Kasalukuyan†Kasalukuyang address: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Ang reaction center light-harvesting complex 1 (RC-LH1) ay ang pangunahing photosynthetic component ng purple phototrophic bacteria. Ipinakilala namin ang dalawang cryo-electron microscopy structures ng RC-LH1 complex mula sa Rhodopseudomonas palustris. Ang 2.65-Å resolution structure ng RC-LH114-W complex ay binubuo ng 14 na subunit LH1 loops na nakapalibot sa RC, na napuputol ng protein W, habang ang complex na walang protein-W ay ganap na RC composition na napapalibutan ng RC. Sarado ang 16 subunit LH1 loop. Ang paghahambing ng mga istrukturang ito ay nagbibigay ng mga pananaw sa dinamika ng quinone sa RC-LH1 complex, kabilang ang mga dati nang hindi natukoy na mga pagbabago sa conformational kapag nagbubuklod ng quinone sa RC QB site, pati na rin ang lokasyon ng mga auxiliary quinone binding sites, na tumutulong sa pagpasa ng mga ito sa RC. Ang natatanging istraktura ng W protein ay pumipigil sa pagsasara ng LH1 loop, sa gayon ay lumilikha ng isang channel para sa pagpapabilis ng quinone/quinolone exchange.
Ang enerhiyang ibinibigay ng photosynthesis ay kayang suportahan ang halos lahat ng buhay sa mundo, at mayroon itong malaking potensyal para sa solar biotechnology. Habang itinataguyod ang pandaigdigang photosynthesis, ang mga lilang phototrophic bacteria ay nagpapakita rin ng iba't ibang mga paraan ng enerhiya at mga kakayahan sa metabolismo. Maaari nilang maiwasan ang photosynthesis at lumaki bilang mga heterotrophic bacteria sa dilim, maaaring mag-ayos ng nitrogen at carbon dioxide, gumawa ng hydrogen, at sirain ang mga aromatic compound (1-3). Upang makapagbigay ng enerhiya para sa mga prosesong ito, ang liwanag ay dapat na mabilis at mahusay na ma-convert sa enerhiyang kemikal. Nagsisimula ang prosesong ito kapag ang light-trapping antenna complex ay sumisipsip ng liwanag at inililipat ang nakulong na enerhiya sa reaction center (RC), sa gayon ay nagsisimula ang paghihiwalay ng charge (4-7). Ang pangunahing yunit ng photosynthesis sa lilang phototrophic bacteria ay binubuo ng type 2 RC, na napapalibutan ng light-harvesting complex 1 (LH1), na bumubuo sa RC-LH1 core complex. Ang LH1 ay nabuo ng isang hanay ng mga kurbadong αβ heterodimer, na ang bawat isa ay nagbubuklod ng dalawang bacterial chlorophyll (BChl) a molecule at isa o dalawang carotenoid (8-12). Ang pinakasimpleng LH1 antenna ay binubuo ng 16 o 17 αβ heterodimers na nakapalibot sa RC (9-13) sa isang closed loop, ngunit sa iba pang core complexes, ang mga transmembrane peptide ay nakakagambala sa continuity ng nakapalibot na LH1, Sa gayon ay nagtataguyod ng quinol/quinone diffusion sa pagitan ng RC at cytochrome bc1 complex (11, 13-15). Ang purple phototrophic plant na Rhodopseudomonas (Rps.) ay isang model organism na nakakaintindi sa enerhiya at electron transfer na sumusuporta sa photosynthesis. Ang unang crystal structure ng Rps. Ang modelo ng palustris RC-LH1 complex ay RC, na napapalibutan ng 15 heterodimeric LH1 loops, na naputol ng isang hindi kilalang protina na tinatawag na "Protein W" (14). Ang Protein-W ay kalaunan ay nakilala bilang RPA4402, na isang uncharacterized 10.5kDa protein na may tatlong hinulaang transmembrane helices (TMH) (16). Iminumungkahi naming palitan ang pangalan ng rpa4402 gene na nagko-encode ng protein W sa pufW upang maging naaayon sa nomenklatura na ginagamit para sa mga gene na nagko-encode ng RC-L, M (pufL, pufM) at LH1α, β (pufA, pufB) subunits. Kapansin-pansin, ang protein-W ay makikita lamang sa humigit-kumulang 10% ng RC-LH1, na nagpapakita na ang Rps. palustris ay lumilikha ng dalawang magkaibang RC-LH1 complexes. Dito, iniuulat namin ang high-resolution cryo-EM (cryo-EM) structures ng dalawang core complexes, ang isa ay may protein W at 14 αβ heterodimers, ang isa ay walang protein W at isang closed 16 Heterodimer LH1 loop. Ang aming istraktura ay kumakatawan sa isang hakbang na pagbabago sa pag-unawa sa RC-LH1 complex ng Rps. palustris, dahil sinuri namin ang homogenous na populasyon ng bawat variant at may sapat na resolution upang malinaw na italaga ang bawat peptide at bound pigments at mga kaugnay na lipid at quinones. Ang paghahambing ng mga istrukturang ito ay nagpapakita na ang tatlong TMH protein-W na hindi pa natagpuan sa anumang iba pang RC-LH1 complex sa ngayon ay bumubuo ng isang quinone channel upang mapabilis ang palitan ng quinone/quinolone. Natukoy ang ilang napreserbang lipid at quinone binding sites, at nagsiwalat kami ng isang bagong pagbabago sa conformation pagkatapos ng kombinasyon ng quinone at RC, na maaaring angkop para sa photosystem II (PSII) RC ng mga oxygenated phototrophic organisms. Ang aming mga natuklasan ay nagbibigay ng mga bagong pananaw sa kinetics ng quinone/quinolone binding at exchange sa RC-LH1 core complex ng mga purple phototrophic bacteria.
