sludge, oil spills, wastewater, organic waste at mga landfill) pati na rin sa mga buo na ecosystem (lupa, ilog, sediments at tubig sa lupa) (Figure 2). Bukod dito, ang mga pag-aaral sa pagpapayaman at metagenomic analysis sa ilan sa mga rehiyong ito ay nagsiwalat na ang mga hindi nakulturang uri ng Legionella at Clostridium ay maaaring may kapasidad na sirain ang mga ito, na nagpapahiwatig ng pangangailangang ikultura ang mga bacteria na ito upang pag-aralan ang mga bagong pathway at metabolic diversity.
Larawan 2. Pagkakaiba-iba ng taxonomy at ekolohikal na distribusyon ng mga kinatawan ng bacteria sa mga kapaligirang kontaminado ng naphthalene at mga derivatives ng naphthalene.
Sa iba't ibang mikroorganismo na sumisira sa aromatic hydrocarbon, karamihan ay may kakayahang sirain ang naphthalene bilang tanging pinagmumulan ng carbon at enerhiya. Ang pagkakasunod-sunod ng mga pangyayaring kasangkot sa metabolismo ng naphthalene ay nailarawan na para sa Pseudomonas sp. (mga strain: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 at CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 at iba pang mga strain (ND6 at AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis at Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Ang metabolismo ay sinisimulan ng isang multicomponent dioxygenase [naphthalene dioxygenase (NDO), isang ring hydroxylating dioxygenase] na nagpapagana sa oksihenasyon ng isa sa mga aromatic ring ng naphthalene gamit ang molecular oxygen bilang isa pang substrate, na nagko-convert ng naphthalene sa cis-naphthalenediol (Larawan 3). Ang Cis-dihydrodiol ay na-convert sa 1,2-dihydroxynaphthalene sa pamamagitan ng isang dehydrogenase. Ang isang ring-cleaving dioxygenase, 1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase (12DHNDO), ay nagko-convert ng 1,2-dihydroxynaphthalene sa 2-hydroxychromene-2-carboxylic acid. Ang enzymatic cis-trans isomerization ay lumilikha ng trans-o-hydroxybenzylidenepyruvate, na hinahati ng hydratase aldolase sa salicylic aldehyde at pyruvate. Ang organic acid pyruvate ang unang C3 compound na nagmula sa naphthalene carbon skeleton at itinuro sa central carbon pathway. Bukod pa rito, ang NAD+-dependent salicylaldehyde dehydrogenase ay nagko-convert ng salicylaldehyde salicylic acid. Ang metabolismo sa yugtong ito ay tinatawag na "upper pathway" ng naphthalene degradation. Ang pathway na ito ay karaniwan sa karamihan ng naphthalene-degrading bacteria. Gayunpaman, may ilang mga eksepsiyon; halimbawa, sa thermophilic Bacillus hamburgii 2, Ang pagkasira ng naphthalene ay sinisimulan ng naphthalene 2,3-dioxygenase upang bumuo ng 2,3-dihydroxynaphthalene (Annweiler et al., 2000).
Pigura 3. Mga landas ng naphthalene, methylnaphthalene, naphthoic acid, at carbaryl degradation. Ang mga nakabilog na numero ay kumakatawan sa mga enzyme na responsable para sa magkakasunod na conversion ng naphthalene at mga derivatives nito tungo sa mga kasunod na produkto. 1 — naphthalene dioxygenase (NDO); 2, cis-dihydrodiol dehydrogenase; 3, 1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase; 4, 2-hydroxychromene-2-carboxylic acid isomerase; 5, trans-O-hydroxybenzylidenepyruvate hydratase aldolase; 6, salicylaldehyde dehydrogenase; 7, salicylate 1-hydroxylase; 8, catechol 2,3-dioxygenase (C23DO); 9, 2-hydroxymuconate semialdehyde dehydrogenase; 10, 2-oxopent-4-enoate hydratase; 11, 4-hydroxy-2-oxopentanoate aldolase; 12, acetaldehyde dehydrogenase; 13, catechol-1,2-dioxygenase (C12DO); 14, muconate cycloisomerase; 15, muconolactone delta-isomerase; 16, β-ketoadipatenollactone hydrolase; 17, β-ketoadipate succinyl-CoA transferase; 18, β-ketoadipate-CoA thiolase; 19, succinyl-CoA: acetyl-CoA succinyltransferase; 20, salicylate 5-hydroxylase; 21 – gentisate 1,2-dioxygenase (GDO); 22, maleylpyruvate isomerase; 23, fumarylpyruvate hydrolase; 24, methylnaphthalene hydroxylase (NDO); 25, hydroxymethylnaphthalene dehydrogenase; 26, naphthaldehyde dehydrogenase; 27, 3-formylsalicylic acid oxidase; 28, hydroxyisophthalate decarboxylase; 29, carbaryl hydrolase (CH); 30, 1-naphthol-2-hydroxylase.
Depende sa organismo at sa henetikong kayarian nito, ang nagresultang salicylic acid ay higit pang na-metabolize alinman sa pamamagitan ng catechol pathway gamit ang salicylate 1-hydroxylase (S1H) o sa pamamagitan ng gentisate pathway gamit ang salicylate 5-hydroxylase (S5H) (Larawan 3). Dahil ang salicylic acid ang pangunahing intermediate sa metabolismo ng naphthalene (upper pathway), ang mga hakbang mula sa salicylic acid hanggang sa TCA intermediate ay madalas na tinutukoy bilang lower pathway, at ang mga gene ay nakaayos sa isang operon. Karaniwang makita na ang mga gene sa upper pathway operon (nah) at lower pathway operon (sal) ay kinokontrol ng mga karaniwang regulatory factor; halimbawa, ang NahR at salicylic acid ay kumikilos bilang mga inducer, na nagpapahintulot sa parehong operon na ganap na i-metabolize ang naphthalene (Phale et al., 2019, 2020).
Bukod pa rito, ang catechol ay cyclically cleaved sa 2-hydroxymuconate semialdehyde sa pamamagitan ng meta pathway ng catechol 2,3-dioxygenase (C23DO) (Yen et al., 1988) at higit pang hydrolyzed sa pamamagitan ng 2-hydroxymuconate semialdehyde hydrolase upang bumuo ng 2-hydroxypent-2,4-dienoic acid. Ang 2-hydroxypent-2,4-dienoate ay pagkatapos ay kino-convert sa pyruvate at acetaldehyde sa pamamagitan ng isang hydratase (2-oxopent-4-enoate hydratase) at isang aldolase (4-hydroxy-2-oxpentanoate aldolase) at pagkatapos ay pumapasok sa central carbon pathway (Figure 3). Bilang kahalili, ang catechol ay cyclically cleaved sa cis,cis-muconate sa pamamagitan ng ortho pathway ng catechol 1,2-oxygenase (C12DO). Ang muconate cycloisomerase, muconolactone isomerase, at β-ketoadipate-nollactone hydrolase ay nagko-convert ng cis,cis-muconate tungo sa 3-oxoadipate, na pumapasok sa central carbon pathway sa pamamagitan ng succinyl-CoA at acetyl-CoA (Nozaki et al., 1968) (Larawan 3).