Upang mapadali ang isang detalyadong pag-aaral ng dalawang complex na natagpuan sa Rps. palustris, ihihiwalay namin ang bawat RC-LH1 sa pamamagitan ng mga pamamaraang biochemical. Ang protein W-deficient complex (mula rito ay tatawaging ΔpufW) ay pinadalisay mula sa strain na kulang sa pufW gene (16), at isang RC-LH1 complex lamang ang maaaring magawa. Ang protein W-containing complex ay ginawa ng isang strain. Ang protein W ng strain na ito ay binago gamit ang isang 10x His tag sa C-terminus nito, upang ang protein W-containing complex ay epektibong maisama sa karamihan ng kulang na protein W sa pamamagitan ng pag-immobilize ng metal. Ang complex ay epektibong pinaghihiwalay (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Gaya ng ipinapakita sa Figure 1, ang parehong complex ay naglalaman ng tatlong sub-unit na RC (RC-L, RC-M at RC-H) na napapalibutan ng isang LH1 antenna. Ang 2.80-A na istruktura ng complex na kulang sa protein-W ay nagpapakita ng 16 na αβ heterodimer, na bumubuo ng isang saradong LH1 loop na ganap na nakapalibot sa RC, mula rito ay tatawaging RC-LH116 complex. Ang 2.65Å na istruktura ng protein-W-containing complex ay may 14-heterodimer na LH1 na hinarang ng protein-W, mula rito ay tatawaging RC-LH114-W.
(A at B) Representasyon sa ibabaw ng compound. (C at D) Mga nakadikit na pigment na ipinapahayag sa mga rod. (E at F) Ang mga complex na naobserbahan mula sa cytoplasmic surface ay may mga peptide at LH1 subunit na kinakatawan sa mga cartoon, at binibilang nang pakanan mula sa protein-W gap [naaayon sa pagnunumero ng Rba. sphaeroides complex (13)]. Para sa LH1-α, ang kulay ng protein subunit ay dilaw; para sa LH1-β, ang kulay ng protein subunit ay asul; para sa protein-W, ang protina ay pula; para sa RC-H, ito ay cyan; para sa RC-L, ito ay Orange; para sa RC-M, magenta. Ang mga cofactor ay kinakatawan ng mga rod, ang berde ay kumakatawan sa mga molekula ng BChl at BPh a, ang lila ay kumakatawan sa mga carotenoid, at ang dilaw ay kumakatawan sa mga molekula ng UQ10. (G at H) Pinalaking view ng protein-W gap sa katumbas na rehiyon ng RC-LH114-W complex (G) at RC-LH116 complex (H). Ang mga cofactor ay ipinapakita sa anyo ng pagpuno ng espasyo, ang chelated quinone ay ipinapakita sa asul. Ang protein-W gap ay itinatampok ng isang asul na putol-putol na linya sa (G), at ang maliliit na butas kung saan kumakalat ang quinone/quinolol sa singsing ng LH116 ay itinatampok ng isang itim na putol-putol na linya sa (H).
Ipinapakita ng Figure 1 (A at B) ang RC na napapalibutan ng bukas o saradong mga array ng LH1αβ heterodimer, na ang bawat isa ay nagbibigkis sa dalawang BChl at isang carotenoid (Figure 1, C at D). Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang Rps ay ang LH1 complex. Sa biosynthetic pathway ng spirulina xanthin, ang mga species na ito ay naglalaman ng magkahalong populasyon ng carotenoids (17). Gayunpaman, ang spiropyrroxanthin ang dominanteng carotenoid at ang density nito ay kasiya-siya. Samakatuwid, pinili naming imodelo ang spiroxanthin sa lahat ng LH1 binding sites. Ang alpha at beta polypeptides ay mga single TMH na may maiikling membrane outer regions (Figure 1, A, B, E, at F). Bagama't hindi naobserbahan ang density ng 17 residues sa C-terminus, ang alpha polypeptide ay nahati mula Met1 hanggang Ala46 sa parehong complexes. Ang β polypeptide ay nabawasan mula Gly4 hanggang Tyr52 sa RC-LH116, at mula Ser5 hanggang Tyr52 sa RC-LH114-W. Walang naobserbahang densidad na 3 o 4 na N-terminal o 13 na C-terminal residues (Larawan S1). Ang pagsusuri ng mass spectrometry ng pinaghalong RC-LH1 complex na inihanda mula sa wild-type strain ay nagpakita na ang nawawalang rehiyon ay resulta ng heterologous cleavage ng mga peptide na ito (Larawan S1 at S2). Naobserbahan din ang N-terminal formylation ng α-Met1 (f). Ipinakita ng pagsusuri na ang α-peptide ay binubuo ng mga residue na fMet1 hanggang Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, at ang β-peptide ay binubuo ng mga residue na Ser2 hanggang Ala53, na naaayon sa low-temperature EM density map.
Ang koordinasyon ng α-His29 at β-His36 ay naghaharap sa mga BChl; ang bawat αβ heterodimer ay nagtitipon kasama ang mga kalapit nito upang bumuo ng isang open loop (RC-LH114-W) o isang closed loop (RC-LH116) sa paligid ng RC Ang exciton coupled pigment array (Larawan 1, C at D). Kung ikukumpara sa 877 nm band ng RC-LH114-W, ang 880 nm absorption red shift ng RC-LH116 ay 3 nm (Larawan 2A). Gayunpaman, ang circular dichroism spectrum ay halos pareho (Larawan 2B), na nagpapahiwatig na bagama't mayroong malinaw na pagkakaiba sa pagitan ng open at closed loops, ang lokal na kapaligiran ng mga BChl ay halos magkapareho. Ang absorption redshift ay maaaring resulta ng nabawasang thermal motion at pagtaas ng stability sa closed loop (18, 19), ang pagbabago sa pigment coupling na dulot ng closed loop (20, 21), o isang kombinasyon ng dalawang epektong ito (11).
(A) Ultraviolet/visible/near-infrared absorption spectrum, na ang mga peak ay minarkahan ng kani-kanilang mga kaukulang pigment at na-normalize sa BPh peak sa 775 nm. (B) Circular dichroism spectrum na na-normalize sa BChl absorbance sa 805 nm. (C at D) Mga piling ΔA spectra mula sa time-resolved absorption spectra ng RC-LH114-W complex (C) at RC-LH116 complex (D). Para sa mas mahusay na paghahambing, lahat ng spectra ay na-normalize sa ∆A ng −A sa 0.2 ps. (E) Ang rate ng cytochrome c2 oxidation pagkatapos ng irradiation sa presensya ng iba't ibang konsentrasyon ng UQ2 (tingnan ang Figure S8 para sa raw data). (F) Sa mga cell na lumaki sa ilalim ng low, medium o high intensity light (10, 30 o 300μMm-2 s-1, ayon sa pagkakabanggit), ang protein W at RC-L subunits sa purified complex at ang separated membrane ratio. Tukuyin ang antas ng protina sa pamamagitan ng SDS-polyacrylamide gel electrophoresis at immunoassay (tingnan ang Figure S9 para sa hilaw na datos). Tukuyin ang ratio kaugnay ng pinadalisay na RC-LH114-W complex. Ang stoichiometric ratio ng RC-L sa protein-W ng complex ay 1:1.
Ang mga BChl sa posisyon 1 sa deformed αβ14 loop ng RC-LH114-W (Larawan 1, A, C, at E) ay mas malapit sa RC primary donor (P) ng 6.8Å kaysa sa katumbas na mga BChl sa RC-LH116 (Larawan 1, B, D, at F, at Larawan S3); gayunpaman, ang transient absorption kinetics ng dalawang complex ay nagpapakita na para sa RC-LH114-W at RC-LH116, ang excitation energy transfer time constants mula LH1 hanggang RC ay 40 ±4 at 44 ±3 ps (Larawan 2). , C at D, Larawan S4 at Talahanayan S2). Wala ring makabuluhang pagkakaiba sa electronic transfer sa loob ng RC (Larawan S5 at kaugnay na supplementary text). Pinaghihinalaan namin na ang malapit na pagkakatugma ng oras ng paglipat ng enerhiya sa pagitan ng LH1 at RC-P ay dahil sa magkatulad na distansya, anggulo at potensyal na enerhiya ng karamihan sa mga BChl sa dalawang LH1 loop. Tila ang paggalugad sa pattern ng enerhiya ng LH1 upang maabot ang pinakamababang distansya ay hindi mas mabilis kaysa sa direktang paglipat ng enerhiya mula sa mga suboptimal na lugar patungo sa RC. Ang open-loop LH1 loop sa RC-LH114-W ay maaari ring sumailalim sa hindi gaanong mahalagang thermal motion sa ilalim ng mga kondisyon ng mababang temperatura para sa structural analysis, at mayroong mas mahabang αβ14 ring conformation sa temperatura ng silid mula sa distansya ng pigmentation ng βBChls sa posisyon ng RC 1.
Ang RC-LH116 complex ay naglalaman ng 32 BChls at 16 carotenoids, at ang pangkalahatang pagkakaayos nito ay kapareho ng nakuha mula sa Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) at green algae (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Pagkatapos ng pagkakahanay, maliliit na paglihis lamang sa mga posisyon ng αβ heterodimers ang naobserbahan, lalo na ang 1-5, 15, at 16 (Figure S6). Ang presensya ng protein-W ay may malaking epekto sa istruktura ng LH1. Ang tatlong TMH nito ay konektado sa pamamagitan ng maiikling loop, kung saan ang N-terminal ay nasa lumen side ng complex at ang C-terminal ay nasa cytoplasmic side (Mga Figure 1A at 3, A hanggang D). Ang Protein-W ay halos hydrophobic (Larawan 3B), at ang TMH2 at TMH3 ay nakikipag-ugnayan sa LH1αβ-14 upang bumuo ng isang transmembrane surface (Larawan 3, B at E hanggang G). Ang interface ay pangunahing binubuo ng mga Phe, Leu at Val residue sa rehiyon ng transmembrane. Ang mga residue na ito ay nakasalansan ng mga hydrophobic amino acid at αβ-14 pigment. Ang ilang polar residue ay nakakatulong din sa interaksyon, kabilang ang hydrogen bond sa pagitan ng W-Thr68 at β-Trp42 sa ibabaw ng complex cavity (Larawan 3, F at G). Sa ibabaw ng cytoplasm, ang Gln34 ay katabi ng keto group ng αβ-14 carotenoids. Bukod pa rito, ang n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) molecule ay na-resolve, at ang hydrophobic tail nito ay lumawak sa interface sa pagitan ng protein-W at αβ-14, at ang lipid tail ay maaaring matatagpuan sa katawan. Napansin din namin na ang mga rehiyon ng resolusyon ng C-terminal ng protina W at RCH ay magkalapit, ngunit hindi saklaw ng pagbuo ng mga partikular na interaksyon (Larawan 1, A at E). Gayunpaman, maaaring may mga interaksyon sa hindi pa nareresolbang mga C-terminal amino acid ng dalawang protinang ito, na maaaring magbigay ng mekanismo para sa recruitment ng protina-W habang binubuo ang RC-LH114-W complex.