Sa gentisate (2,5-dihydroxybenzoate) pathway, ang aromatic ring ay pinuputol ng gentisate 1,2-dioxygenase (GDO) upang bumuo ng maleylpyruvate. Ang produktong ito ay maaaring direktang i-hydrolyze sa pyruvate at malate, o maaari itong i-isomerize upang bumuo ng fumarylpyruvate, na maaaring i-hydrolyze sa pyruvate at fumarate (Larkin at Day, 1986). Ang pagpili ng alternatibong pathway ay naobserbahan sa parehong Gram-negative at Gram-positive bacteria sa biochemical at genetic levels (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Mas gusto ng Gram-negative bacteria (Pseudomonas) na gumamit ng salicylic acid, na isang inducer ng naphthalene metabolism, na dine-decarboxylate ito sa catechol gamit ang salicylate 1-hydroxylase (Gibson at Subramanian, 1984). Sa kabilang banda, sa Gram-positive bacteria (Rhodococcus), ang salicylate 5-hydroxylase ay nagko-convert ng salicylic acid tungo sa gentisic acid, samantalang ang salicylic acid ay walang inductive effect sa transcription ng naphthalene genes (Grund et al., 1992) (Figure 3).
Naiulat na ang mga uri ng hayop tulad ng Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas at Mycobacterium ay maaaring magpababa ng monomethylnaphthalene o dimethylnaphthalene (Dean-Raymond at Bartha, 1975; Cane at Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Kabilang sa mga ito, ang 1-methylnaphthalene at 2-methylnaphthalene degradation pathway ng Pseudomonas sp. CSV86 ay malinaw na pinag-aralan sa mga antas ng biochemical at enzymatic (Mahajan et al., 1994). Ang 1-Methylnaphthalene ay na-metabolize sa pamamagitan ng dalawang pathway. Una, ang aromatic ring ay hydroxylated (ang unsubstituted ring ng methylnaphthalene) upang bumuo ng cis-1,2-dihydroxy-1,2-dihydro-8-methylnaphthalene, na higit pang nao-oxidize sa methyl salicylate at methylcatechol, at pagkatapos ay pumapasok sa central carbon pathway pagkatapos ng ring cleavage (Larawan 3). Ang pathway na ito ay tinatawag na "carbon source pathway". Sa pangalawang "detoxification pathway", ang methyl group ay maaaring i-hydroxylate ng NDO upang bumuo ng 1-hydroxymethylnaphthalene, na higit pang nao-oxidize sa 1-naphthoic acid at inilalabas sa culture medium bilang isang dead-end product. Ipinakita ng mga pag-aaral na ang strain CSV86 ay hindi kayang lumaki sa 1- at 2-naphthoic acid bilang nag-iisang pinagmumulan ng carbon at enerhiya, na nagpapatunay sa detoxification pathway nito (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). Sa 2-methylnaphthalene, ang methyl group ay sumasailalim sa hydroxylation sa pamamagitan ng hydroxylase upang bumuo ng 2-hydroxymethylnaphthalene. Bukod pa rito, ang hindi napapalitan na singsing ng naphthalene ring ay sumasailalim sa ring hydroxylation upang bumuo ng isang dihydrodiol, na na-oxidize sa 4-hydroxymethylcatechol sa isang serye ng mga enzyme-catalyzed reactions at pumapasok sa central carbon pathway sa pamamagitan ng meta-ring cleavage pathway. Katulad nito, ang S. paucimobilis 2322 ay naiulat na gumagamit ng NDO upang i-hydroxylate ang 2-methylnaphthalene, na higit pang na-oxidize upang bumuo ng methyl salicylate at methylcatechol (Dutta et al., 1998).
Ang mga naphthoic acid (pinalitan/hindi pinalitan) ay mga by-product ng detoxification/biotransformation na nabuo sa panahon ng degradasyon ng methylnaphthalene, phenanthrene at anthracene at inilalabas sa spent culture medium. Naiulat na ang soil isolate na Stenotrophomonas maltophilia CSV89 ay kayang i-metabolize ang 1-naphthoic acid bilang pinagmumulan ng carbon (Phale et al., 1995). Ang metabolismo ay nagsisimula sa dihydroxylation ng aromatic ring upang bumuo ng 1,2-dihydroxy-8-carboxynaphthalene. Ang nagreresultang diol ay na-oxidize sa catechol sa pamamagitan ng 2-hydroxy-3-carboxybenzylidenepyruvate, 3-formylsalicylic acid, 2-hydroxyisophthalic acid at salicylic acid at pumapasok sa central carbon pathway sa pamamagitan ng meta-ring cleavage pathway (Figure 3).
Ang Carbaryl ay isang naphthyl carbamate pesticide. Simula noong Green Revolution sa India noong dekada 1970, ang paggamit ng mga kemikal na pataba at pestisidyo ay humantong sa pagtaas ng polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) emissions mula sa mga non-point sources ng agrikultura (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Tinatayang 55% (85,722,000 ektarya) ng kabuuang lupang sakahan sa India ang ginagamitan ng mga kemikal na pestisidyo. Sa nakalipas na limang taon (2015–2020), ang sektor ng agrikultura sa India ay gumamit ng average na 55,000 hanggang 60,000 tonelada ng pestisidyo taun-taon (Department of Cooperatives and Farmers Welfare, Ministry of Agriculture, Government of India, Agosto 2020). Sa hilaga at gitnang kapatagan ng Gangetic (ang mga estadong may pinakamataas na populasyon at densidad ng populasyon), laganap ang paggamit ng mga pestisidyo sa mga pananim, kung saan nangingibabaw ang mga insecticide. Ang Carbaryl (1-naphthyl-N-methylcarbamate) ay isang malawak na spectrum, katamtaman hanggang sa mataas na nakalalasong carbamate insecticide na ginagamit sa agrikultura ng India sa average na rate na 100-110 tonelada. Karaniwan itong ibinebenta sa ilalim ng pangalang pangkalakal na Sevin at ginagamit upang kontrolin ang mga insekto (aphid, fire ants, pulgas, mites, gagamba at marami pang ibang peste sa labas) na nakakaapekto sa iba't ibang pananim (mais, soybean, bulak, prutas at gulay). Ang ilang mga mikroorganismo tulad ng Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus at Arthrobacter ay maaari ding gamitin upang kontrolin ang iba pang mga peste. Naiulat na kayang sirain ng RC100 ang carbaryl (Larkin at Day, 1986; Chapalamadugu at Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha at Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Ang landas ng pagkasira ng carbaryl ay malawakang pinag-aralan sa antas ng biochemical, enzymatic at genetic sa mga isolate sa lupa ng Pseudomonas sp. Strains C4, C5 at C6 (Swetha at Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Larawan 3). Ang metabolic pathway ay nagsisimula sa hydrolysis ng ester bond sa pamamagitan ng carbaryl hydrolase (CH) upang bumuo ng 1-naphthol, methylamine at carbon dioxide. Ang 1-naphthol ay pagkatapos ay kino-convert sa 1,2-dihydroxynaphthalene sa pamamagitan ng 1-naphthol hydroxylase (1-NH), na karagdagang na-metabolize sa pamamagitan ng central carbon pathway sa pamamagitan ng salicylate at gentisate. Ang ilang carbaryl-degrading bacteria ay naiulat na nag-metabolize nito sa salicylic acid sa pamamagitan ng cleavage ng catechol ortho ring (Larkin at Day, 1986; Chapalamadugu at Chaudhry, 1991). Kapansin-pansin, ang naphthalene-degrading bacteria ay pangunahing nag-metabolize ng salicylic acid sa pamamagitan ng catechol, samantalang ang carbaryl-degrading bacteria ay mas gustong mag-metabolize ng salicylic acid sa pamamagitan ng gentisate pathway.
Ang naphthalenesulfonic acid/disulfonic acid at mga naphthylaminesulfonic acid derivatives ay maaaring gamitin bilang mga intermediate sa produksyon ng mga azo dyes, wetting agents, dispersants, atbp. Bagama't ang mga compound na ito ay may mababang toxicity sa mga tao, ipinakita ng mga pagtatasa ng cytotoxicity na ang mga ito ay nakamamatay sa mga isda, daphnia at algae (Greim et al., 1994). Ang mga kinatawan ng genus na Pseudomonas (mga strain na A3, C22) ay naiulat na nagpapasimula ng metabolismo sa pamamagitan ng double hydroxylation ng aromatic ring na naglalaman ng sulfonic acid group upang bumuo ng isang dihydrodiol, na higit pang kino-convert sa 1,2-dihydroxynaphthalene sa pamamagitan ng kusang cleavage ng sulfite group (Brilon et al., 1981). Ang nagresultang 1,2-dihydroxynaphthalene ay catabolized sa pamamagitan ng classical naphthalene pathway, ibig sabihin, ang catechol o gentisate pathway (Figure 4). Ipinakita na ang aminonaphthalenesulfonic acid at hydroxynaphthalenesulfonic acid ay maaaring ganap na masira ng pinaghalong bacterial consortia na may mga komplementaryong catabolic pathway (Nortemann et al., 1986). Ipinakita na ang isang miyembro ng consortium ay nagde-desulfurize ng aminonaphthalenesulfonic acid o hydroxynaphthalenesulfonic acid sa pamamagitan ng 1,2-dioxygenation, habang ang aminosalicylate o hydroxysalicylate ay inilalabas sa culture medium bilang isang dead-end metabolite at kasunod na kinukuha ng iba pang mga miyembro ng consortium. Ang naphthalenedisulfonic acid ay medyo polar ngunit hindi gaanong biodegradable at samakatuwid ay maaaring ma-metabolize sa pamamagitan ng iba't ibang pathway. Ang unang desulfurization ay nangyayari sa panahon ng regioselective dihydroxylation ng aromatic ring at ng sulfonic acid group; Ang pangalawang desulfurization ay nangyayari sa panahon ng hydroxylation ng 5-sulfosalicylic acid sa pamamagitan ng salicylic acid 5-hydroxylase upang bumuo ng gentisic acid, na pumapasok sa central carbon pathway (Brilon et al., 1981) (Larawan 4). Ang mga enzyme na responsable para sa naphthalene degradation ay responsable rin para sa metabolismo ng naphthalene sulfonate (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Pigura 4. Mga metabolic pathway para sa naphthalene sulfonate degradation. Ang mga numero sa loob ng mga bilog ay kumakatawan sa mga enzyme na responsable para sa metabolismo ng naphthyl sulfonate, katulad/kapareho ng mga enzyme na inilarawan sa FIG. 3.
Ang mga low molecular weight PAH (LMW-PAH) ay maaaring mabawasan, hydrophobic at mahirap matunaw, at samakatuwid ay hindi madaling kapitan ng natural na pagkasira/pagkabulok. Gayunpaman, ang mga aerobic microorganism ay kayang i-oxidize ito sa pamamagitan ng pagsipsip ng molecular oxygen (O2). Ang mga enzyme na ito ay pangunahing kabilang sa klase ng oxidoreductases at maaaring magsagawa ng iba't ibang reaksyon tulad ng aromatic ring hydroxylation (mono- o dihydroxylation), dehydrogenation at aromatic ring cleavage. Ang mga produktong nakuha mula sa mga reaksyong ito ay nasa mas mataas na oxidation state at mas madaling ma-metabolize sa pamamagitan ng central carbon pathway (Phale et al., 2020). Ang mga enzyme sa degradation pathway ay naiulat na inducible. Ang aktibidad ng mga enzyme na ito ay napakababa o bale-wala kapag ang mga cell ay lumaki sa mga simpleng pinagmumulan ng carbon tulad ng glucose o organic acids. Binubuod ng Table 3 ang iba't ibang enzyme (oxygenases, hydrolases, dehydrogenases, oxidases, atbp.) na kasangkot sa metabolismo ng naphthalene at mga derivatives nito.
Talahanayan 3. Mga katangiang biokemikal ng mga enzyme na responsable para sa pagkasira ng naphthalene at mga derivatives nito.
Ipinakita ng mga pag-aaral sa radioisotope (18O2) na ang pagsasama ng molekular na O2 sa mga aromatic ring sa pamamagitan ng mga oxygenase ang pinakamahalagang hakbang sa pag-activate ng karagdagang biodegradation ng isang compound (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Ang pagsasama ng isang atomo ng oxygen (O) mula sa molekular na oxygen (O2) papunta sa substrate ay sinisimulan ng alinman sa endogenous o exogenous monooxygenases (tinatawag ding hydroxylases). Ang isa pang atomo ng oxygen ay nababawasan sa tubig. Binabawasan ng mga exogenous monooxygenases ang flavin gamit ang NADH o NADPH, samantalang sa mga endomonooxygenases, ang flavin ay nababawasan ng substrate. Ang posisyon ng hydroxylation ay nagreresulta sa pagkakaiba-iba sa pagbuo ng produkto. Halimbawa, ang salicylate 1-hydroxylase hydroxylates salicylic acid sa posisyong C1, na bumubuo ng catechol. Sa kabilang banda, ang multicomponent salicylate 5-hydroxylase (na naglalaman ng reductase, ferredoxin, at oxygenase subunits) ay nag-hydroxylate ng salicylic acid sa posisyong C5, na bumubuo ng gentisic acid (Yamamoto et al., 1965).