(A) Ang Protein-W, na nakaharap sa interface ng LH1αβ14 sa anyong kartun, ay may hugis-rod na side chain (pula), na ipinapakita sa isang bahagi ng electrostatic potential diagram (transparent gray surface na may contour level na 0.13). (B) Ang Protein-W ay kinakatawan ng isang hydrophobic colored surface. Ang mga polar at charged area ay ipinapakita sa cyan, ang mga hydrophobic area ay ipinapakita sa puti, at ang mga strongly hydrophobic area ay ipinapakita sa orange. (C at D) Ang Protein-W ay kinakatawan sa cartoon, ang oryentasyon nito ay kapareho ng sa (A) (C), at iniikot ng 180° (D). Ayon sa posisyon sa sequence, ang mga nakikilalang residue ay gumagamit ng rainbow color scheme, kung saan ang N-terminal ay asul at ang C-terminal ay pula. (E) Ang Protein-W sa parehong view tulad ng sa (A), at ang mga residue sa interface ng protein-W:LH1 ay kinakatawan ng mga rod na may nakakabit na marka. (F) Ang Protein-W ay iniikot nang 90° kaugnay ng (E) at LH1αβ14 sa representasyon ng cartoon, at kaugnay ng mga residue ng interface sa representasyon ng bar. Ang mga nakalaylay na residue mula sa beta polypeptide ay may label. Ang cofactor ay ipinapakita bilang isang bar na tumutugma sa kulay ng Figure 1, ang nabulok na β-DDM ay ipinapakita sa kulay abo, at ang oxygen ay ipinapakita sa pula. (G) Ang view sa (F) ay iniikot nang 180°, kasama ang mga prominenteng residue ng may label na alpha polypeptide.
Pinapalitan ng Protein-W ang isang αβ heterodimer (ang ika-15 sa Figure 1F), sa gayon ay pinipigilan ang pagsasara ng loop at ikiling ang unang tatlong αβ heterodimer. Naobserbahan na ang pinakamataas na anggulo ng pagkahilig ng unang αβ-1 heterodimer kaugnay ng normal na pelikula ay 25° hanggang 29° (Figure 1, A at E), na nabuo ng 2° hanggang 8° na pagkahilig ng αβ-1 sa RC A sharp contrast-LH116 (Figure 1, B at F). Ang pangalawa at pangatlong heterodimer ay nakakiling sa 12° hanggang 22° at 5° hanggang 10°, ayon sa pagkakabanggit. Dahil sa steric hindrance ng RC, ang pagkahilig ng αβ-1 ay hindi kasama ang pangalawang pares ng αβ (na tumutugma sa ika-16 na αβ sa Figure 1F), kaya bumubuo ng isang malinaw na puwang sa singsing ng LH1 (Figure 1, A at E). Dahil sa kakulangan ng dalawang αβ heterodimer, na sinamahan ng pagkawala ng apat na BChl at dalawang carotenoid, wala sa mga carotenoid ang nagbibigkis sa baluktot na αβ-1 subunit, na nagreresulta sa isang LH114-W ring na naglalaman ng 13 carotenoid Vegetarian at 28 BChl. Ang mga lokal na pagtatantya ng resolusyon ng dalawang complex sa mga rehiyon ng αβ1 hanggang 7 ay mas mababa kaysa sa iba pang bahagi ng LH1 loop, na maaaring sumasalamin sa likas na plasticity ng LH1 subunit na katabi ng RC QB site (Larawan 4).
Ang mga larawan ng RC-LH114-W (A at B) at RC-LH116 (C at D) ay ipinapakita mula sa parehong top view/side view (A at B) (A at C) at cavity surface ng Fig. 1. (B at D). Ang mga colored key ay ipinapakita sa kanan.
Ang tanging iba pang katangiang core complex na may stoichiometric ratio na 1:14 ay ang Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Gayunpaman, ang protein W at PufX ay walang malinaw na homology, at may malaking epekto sa kani-kanilang mga istruktura ng LH1. Ang PufX ay isang nag-iisang TMH na may N-terminal cytoplasmic domain na nakikipag-ugnayan sa cytoplasmic side ng RC-H subunit (13) sa isang posisyon na katumbas ng Rps. palustris LH116αβ-16. Lumilikha ang PufX ng isang channel para sa quinone/quinolone exchange sa pagitan ng RC-LH1 at ng cytochrome bcl complex at naroroon sa lahat ng Rba. sphaeroides core complex (13). Bagama't ang monomer-monomer interface ay nasa Rba. Ang sphaeroides RC-LH1-PufX dimer ay matatagpuan sa posisyon ng pagbubuklod ng protina W sa RC-LH114-W, at ang puwang na dulot ng PufX at protina-W ay nasa katumbas na posisyon (Larawan S7A). Ang puwang sa RC-LH114-W ay nakahanay din sa hipotetikal na quinone channel (8) ng Pseudomonas rosea LH1, na nabuo ng mga peptide na walang kaugnayan sa protina W o PufX (Larawan S7B). Bukod pa rito, ang quinone channel sa Blc. Ang esmeralda berdeng LH1 na nabuo sa pamamagitan ng pagbubukod ng isang γ subunit (7) ay matatagpuan sa magkatulad na posisyon (Larawan S7C). Bagama't namamagitan sa iba't ibang protina, ang paglitaw ng mga quinone/quinolol channel na ito sa isang karaniwang posisyon sa RC-LH1 complex ay tila isang halimbawa ng convergent evolution, na nagpapahiwatig na ang puwang na nilikha ng protina W ay maaaring kumilos bilang isang quinone channel.
Ang puwang sa LH114-W loop ay nagpapahintulot sa pagbuo ng isang tuluy-tuloy na rehiyon ng lamad sa pagitan ng panloob na espasyo ng RC-LH114-W complex at ng bulk membrane (Larawan 1G), sa halip na pagkonekta sa dalawang domain sa pamamagitan ng isang butas ng protina tulad ng sa mga protina. Ang RC-LH116 complex ay katulad ng isang saradong Tch. Needle-like complex (22) (Larawan 1H). Dahil ang pagkalat ng quinone sa pamamagitan ng lamad ay mas mabilis kaysa sa pagkalat sa makitid na channel ng protina, ang bukas na LH114-W loop ay maaaring magpahintulot ng mas mabilis na RC turnover kaysa sa saradong LH116 loop, at ang pagkalat ng quinone sa RC ay maaaring mas limitado. Upang masubukan kung ang protina W ay nakakaapekto sa conversion ng mga quinones sa pamamagitan ng RC, nagsagawa kami ng cytochrome oxidation assay sa isang tiyak na konsentrasyon ng ubiquinone 2 (UQ2) (isang analogue ng natural na UQ10 na may mas maikling isoprene tail) (Larawan 2E). Bagama't ang presensya ng chelated quinone ay humahadlang sa tumpak na pagtukoy ng maliwanag na Michaelis constant (ang RC-LH114-W at RC-LH116 ay angkop para sa 0.2±0.1μM at 0.5±0.2μM, ayon sa pagkakabanggit), ang pinakamataas na rate ng RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) ay 28±5% na mas malaki kaysa sa RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Sa simula, tinantya namin na ang protein-W ay nasa humigit-kumulang 10% ng core complex (16); dito, ang occupancy rates ng low-light, medium-light, at high-light growth cells ay 15±0.6%, 11±1% at 0.9±0.5, ayon sa pagkakabanggit % (Figure 2F). Ipinakita ng quantitative comparison ng mass spectrometry na ang pagdaragdag ng histidine tag ay hindi nagbawas sa relatibong kasaganaan ng protein-W kumpara sa wild-type strains (P = 0.59), kaya ang mga antas na ito ay hindi isang artifact ng modified protein-W (Figure S10). Gayunpaman, ang mababang occupancy ng protein-W sa RC-LH1 complex ay maaaring magpahintulot sa ilang RC na mag-flip sa mas mabilis na rate, sa gayon ay pinapahina ang mas mabagal na quinone/quinolone exchange sa RC-LH116 complex. Napansin namin na ang mataas na light occupancy rate ay hindi naaayon sa kamakailang datos ng transcriptomics, na nagpapahiwatig na ang pufW gene expression ay tumataas sa ilalim ng malakas na liwanag (Figure S11) (23). Ang pagkakaiba sa pagitan ng transkripsyon ng pufW at pagsasama ng protein-W sa RC-LH1 complex ay nakalilito at maaaring sumasalamin sa kumplikadong regulasyon ng protina.
Sa RC-LH114-W, 6 na cardiolipin (CDL), 7 phosphatidylcholine (POPC), 1 phosphatidylglycerol (POPG) at 29 na β-DDM molecules ang inilalaan at minodelo dito—6 na CDL, 24 na POPC, 2 POPG at 12 βDDM. RC-LH116 (Larawan 5, A at B). Sa dalawang istrukturang ito, ang CDL ay halos matatagpuan sa cytoplasmic na bahagi ng complex, habang ang POPC, POPG at β-DDM ay kadalasang matatagpuan sa luminal na bahagi. Dalawang molekula ng lipid at detergent ang ihiwalay sa rehiyon ng αβ-1 hanggang αβ-6 ng RC-LH114-W complex (Larawan 5A), at lima ang ihiwalay sa katumbas na rehiyon ng RC-LH116 (Larawan 5B). Mas maraming lipid ang natagpuan sa kabilang panig ng complex, pangunahin na ang CDL, na naipon sa pagitan ng RC at αβ-7 hanggang αβ-13 (Larawan 5, A at B). Ang iba pang mga lipid at detergent na may istrukturang resolusyon ay matatagpuan sa labas ng singsing ng LH1, at ang mga mahusay na resolusyong acyl chain ay umaabot sa pagitan ng mga subunit ng LH1, na pansamantalang itinalaga bilang β-DDM sa RC-LH114-W, at tinukoy bilang β-DDM sa RC Isang pinaghalong β-DDM at POPC-LH116. Ang magkatulad na posisyon ng mga chelating lipid at detergent sa ating istraktura ay nagpapahiwatig na ang mga ito ay mga binding site na may kaugnayan sa pisyolohikal (Larawan S12A). Ang mga posisyon ng mga katumbas na molekula sa Tch ay mayroon ding mahusay na pagkakapare-pareho. Gentle at Trv. Ang Strain 970 RC-LH1s (Figure S12, B hanggang E) (9, 12) at ang mga hydrogen-bonding residue ng lipid head group ay nagpakita ng medyo mahusay na konserbasyon sa pagkakahanay ng sequence (Figure S13), na nagpapahiwatig na ang Conserved CDL na nagbibigkis sa RC (24), ang mga site na ito ay maaaring ma-conserve sa RC-LH1 complex.