Ang mga dioxygenases ay nagsasama ng dalawang atomo ng O2 sa substrate. Depende sa mga produktong nabuo, ang mga ito ay nahahati sa mga ring hydroxylating dioxygenases at mga ring cleaving dioxygenases. Ang mga ring hydroxylating dioxygenases ay nagko-convert ng mga aromatic substrate sa mga cis-dihydrodiol (hal., naphthalene) at laganap sa mga bacteria. Sa ngayon, naipakita na ang mga organismo na naglalaman ng mga ring hydroxylating dioxygenases ay may kakayahang lumaki sa iba't ibang aromatic carbon source, at ang mga enzyme na ito ay inuuri bilang NDO (naphthalene), toluene dioxygenase (TDO, toluene), at biphenyl dioxygenase (BPDO, biphenyl). Kayang i-catalyze ng NDO at BPDO ang double oxidation at side chain hydroxylation ng iba't ibang polycyclic aromatic hydrocarbons (toluene, nitrotoluene, xylene, ethylbenzene, naphthalene, biphenyl, fluorene, indole, methylnaphthalene, naphthalenesulfonate, phenanthrene, anthracene, acetophenone, atbp.) (Boyd at Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). Ang NDO ay isang multicomponent system na binubuo ng isang oxidoreductase, isang ferredoxin, at isang active site-containing oxygenase component (Gibson at Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Ang catalytic unit ng NDO ay binubuo ng isang malaking α subunit at isang maliit na β subunit na nakaayos sa isang α3β3 configuration. Ang NDO ay kabilang sa isang malaking pamilya ng mga oxygenase at ang α-subunit nito ay naglalaman ng isang Rieske site [2Fe-2S] at isang mononuclear non-heme iron, na siyang tumutukoy sa substrate specificity ng NDO (Parales et al., 1998). Kadalasan, sa isang catalytic cycle, dalawang electron mula sa reduction ng pyridine nucleotide ang inililipat sa Fe(II) ion sa active site sa pamamagitan ng isang reductase, isang ferredoxin at isang Rieske site. Ang mga reducing equivalents ay nagpapagana ng molecular oxygen, na isang paunang kinakailangan para sa substrate dihydroxylation (Ferraro et al., 2005). Sa ngayon, iilang NDO pa lamang ang na-purify at na-characterize nang detalyado mula sa iba't ibang strain at ang genetic control ng mga pathway na kasangkot sa naphthalene degradation ay napag-aralan nang detalyado (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Ang mga ring-cleaving dioxygenases (endo- o ortho-ring-cleaving enzymes at exodiol- o meta-ring-cleaving enzymes) ay kumikilos sa mga hydroxylated aromatic compound. Halimbawa, ang ortho-ring-cleaving dioxygenase ay catechol-1,2-dioxygenase, samantalang ang meta-ring-cleaving dioxygenase ay catechol-2,3-dioxygenase (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Bukod sa iba't ibang oxygenases, mayroon ding iba't ibang dehydrogenases na responsable para sa dehydrogenation ng mga aromatic dihydrodiols, alcohols at aldehydes at paggamit ng NAD+/NADP+ bilang mga electron acceptor, na ilan sa mahahalagang enzyme na kasangkot sa metabolismo (Gibson at Subramanian, 1984; Shaw at Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Ang mga enzyme tulad ng hydrolases (esterases, amidase) ay pangalawang mahalagang uri ng mga enzyme na gumagamit ng tubig upang hatiin ang mga covalent bond at magpakita ng malawak na substrate specificity. Ang Carbaryl hydrolase at iba pang mga hydrolases ay itinuturing na mga bahagi ng periplasm (transmembrane) sa mga miyembro ng Gram-negative bacteria (Kamini et al., 2018). Ang Carbaryl ay may parehong amide at ester linkage; samakatuwid, maaari itong i-hydrolyze ng alinman sa esterase o amidase upang bumuo ng 1-naphthol. Ang Carbaryl sa Rhizobium rhizobium strain AC10023 at Arthrobacter strain RC100 ay naiulat na gumagana bilang isang esterase at amidase, ayon sa pagkakabanggit. Ang Carbaryl sa Arthrobacter strain RC100 ay gumagana rin bilang isang amidase. Ang RC100 ay naipakita na nag-hydrolyze ng apat na N-methylcarbamate class insecticide tulad ng carbaryl, methomyl, mefenamic acid at XMC (Hayaatsu et al., 2001). Naiulat na ang CH sa Pseudomonas sp. C5pp ay maaaring kumilos sa carbaryl (100% na aktibidad) at 1-naphthyl acetate (36% na aktibidad), ngunit hindi sa 1-naphthylacetamide, na nagpapahiwatig na ito ay isang esterase (Trivedi et al., 2016).
Ipinakita ng mga pag-aaral sa biokemikal, mga pattern ng regulasyon ng enzyme, at pagsusuring henetiko na ang mga gene ng naphthalene degradation ay binubuo ng dalawang inducible regulatory unit o "operons": nah (ang "upstream pathway", na nagko-convert ng naphthalene sa salicylic acid) at sal (ang "downstream pathway", na nagko-convert ng salicylic acid sa central carbon pathway sa pamamagitan ng catechol). Ang salicylic acid at ang mga analogue nito ay maaaring kumilos bilang mga inducers (Shamsuzzaman at Barnsley, 1974). Sa presensya ng glucose o mga organic acid, ang operon ay napipigilan. Ipinapakita ng Figure 5 ang kumpletong genetic organization ng naphthalene degradation (sa anyong operon). Ilang pinangalanang variant/anyo ng nah gene (ndo/pah/dox) ang nailarawan at natagpuang may mataas na sequence homology (90%) sa lahat ng uri ng Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Ang mga gene ng naphthalene upstream pathway ay karaniwang nakaayos sa isang consensus order gaya ng ipinapakita sa Figure 5A. Isa pang gene, ang nahQ, ay naiulat din na kasangkot sa metabolismo ng naphthalene at karaniwang matatagpuan sa pagitan ng nahC at nahE, ngunit ang aktwal na tungkulin nito ay kailangan pang linawin. Gayundin, ang nahY gene, na responsable para sa naphthalene-sensitive chemotaxis, ay natagpuan sa distal na dulo ng nah operon sa ilang miyembro. Sa Ralstonia sp., ang U2 gene na nagko-code ng glutathione S-transferase (gsh) ay natagpuang matatagpuan sa pagitan ng nahAa at nahAb ngunit hindi nakakaapekto sa mga katangian ng paggamit ng naphthalene (Zylstra et al., 1997).
Pigura 5. Organisasyong henetiko at pagkakaiba-iba na naobserbahan sa panahon ng degradasyon ng naphthalene sa mga uri ng bacterial; (A) Itaas na landas ng naphthalene, metabolismo ng naphthalene tungo sa salicylic acid; (B) Ibabang landas ng naphthalene, salicylic acid sa pamamagitan ng catechol patungo sa gitnang landas ng carbon; (C) salicylic acid sa pamamagitan ng gentisate patungo sa gitnang landas ng carbon.
Ang "ibabang landas" (sal operon) ay karaniwang binubuo ng nahGTHINLMOKJ at kino-convert ang salicylate sa pyruvate at acetaldehyde sa pamamagitan ng catechol metaring cleavage pathway. Ang nahG gene (encoding salicylate hydroxylase) ay natagpuang na-conserve sa proximal end ng operon (Fig. 5B). Kung ikukumpara sa iba pang mga strain na nakakasira ng naphthalene, sa P. putida CSV86, ang nah at sal operons ay tandem at magkaugnay (mga 7.5 kb). Sa ilang Gram-negative bacteria, tulad ng Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2, at P. putida AK5, ang naphthalene ay na-metabolize bilang isang central carbon metabolite sa pamamagitan ng gentisate pathway (sa anyo ng sgp/nag operon). Ang gene cassette ay karaniwang kinakatawan sa anyong nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, kung saan ang nagR (nagko-code ng isang LysR-type regulator) ay matatagpuan sa itaas na dulo (Larawan 5C).
Ang Carbaryl ay pumapasok sa central carbon cycle sa pamamagitan ng metabolismo ng 1-naphthol, 1,2-dihydroxynaphthalene, salicylic acid, at gentisic acid (Larawan 3). Batay sa mga pag-aaral sa henetiko at metabolismo, iminungkahi na hatiin ang pathway na ito sa "upstream" (pagbabago ng carbaryl sa salicylic acid), "middle" (pagbabago ng salicylic acid sa gentisic acid), at "downstream" (pagbabago ng gentisic acid sa mga central carbon pathway intermediates) (Singh et al., 2013). Ipinakita ng genomic analysis ng C5pp (supercontig A, 76.3 kb) na ang mcbACBDEF gene ay kasangkot sa conversion ng carbaryl tungo sa salicylic acid, na sinusundan ng mcbIJKL sa conversion ng salicylic acid tungo sa gentisic acid, at mcbOQP sa conversion ng gentisic acid tungo sa central carbon intermediates (fumarate at pyruvate, Trivedi et al., 2016) (Figure 6).
Naiulat na ang mga enzyme na sangkot sa pagkasira ng mga aromatic hydrocarbon (kabilang ang naphthalene at salicylic acid) ay maaaring ma-induce ng mga kaukulang compound at mapigilan ng mga simpleng pinagmumulan ng carbon tulad ng glucose o mga organic acid (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Sa iba't ibang metabolic pathway ng naphthalene at mga derivatives nito, ang mga regulatory feature ng naphthalene at carbaryl ay pinag-aralan na sa ilang antas. Para sa naphthalene, ang mga gene sa parehong upstream at downstream pathways ay kinokontrol ng NahR, isang LysR-type trans-acting positive regulator. Kinakailangan ito para sa induction ng nah gene ng salicylic acid at ang kasunod nitong high-level expression (Yen at Gunsalus, 1982). Bukod pa rito, ipinakita ng mga pag-aaral na ang integrative host factor (IHF) at XylR (sigma 54-dependent transcriptional regulator) ay kritikal din para sa transcriptional activation ng mga gene sa naphthalene metabolism (Ramos et al., 1997). Ipinakita ng mga pag-aaral na ang mga enzyme ng catechol meta-ring opening pathway, katulad ng catechol 2,3-dioxygenase, ay na-induce sa presensya ng naphthalene at/o salicylic acid (Basu et al., 2006). Ipinakita ng mga pag-aaral na ang mga enzyme ng catechol ortho-ring opening pathway, katulad ng catechol 1,2-dioxygenase, ay na-induce sa presensya ng benzoic acid at cis,cis-muconate (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Sa strain na C5pp, limang gene, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR at mcbS, ang nagko-code ng mga regulator na kabilang sa pamilyang LysR/TetR ng mga transcriptional regulator na responsable sa pagkontrol sa carbaryl degradation. Ang homologous gene na mcbG ay natagpuang pinakamalapit na nauugnay sa LysR-type regulator na PhnS (58% amino acid identity) na kasangkot sa metabolismo ng phenanthrene sa Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Ang mcbH gene ay natagpuang kasangkot sa intermediate pathway (conversion ng salicylic acid sa gentisic acid) at kabilang sa LysR-type transcriptional regulator na NagR/DntR/NahR sa Pseudomonas at Burkholderia. Ang mga miyembro ng pamilyang ito ay naiulat na kumikilala sa salicylic acid bilang isang partikular na effector molecule para sa induction ng mga degradation gene. Sa kabilang banda, tatlong gene, mcbN, mcbR at mcbS, na kabilang sa mga transcriptional regulator na uri ng LysR at TetR, ang natukoy sa downstream pathway (mga metabolite ng gentisate-central carbon pathway).
Sa mga prokaryote, ang mga proseso ng pahalang na paglilipat ng gene (pagkuha, pagpapalitan, o paglilipat) sa pamamagitan ng mga plasmid, transposon, prophage, genomic island, at integrative conjugative elements (ICE) ay mga pangunahing sanhi ng plasticity sa mga bacterial genome, na humahantong sa pagkakaroon o pagkawala ng mga partikular na function/katangian. Pinapayagan nito ang bacteria na mabilis na umangkop sa iba't ibang kondisyon sa kapaligiran, na nagbibigay ng mga potensyal na adaptive metabolic advantage sa host, tulad ng degradation ng mga aromatic compound. Ang mga pagbabago sa metabolic ay kadalasang nakakamit sa pamamagitan ng fine-tuning ng mga degradation operon, ang kanilang mga regulatory mechanism, at mga enzyme specificity, na nagpapadali sa degradation ng mas malawak na hanay ng mga aromatic compound (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Ang mga gene cassette para sa naphthalene degradation ay natagpuang matatagpuan sa iba't ibang mobile elements tulad ng mga plasmid (conjugative at non-conjugative), transposon, genome, ICE, at mga kumbinasyon ng iba't ibang bacterial species (Figure 5). Sa Pseudomonas G7, ang mga nah at sal operon ng plasmid na NAH7 ay na-transcribe sa parehong oryentasyon at bahagi ng isang depektibong transposon na nangangailangan ng transposase Tn4653 para sa mobilisasyon (Sota et al., 2006). Sa Pseudomonas strain NCIB9816-4, ang gene ay natagpuan sa conjugative plasmid pDTG1 bilang dalawang operon (humigit-kumulang 15 kb ang layo) na na-transcribe sa magkasalungat na direksyon (Dennis at Zylstra, 2004). Sa Pseudomonas putida strain AK5, ang non-conjugative plasmid pAK5 ay nagko-code sa enzyme na responsable para sa naphthalene degradation sa pamamagitan ng gentisate pathway (Izmalkova et al., 2013). Sa Pseudomonas strain PMD-1, ang nah operon ay matatagpuan sa chromosome, samantalang ang sal operon ay matatagpuan sa conjugative plasmid pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Gayunpaman, sa Pseudomonas stutzeri AN10, lahat ng naphthalene degradation genes (nah at sal operons) ay matatagpuan sa chromosome at ipinapalagay na nare-recruit sa pamamagitan ng transposition, recombination, at rearrangement events (Bosch et al., 2000). Sa Pseudomonas sp. CSV86, ang nah at sal operons ay matatagpuan sa genome sa anyo ng ICE (ICECSV86). Ang istruktura ay pinoprotektahan ng tRNAGly na sinusundan ng mga direktang pag-uulit na nagpapahiwatig ng mga recombination/attachment site (attR at attL) at isang phage-like integrase na matatagpuan sa magkabilang dulo ng tRNAGly, kaya naman sa istruktura ay katulad ng elementong ICEclc (ICEclcB13 sa Pseudomonas knackmusii para sa chlorocatechol degradation). Naiulat na ang mga gene sa ICE ay maaaring mailipat sa pamamagitan ng conjugation na may napakababang transfer frequency (10-8), sa gayon ay inililipat ang mga katangian ng degradation sa tatanggap (Basu at Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Karamihan sa mga gene na responsable para sa carbaryl degradation ay matatagpuan sa mga plasmid. Ang Arthrobacter sp. RC100 ay naglalaman ng tatlong plasmid (pRC1, pRC2 at pRC300) kung saan ang dalawang conjugative plasmid, pRC1 at pRC2, ay nagko-code ng mga enzyme na nagko-convert ng carbaryl sa gentisate. Sa kabilang banda, ang mga enzyme na kasangkot sa conversion ng gentisate sa mga central carbon metabolite ay matatagpuan sa chromosome (Hayaatsu et al., 1999). Ang bacteria ng genus na Rhizobium. Ang strain AC100, na ginagamit para sa conversion ng carbaryl sa 1-naphthol, ay naglalaman ng plasmid na pAC200, na nagdadala ng cehA gene na nagko-code ng CH bilang bahagi ng Tnceh transposon na napapalibutan ng mga insertion element-like sequences (istA at istB) (Hashimoto et al., 2002). Sa Sphingomonas strain CF06, ang carbaryl degradation gene ay pinaniniwalaang naroroon sa limang plasmid: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04, at pCF05. Mataas ang DNA homology ng mga plasmid na ito, na nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng isang gene duplication event (Feng et al., 1997). Sa isang carbaryl-degrading symbiont na binubuo ng dalawang Pseudomonas species, ang strain 50581 ay naglalaman ng isang conjugative plasmid na pCD1 (50 kb) na nagko-code ng mcd carbaryl hydrolase gene, samantalang ang conjugative plasmid sa strain 50552 ay nagko-code ng isang 1-naphthol-degrading enzyme (Chapalamadugu at Chaudhry, 1991). Sa Achromobacter strain WM111, ang mcd furadan hydrolase gene ay matatagpuan sa isang 100 kb plasmid (pPDL11). Ang gene na ito ay naipakita na naroroon sa iba't ibang plasmid (100, 105, 115 o 124 kb) sa iba't ibang bacteria mula sa iba't ibang rehiyong heograpikal (Parekh et al., 1995). Sa Pseudomonas sp. C5pp, lahat ng gene na responsable para sa carbaryl degradation ay matatagpuan sa isang genome na sumasaklaw sa 76.3 kb ng sequence (Trivedi et al., 2016). Ang pagsusuri ng genome (6.15 Mb) ay nagsiwalat ng presensya ng 42 MGE at 36 GEI, kung saan 17 MGE ang matatagpuan sa supercontig A (76.3 kb) na may average na asymmetric G+C content (54–60 mol%), na nagmumungkahi ng mga posibleng horizontal gene transfer events (Trivedi et al., 2016). Ang P. putida XWY-1 ay nagpapakita ng katulad na pagkakaayos ng mga carbaryl-degrading gene, ngunit ang mga gene na ito ay matatagpuan sa isang plasmid (Zhu et al., 2019).