(A at B) Ang mga peptide ng RC-LH114-W (A) at RC-LH116 (B) ay kinakatawan ng mga cartoon, at ang mga pigment ay kinakatawan ng mga rod, gamit ang scheme ng kulay sa Figure 1. Ang mga lipid ay ipinapakita sa pula, at ang mga detergent ay ipinapakita sa kulay abo. Ang UQ na nakagapos sa mga site ng RC QA at QB ay dilaw, habang ang nakahiwalay na UQ ay asul. (C at D) Pareho ang mga tanawin gaya ng (A) at (B), na walang mga lipid. (E hanggang G) Pinalaking tanawin ng Q1(E), Q2(F) at Q3(G) mula sa RC-LH116, na may mga side chain na nag-iimpluwensya sa isa't isa. Ang mga hydrogen bond ay ipinapakita bilang mga itim na putol-putol na linya.
Sa RC-LH116, ang parehong RC QA at QB UQ, na nakikilahok sa paglilipat ng elektron sa proseso ng paghihiwalay ng karga, ay nabubulok sa kanilang mga binding site. Gayunpaman, sa RC-LH114-W, ang QB quinone ay hindi pa nareresolba at tatalakayin nang detalyado sa ibaba. Bilang karagdagan sa QA at QB quinones, dalawang chelated UQ molecules (na matatagpuan sa pagitan ng RC at LH1 rings) ang inilalaan sa istrukturang RC-LH114-W ayon sa kanilang mahusay na nareresolba na mga head group (na matatagpuan sa Q1 at Q2, ayon sa pagkakabanggit). espasyo). Figure 5C). Dalawang isoprene unit ang itinalaga sa Q1, at nireresolba ng density map ang kumpletong 10 isoprene tails ng Q2. Sa istruktura ng RC-LH116, tatlong chelated UQ10 molecules (Q1 hanggang Q3, Figure 5D) ang nareresolba, at lahat ng molekula ay may malinaw na density sa buong buntot (Figure 5, D hanggang G). Sa dalawang istruktura, ang mga posisyon ng mga grupo ng ulo ng quinone ng Q1 at Q2 ay may mahusay na pagkakapare-pareho (Larawan S12F), at nakikipag-ugnayan lamang ang mga ito sa RC. Ang Q1 ay matatagpuan sa pasukan ng W gap ng RC-LH114-W (Larawan 1G at 5, C, D at E), at ang Q2 ay matatagpuan malapit sa QB binding site (Larawan 5, C, D) at F). Ang mga nakonserbang residue ng L-Trp143 at L-Trp269 ay napakalapit sa Q1 at Q2 at nagbibigay ng mga potensyal na interaksyon ng π-stacking (Larawan 5, E at F, at Larawan S12). Ang L-Gln88, 3.0 Å mula sa distal oxygen ng Q1, ay nagbibigay ng isang malakas na hydrogen bond (Larawan 5E); ang residue na ito ay nakonserba sa lahat ng RC maliban sa pinakamalayong relasyon (Larawan S13). Ang L-Ser91 ay konserbatibong pinapalitan ng Thr sa karamihan ng iba pang RC (Larawan S13), ay 3.8 Angstroms mula sa methyl oxygen ng Q1, at maaaring magbigay ng mahihinang hydrogen bond (Larawan 5E). Ang Q3 ay tila walang partikular na interaksyon, ngunit matatagpuan sa hydrophobic region sa pagitan ng RC-M subunit at ng LH1-α subunit 5 hanggang 6 (Larawan 5, D at G). Ang Q1, Q2 at Q3 o ang kalapit na chelated quinones ay naresolba rin sa Tch. Gentle, Trv. Strain 970 at Blc. Ang istruktura ng iris (9, 10, 12) ay tumutukoy sa isang nakonserba na auxiliary quinone binding site sa RC-LH1 complex (Larawan S12G). Ang limang nabulok na UQ sa RC-LH116 ay mahusay na tumutugma sa 5.8±0.7 ng bawat complex na tinutukoy ng high performance liquid chromatography (HPLC), habang ang tatlong nabulok na UQ sa RC-LH114-W ay mas mababa kaysa sa . Ang nasukat na halaga na 6.2±0.3 (Fig. S14) ay nagpapahiwatig na may mga hindi pa nalulutas na mga molekula ng UQ sa istruktura.
Ang mga pseudo-symmetric na L at M polypeptide ay naglalaman ng tig-limang TMH at bumubuo ng isang heterodimer na pinagsasama ang isang BChl dimer, dalawang BChl monomer, dalawang bacteriophage (BPh) monomer, at isang non-Heme iron at isa o dalawang UQ10 molecule. Sa pamamagitan ng presensya ng mga hydrogen bond sa terminal ketone group at ang kilalang akumulasyon nito sa Rps, ang mga carotenoid ay isinasama sa M-subunit, na pinangalanang cis-3,4-dehydroorhodopin. Species (25). Ang outer membrane domain ng RC-H ay nakaangkla sa membrane ng isang TMH. Ang pangkalahatang istruktura ng RC ay katulad ng tatlong subunit RC ng mga kaugnay na species (tulad ng Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Ang mga macrocycle ng BChl at BPh, ang carotenoid backbone at non-heme iron ay nagsasapawan sa loob ng resolution range ng mga istrukturang ito, gayundin ang UQ10 head group sa QA site at ang QB quinone sa RC-LH116 (Figure S15).
Ang pagkakaroon ng dalawang istrukturang RC na may iba't ibang rate ng okupasyon sa QB site ay nagbibigay ng isang bagong pagkakataon upang suriin ang mga pare-parehong pagbabago sa konpormasyon na kasama ng pagbubuklod ng QB quinone. Sa RC-LH116 complex, ang QB quinone ay matatagpuan sa ganap na nakagapos na posisyon na "proximal" (26), ngunit ang paghihiwalay ng RC-LH114-W ay walang QB quinone. Walang QB quinone sa RC-LH114-W, na nakakagulat dahil ang complex ay aktibo, higit pa kaysa sa RC-LH116 complex na may structurally resolved QB quinone. Bagama't ang dalawang singsing ng LH1 ay nag-chelate ng humigit-kumulang anim na quinones, lima ang structurally resolved sa saradong singsing ng RC-LH116, habang tatlo lamang ang structurally limited sa bukas na singsing ng RC-LH114-W. Ang pagtaas ng structural disorder na ito ay maaaring sumasalamin sa mas mabilis na pagpapalit ng mga RC-LH114-W QB sites, mas mabilis na quinone kinetics sa complex, at mas mataas na posibilidad na tumawid sa LH1 loop. Iminumungkahi namin na ang kakulangan ng UQ sa RC QB site ng RC-LH114-W ay maaaring resulta ng isang mas kumplikado at mas aktibong complex, at ang QB site ng RC-LH114-W ay agad na tumigil sa UQ turnover. Ang partikular na yugto (ang pasukan sa QB site ay isinara) ay sumasalamin sa konpormasyon ng aktibidad na ito.
Kung wala ang QB, ang kasamang pag-ikot ng L-Phe217 sa isang posisyon na hindi tugma sa pagbubuklod ng UQ10, dahil magdudulot ito ng spatial collision sa unang isoprene unit ng buntot (Larawan 6A). Bukod pa rito, ang mga halatang pangunahing pagbabago sa konpormasyon ay halata, lalo na ang helix de (maikling helix sa loop sa pagitan ng TMH D at E) kung saan ang L-Phe217 ay inililipat sa bulsa ng pagbubuklod ng QB at ang pag-ikot ng L-Tyr223 (Larawan 6A). Upang masira ang hydrogen bond sa balangkas ng M-Asp45 at isara ang pasukan ng QB binding site (Larawan 6B). Ang helix de ay umiikot sa base nito, ang Cα ng L-Ser209 ay inililipat ng 0.33Å, habang ang L-Val221Cα ay inililipat ng 3.52Å. Walang mga naobserbahang pagbabago sa TMH D at E, na maaaring mapatong sa parehong istruktura (Larawan 6A). Sa pagkakaalam natin, ito ang unang istruktura sa natural na RC na nagsasara sa QB site. Ang paghahambing sa kumpletong (QB-bound) na istruktura ay nagpapakita na bago mabawasan ang quinone, kinakailangan ang isang pagbabago sa konpormasyon upang makapasok ito sa quinone. Ang L-Phe217 ay umiikot upang bumuo ng isang π-stacking interaction sa quinone head group, at ang helix ay gumagalaw palabas, na nagpapahintulot sa skeleton ng L-Gly222 at sa side chain ng L-Tyr223 na bumuo ng isang hydrogen bond network na may matatag na istruktura ng hydrogen bond (Larawan 6, A at C).
(A) Magkakapatong na kartun ng hologram (L chain, orange/M chain, magenta) at apo (kulay abo) na istruktura, kung saan ang mga pangunahing residue ay ipinapakita sa anyo ng isang parang baras na representasyon. Ang UQ10 ay kinakatawan ng isang dilaw na bar. Ang tuldok-tuldok na linya ay nagpapahiwatig ng mga hydrogen bond na nabuo sa buong istruktura. (B at C) Ang representasyon sa ibabaw ng apolipoprotein at ng buong istruktura ng singsing, na nagtatampok ng side chain oxygen ng L-Phe217 sa asul at L-Tyr223 sa pula, ayon sa pagkakabanggit. Ang L subunit ay orange; ang M at H subunits ay walang kulay. (D at E) Apolipoprotein (D) at buong (E) RC QB sites [kulayan ng (A) ayon sa pagkakabanggit] at Thermophilus thermophilus PSII (berde, asul na may plastic quinone; PDB ID: 3WU2) Ihanay (58).