Bukod sa kahusayan sa metabolismo sa antas ng biokemikal at genomiko, ang mga mikroorganismo ay nagpapakita rin ng iba pang mga katangian o tugon tulad ng chemotaxis, mga katangian ng pagbabago sa ibabaw ng selula, compartmentalization, preferential utilization, produksyon ng biosurfactant, atbp., na tumutulong sa kanila na mas mahusay na i-metabolize ang mga aromatic pollutant sa mga kontaminadong kapaligiran (Larawan 7).
Pigura 7. Iba't ibang estratehiya sa pagtugon ng selula ng mainam na aromatic hydrocarbon-degrading bacteria para sa mahusay na biodegradation ng mga dayuhang compound ng pollutant.
Ang mga tugon na kemotactic ay itinuturing na mga salik na nagpapataas ng pagkasira ng mga organikong pollutant sa mga heterogeneously polluted ecosystem. Ipinakita ni (2002) na ang chemotaxis ng Pseudomonas sp. G7 sa naphthalene ay nagpataas ng rate ng naphthalene degradation sa mga aquatic system. Ang wild-type strain na G7 ay mas mabilis na nag-degrade ng naphthalene kaysa sa isang chemotaxis-deficient mutant strain. Ang NahY protein (538 amino acids na may membrane topology) ay natagpuang co-transcribed sa mga metacleavage pathway genes sa NAH7 plasmid, at tulad ng mga chemotaxis transducers, ang protina na ito ay tila gumagana bilang isang chemoreceptor para sa naphthalene degradation (Grimm at Harwood 1997). Isa pang pag-aaral ni Hansel et al. (2009) ay nagpakita na ang protina ay chemotactic, ngunit ang rate ng degradation nito ay mataas. (2011) ay nagpakita ng chemotactic response ng Pseudomonas (P. putida) sa gaseous naphthalene, kung saan ang gas phase diffusion ay nagresulta sa isang matatag na daloy ng naphthalene patungo sa mga selula, na kumokontrol sa chemotactic response ng mga selula. Sinamantala ng mga mananaliksik ang chemotactic behavior na ito upang mag-engineer ng mga mikrobyo na magpapahusay sa rate ng degradation. Ipinakita ng mga pag-aaral na ang mga chemosensory pathway ay kumokontrol din sa iba pang mga function ng cellular tulad ng cell division, cell cycle regulation, at biofilm formation, sa gayon ay nakakatulong upang makontrol ang rate ng degradation. Gayunpaman, ang paggamit ng katangiang ito (chemotaxis) para sa mahusay na degradation ay nahahadlangan ng ilang mga bottleneck. Ang mga pangunahing balakid ay: (a) ang iba't ibang paralogous receptor ay kumikilala sa parehong mga compound/ligand; (b) pagkakaroon ng mga alternatibong receptor, i.e., energetic tropism; (c) makabuluhang pagkakaiba sa sequence sa sensory domains ng parehong pamilya ng receptor; at (d) kakulangan ng impormasyon sa mga pangunahing bacterial sensor protein (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Minsan, ang biodegradation ng mga aromatic hydrocarbon ay nagbubunga ng maraming metabolite/intermediate, na maaaring chemotactic para sa isang grupo ng bacteria ngunit nakakasuklam para sa iba, na lalong nagpapakomplikado sa proseso. Upang matukoy ang mga interaksyon ng mga ligand (aromatic hydrocarbons) sa mga chemical receptor, bumuo kami ng mga hybrid sensor protein (PcaY, McfR, at NahY) sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng sensor at signaling domain ng Pseudomonas putida at Escherichia coli, na nagta-target sa mga receptor para sa mga aromatic acid, TCA intermediate, at naphthalene, ayon sa pagkakabanggit (Luu et al., 2019).
Sa ilalim ng impluwensya ng naphthalene at iba pang polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), ang istruktura ng bacterial membrane at ang integridad ng mga mikroorganismo ay sumasailalim sa mga makabuluhang pagbabago. Ipinakita ng mga pag-aaral na ang naphthalene ay nakakasagabal sa interaksyon ng acyl chain sa pamamagitan ng hydrophobic interactions, sa gayon ay pinapataas ang pamamaga at fluidity ng membrane (Sikkema et al., 1995). Upang malabanan ang nakapipinsalang epektong ito, kinokontrol ng bacteria ang membrane fluidity sa pamamagitan ng pagbabago ng ratio at fatty acid composition sa pagitan ng iso/anteiso branched-chain fatty acids at isomerizing cis-unsaturated fatty acids tungo sa kaukulang trans-isomers (Heipieper at de Bont, 1994). Sa Pseudomonas stutzeri na lumaki sa paggamot ng naphthalene, ang saturated to unsaturated fatty acid ratio ay tumaas mula 1.1 hanggang 2.1, samantalang sa Pseudomonas JS150 ang ratio na ito ay tumaas mula 7.5 hanggang 12.0 (Mrozik et al., 2004). Kapag pinatubo sa naphthalene, ang mga selula ng Achromobacter KAs 3–5 ay nagpakita ng pagsasama-sama ng selula sa paligid ng mga kristal ng naphthalene at pagbaba ng karga sa ibabaw ng selula (mula -22.5 hanggang -2.5 mV) na sinamahan ng cytoplasmic condensation at vacuolization, na nagpapahiwatig ng mga pagbabago sa istruktura ng selula at mga katangian ng ibabaw ng selula (Mohapatra et al., 2019). Bagama't ang mga pagbabago sa selula/ibabaw ay direktang nauugnay sa mas mahusay na pagsipsip ng mga aromatic pollutant, ang mga kaugnay na estratehiya sa bioengineering ay hindi pa lubusang na-optimize. Ang manipulasyon ng hugis ng selula ay bihirang gamitin upang ma-optimize ang mga prosesong biyolohikal (Volke at Nikel, 2018). Ang pagtanggal ng mga gene na nakakaapekto sa paghahati ng selula ay nagdudulot ng mga pagbabago sa morpolohiya ng selula. Ang pagtanggal ng mga gene na nakakaapekto sa paghahati ng selula ay nagdudulot ng mga pagbabago sa morpolohiya ng selula. Sa Bacillus subtilis, ang protina ng septum ng selula na SepF ay naipakita na kasangkot sa pagbuo ng septum at kinakailangan para sa mga kasunod na hakbang ng paghahati ng selula, ngunit hindi ito isang mahalagang gene. Ang pagtanggal ng mga gene na nagko-code ng peptide glycan hydrolases sa Bacillus subtilis ay nagresulta sa paghaba ng selula, pagtaas ng specific growth rate, at pagbuti ng kapasidad sa produksyon ng enzyme (Cui et al., 2018).
Ang paghihiwalay ng carbaryl degradation pathway ay iminungkahi upang makamit ang mahusay na degradasyon ng mga strain ng Pseudomonas na C5pp at C7 (Kamini et al., 2018). Iminumungkahi na ang carbaryl ay dinadala papunta sa periplasmic space sa pamamagitan ng outer membrane septum at/o sa pamamagitan ng diffusible porins. Ang CH ay isang periplasmic enzyme na nagpapabilis sa hydrolysis ng carbaryl sa 1-naphthol, na mas matatag, mas hydrophobic at mas nakakalason. Ang CH ay matatagpuan sa periplasm at may mababang affinity para sa carbaryl, kaya kinokontrol ang pagbuo ng 1-naphthol, kaya pinipigilan ang akumulasyon nito sa mga selula at binabawasan ang toxicity nito sa mga selula (Kamini et al., 2018). Ang nagresultang 1-naphthol ay dinadala papunta sa cytoplasm sa pamamagitan ng inner membrane sa pamamagitan ng paghahati at/o diffusion, at pagkatapos ay hydroxylated sa 1,2-dihydroxynaphthalene ng high-affinity enzyme na 1NH para sa karagdagang metabolismo sa central carbon pathway.
Bagama't ang mga mikroorganismo ay may kakayahang henetiko at metaboliko na sirain ang mga xenobiotic carbon sources, ang hierarchical structure ng kanilang paggamit (ibig sabihin, ang mas pinipiling paggamit ng simple kaysa sa complex carbon sources) ay isang pangunahing balakid sa biodegradation. Ang presensya at paggamit ng mga simpleng carbon sources ay nagpapababa sa mga genes na nagko-code ng mga enzyme na nagpapababa sa mga complex/hindi ginustong carbon sources tulad ng mga PAH. Isang halimbawa na pinag-aralan nang mabuti ay kapag ang glucose at lactose ay pinagsama sa Escherichia coli, ang glucose ay mas mahusay na ginagamit kaysa sa lactose (Jacob at Monod, 1965). Naiulat na ang Pseudomonas ay nagpapababa ng iba't ibang PAH at xenobiotic compounds bilang carbon sources. Ang hierarchy ng paggamit ng carbon source sa Pseudomonas ay organic acids > glucose > aromatic compounds (Hylemon at Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Gayunpaman, mayroong isang eksepsiyon. Kapansin-pansin, ang Pseudomonas sp. Ang CSV86 ay nagpapakita ng kakaibang hierarchical structure na mas pinipiling gamitin ang mga aromatic hydrocarbon (benzoic acid, naphthalene, atbp.) sa halip na glucose at co-metabolize ang mga aromatic hydrocarbon na may mga organic acid (Basu et al., 2006). Sa bacterium na ito, ang mga gene para sa degradation at transportasyon ng mga aromatic hydrocarbon ay hindi nababawasan kahit na sa presensya ng pangalawang pinagmumulan ng carbon tulad ng glucose o mga organic acid. Nang lumaki sa medium ng glucose at aromatic hydrocarbons, naobserbahan na ang mga gene para sa transportasyon at metabolismo ng glucose ay nababawasan, ang mga aromatic hydrocarbon ay ginamit sa unang log phase, at ang glucose ay ginamit sa pangalawang log phase (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Sa kabilang banda, ang presensya ng mga organic acid ay hindi nakaapekto sa ekspresyon ng aromatic hydrocarbon metabolism, kaya ang bacterium na ito ay inaasahang magiging isang kandidatong strain para sa mga pag-aaral ng biodegradation (Phale et al., 2020).
Kilalang-kilala na ang hydrocarbon biotransformation ay maaaring magdulot ng oxidative stress at upregulation ng antioxidant enzymes sa mga mikroorganismo. Ang hindi episyenteng naphthalene biodegradation kapwa sa mga stationary phase cells at sa presensya ng mga nakalalasong compound ay humahantong sa pagbuo ng reactive oxygen species (ROS) (Kang et al. 2006). Dahil ang naphthalene-degrading enzymes ay naglalaman ng mga iron-sulfur cluster, sa ilalim ng oxidative stress, ang iron sa heme at iron-sulfur proteins ay mao-oxidize, na hahantong sa protein inactivation. Ang Ferredoxin-NADP+ reductase (Fpr), kasama ang superoxide dismutase (SOD), ay namamagitan sa reversible redox reaction sa pagitan ng NADP+/NADPH at dalawang molekula ng ferredoxin o flavodoxin, sa gayon ay inaalis ang ROS at pinapanumbalik ang iron-sulfur center sa ilalim ng oxidative stress (Li et al. 2006). Naiulat na ang parehong Fpr at SodA (SOD) sa Pseudomonas ay maaaring ma-induce ng oxidative stress, at ang pagtaas ng aktibidad ng SOD at catalase ay naobserbahan sa apat na strain ng Pseudomonas (O1, W1, As1, at G1) habang lumalaki sa ilalim ng mga kondisyong idinagdag ang naphthalene (Kang et al., 2006). Ipinakita ng mga pag-aaral na ang pagdaragdag ng mga antioxidant tulad ng ascorbic acid o ferrous iron (Fe2+) ay maaaring magpataas ng rate ng paglago ng naphthalene. Nang lumaki ang Rhodococcus erythropolis sa naphthalene medium, ang transkripsyon ng mga gene na may kaugnayan sa oxidative stress na cytochrome P450 kabilang ang sodA (Fe/Mn superoxide dismutase), sodC (Cu/Zn superoxide dismutase), at recA ay tumaas (Sazykin et al., 2019). Ang paghahambing na dami ng proteomic analysis ng mga selulang Pseudomonas na kinultura sa naphthalene ay nagpakita na ang pagtaas ng iba't ibang protina na nauugnay sa tugon sa oxidative stress ay isang estratehiya sa pagharap sa stress (Herbst et al., 2013).
May mga naiulat na mikroorganismo na nakakagawa ng mga biosurfactant sa ilalim ng aksyon ng mga hydrophobic carbon source. Ang mga surfactant na ito ay mga amphiphilic surface active compound na maaaring bumuo ng mga aggregate sa oil-water o air-water interface. Itinataguyod nito ang pseudo-solubilization at pinapadali ang adsorption ng mga aromatic hydrocarbon, na nagreresulta sa mahusay na biodegradation (Rahman et al., 2002). Dahil sa mga katangiang ito, ang mga biosurfactant ay malawakang ginagamit sa iba't ibang industriya. Ang pagdaragdag ng mga kemikal na surfactant o biosurfactant sa mga bacterial culture ay maaaring mapahusay ang kahusayan at bilis ng hydrocarbon degradation. Sa mga biosurfactant, ang mga rhamnolipid na ginawa ng Pseudomonas aeruginosa ay malawakang pinag-aralan at nailalarawan (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Bukod pa rito, kabilang sa iba pang uri ng biosurfactants ang mga lipopeptides (mga mucin mula sa Pseudomonas fluorescens), emulsifier 378 (mula sa Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg at Ron, 1999), trehalose disaccharide lipids mula sa Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenin mula sa Bacillus (Saraswathy at Hallberg, 2002), at surfactant mula sa Bacillus subtilis (Siegmund at Wagner, 1991) at Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Ang mga malalakas na surfactant na ito ay naipakita na nakakabawas sa surface tension mula 72 dynes/cm hanggang sa mas mababa sa 30 dynes/cm, na nagbibigay-daan para sa mas mahusay na pagsipsip ng hydrocarbon. Naiulat na ang Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia at iba pang uri ng bacteria ay maaaring makagawa ng iba't ibang rhamnolipid at glycolipid-based biosurfactants kapag pinatubo sa naphthalene at methylnaphthalene media (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Ang Pseudomonas maltophilia CSV89 ay maaaring makagawa ng extracellular biosurfactant na Biosur-Pm kapag pinatubo sa mga aromatic compound tulad ng naphthoic acid (Phale et al., 1995). Ang kinetics ng pagbuo ng Biosur-Pm ay nagpakita na ang synthesis nito ay isang prosesong nakadepende sa paglago at pH. Natuklasan na ang dami ng Biosur-Pm na nalilikha ng mga selula sa neutral na pH ay mas mataas kaysa sa pH 8.5. Ang mga selulang lumaki sa pH 8.5 ay mas hydrophobic at may mas mataas na affinity para sa mga aromatic at aliphatic compound kaysa sa mga selulang lumaki sa pH 7.0. Sa Rhodococcus spp. Ang N6, mas mataas na ratio ng carbon sa nitrogen (C:N) at limitasyon ng iron ay mga pinakamainam na kondisyon para sa produksyon ng mga extracellular biosurfactant (Mutalik et al., 2008). May mga pagtatangka nang ginawa upang mapabuti ang biosynthesis ng mga biosurfactant (surfactin) sa pamamagitan ng pag-optimize ng mga strain at fermentation. Gayunpaman, ang titer ng surfactant sa culture medium ay mababa (1.0 g/L), na nagdudulot ng hamon para sa malawakang produksyon (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Samakatuwid, ginamit ang mga pamamaraan ng genetic engineering upang mapabuti ang biosynthesis nito. Gayunpaman, ang pagbabago sa engineering nito ay mahirap dahil sa malaking sukat ng operon (∼25 kb) at kumplikadong biosynthetic regulation ng quorum sensing system (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Maraming mga pagbabago sa genetic engineering ang naisagawa sa bakteryang Bacillus, na pangunahing naglalayong pataasin ang produksyon ng surfactin sa pamamagitan ng pagpapalit ng promoter (srfA operon), labis na pagpapahayag ng surfactin export protein na YerP at ng mga regulatory factor na ComX at PhrC (Jiao et al., 2017). Gayunpaman, ang mga pamamaraang ito sa genetic engineering ay nakakamit lamang ng isa o ilang mga pagbabago sa genetic at hindi pa umaabot sa komersyal na produksyon. Samakatuwid, kinakailangan ang karagdagang pag-aaral ng mga pamamaraan ng pag-optimize batay sa kaalaman.
Ang mga pag-aaral sa biodegradation ng PAH ay pangunahing isinasagawa sa ilalim ng mga karaniwang kondisyon sa laboratoryo. Gayunpaman, sa mga kontaminadong lugar o sa mga kontaminadong kapaligiran, maraming abiotic at biotic na salik (temperatura, pH, oxygen, pagkakaroon ng sustansya, bioavailability ng substrate, iba pang xenobiotics, pagpigil sa end-product, atbp.) ang naipakita na nagpapabago at nakakaimpluwensya sa kapasidad ng mga mikroorganismo sa pagkasira.
Ang temperatura ay may malaking epekto sa biodegradation ng PAH. Habang tumataas ang temperatura, bumababa ang konsentrasyon ng dissolved oxygen, na nakakaapekto sa metabolismo ng mga aerobic microorganism, dahil nangangailangan sila ng molecular oxygen bilang isa sa mga substrate para sa mga oxygenase na nagsasagawa ng hydroxylation o ring cleavage reactions. Madalas na napapansin na ang mataas na temperatura ay nagko-convert sa mga parent PAH tungo sa mas nakalalasong compound, sa gayon ay pinipigilan ang biodegradation (Muller et al., 1998).
Napansin na maraming lugar na kontaminado ng PAH ang may matinding pH values, tulad ng mga lugar na kontaminado ng acid mine drainage (pH 1–4) at mga lugar na pinagagana ng natural gas/coal gasification na kontaminado ng alkaline leachate (pH 8–12). Ang mga kondisyong ito ay maaaring malubhang makaapekto sa proseso ng biodegradation. Samakatuwid, bago gamitin ang mga mikroorganismo para sa bioremediation, inirerekomenda na ayusin ang pH sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga angkop na kemikal (na may katamtaman hanggang napakababang potensyal na oxidation-reduction) tulad ng ammonium sulfate o ammonium nitrate para sa mga alkaline na lupa o paglalagay ng liming gamit ang calcium carbonate o magnesium carbonate para sa mga acidic na lugar (Bowlen et al. 1995; Gupta at Sar 2020).
Ang suplay ng oksiheno sa apektadong lugar ang siyang salik na naglilimita sa bilis ng biodegradation ng PAH. Dahil sa mga kondisyon ng redox ng kapaligiran, ang mga proseso ng in situ bioremediation ay karaniwang nangangailangan ng pagpapakilala ng oksiheno mula sa mga panlabas na pinagmumulan (pag-aararo, pagpapatuyo ng hangin, at pagdaragdag ng kemikal) (Pardieck et al., 1992). Ipinakita ni Odenkranz et al. (1996) na ang pagdaragdag ng magnesium peroxide (isang compound na naglalabas ng oksiheno) sa isang kontaminadong aquifer ay maaaring epektibong makapag-bioremediate ng mga compound ng BTEX. Sinuri ng isa pang pag-aaral ang in situ degradation ng phenol at BTEX sa isang kontaminadong aquifer sa pamamagitan ng pag-iniksyon ng sodium nitrate at paggawa ng mga extraction well upang makamit ang epektibong bioremediation (Bewley at Webb, 2001).