Hindi inaasahan, bagama't may ilang istruktura ng mga RC na kulang sa QB na walang LH1 na magagamit, ang mga pagbabago sa konpormasyon na naobserbahan sa pag-aaral na ito ay hindi pa naiuulat noon. Kabilang dito ang istruktura ng pagkaubos ng QB mula sa Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) at Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), na pawang halos kapareho ng kanilang pangkalahatang istruktura ng QB. Ipinakita ng masusing pagsusuri sa 3PRC na ang mga molekula ng detergent na LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ay nagbibigkis sa pasukan ng posisyon ng QB, na maaaring pumigil sa muling pagsasaayos sa isang saradong konpormasyon. Bagama't ang LDAO ay hindi nabubulok sa parehong posisyon sa 1EYS o 1OGV, ang mga RC na ito ay inihahanda gamit ang parehong detergent at samakatuwid ay maaaring magdulot ng parehong epekto. Ang istrukturang kristal ng Rba. Ang Sphaeroides RC na co-crystallized sa cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) ay tila mayroon ding saradong QB site. Gayunpaman, sa kasong ito, ang N-terminal na rehiyon ng RC-M polypeptide (na nakikipag-ugnayan sa QB binding site sa pamamagitan ng H bond ng Tyr residue sa Q helix) ay gumagamit ng isang hindi natural na konpormasyon, at ang pagbabago sa konpormasyon ng QB ay hindi pa nasusuri (30). Ang nakakapagpapanatag ay hindi pa natin nakikita ang ganitong uri ng deformation ng M polypeptide sa istrukturang RC-LH114-W, na halos kapareho ng N-terminal na rehiyon ng RC-LH116 RC. Dapat ding tandaan na pagkatapos ng pag-eradicate ng detergent-based LH1 antenna, ang apolipoprotein RCs sa PDB ay naresolba, na nag-alis ng mga internal quinone pool at lipid sa puwang sa pagitan ng RC at ng panloob na ibabaw ng nakapalibot na LH1 ring (31, 32). Ang RC ay nananatiling gumagana dahil napapanatili nito ang lahat ng cofactor, maliban sa nabubulok na QB quinone, na hindi gaanong matatag at kadalasang nawawala sa proseso ng paghahanda (33). Bukod pa rito, alam na ang pag-alis ng LH1 at natural na cyclic lipids mula sa RC ay maaaring magkaroon ng epekto sa mga tungkulin, tulad ng pinaikling habang-buhay ng charge-separated P+QB-state (31, 34, 35). Samakatuwid, ipinapalagay namin na ang pagkakaroon ng lokal na singsing ng LH1 na nakapalibot sa RC ay maaaring mapanatili ang "saradong" QB site, sa gayon ay napapanatili ang lokal na kapaligiran malapit sa QB.
Bagama't ang apolipoprotein (walang QB quinone) at ang kumpletong istruktura ay kumakatawan lamang sa dalawang snapshot ng pagbabago ng QB site, sa halip na isang serye ng mga pangyayari, may mga indikasyon na ang pagbubuklod ay maaaring i-gated upang maiwasan ang muling pagbubuklod ng hydroquinone. Upang mapigilan ang substrate inhibition. Ang interaksyon ng quinolol at quinone malapit sa QB site ng apolipoprotein ay maaaring magkaiba, na humahantong sa pagtanggi nito ng RC. Matagal nang iminungkahi na ang mga pagbabago sa conformational ay may papel sa pagbubuklod at pagbawas ng mga quinones. Ang kakayahan ng mga nakapirming RC na bawasan ang mga quinones pagkatapos ng madilim na adaptasyon ay naapektuhan (36); Ipinapakita ng X-ray crystallography na ang pinsalang ito ay dahil sa mga QB quinones na nakulong sa isang "distal" na conformation mga 4.5 Å mula sa aktibong proximal na posisyon (26), 37). Iminumungkahi namin na ang distal binding conformation na ito ay isang snapshot ng intermediate state sa pagitan ng apolipoprotein at ng buong singsing na istruktura, na sumusunod sa unang interaksyon sa quinone at ang pagbubukas ng QB site.
Ang type II RC na matatagpuan sa PSII complex ng ilang phototrophic bacteria at cyanobacteria, algae at mga halaman ay may konserbasyon sa istruktura at tungkulin (38). Ang pagkakahanay ng istruktura na ipinapakita sa Figure 6 (D at E) ay nagbibigay-diin sa pagkakatulad sa pagitan ng mga PSII RC at ng QB site ng bacterial RC complex. Ang paghahambing na ito ay matagal nang naging modelo para sa pag-aaral ng malapit na magkakaugnay na mga sistema ng pagbubuklod at pagbawas ng quinone. Iminungkahi ng mga nakaraang publikasyon na ang mga pagbabago sa konpormasyon ay sinasamahan ng pagbawas ng PSII ng mga quinone (39, 40). Samakatuwid, kung isasaalang-alang ang ebolusyonaryong konserbasyon ng RC, ang mekanismo ng pagbubuklod na ito na dati ay hindi naobserbahan ay maaari ring magamit sa QB site ng PSII RC sa mga oxygenated phototrophic na halaman.
Ang Rps ΔpufW (walang label na pufW deletion) at PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W na ipinahayag mula sa natural na pufW locus) strains. Ang palustris CGA009 ay inilarawan sa aming nakaraang gawain (16). Ang mga strain na ito at ang isogenic wild-type parent ay nakuha mula sa freezer sa pamamagitan ng pag-streak ng isang maliit na bilang ng mga cell sa PYE (bawat 5 g litro -1) (nakaimbak sa LB sa -80 °C, na naglalaman ng 50% (w/v) glycerol) protein, yeast extract at succinate) agar [1.5% (w/v)] plate. Ang plate ay in-incubate magdamag sa dilim sa temperatura ng silid sa ilalim ng anaerobic na mga kondisyon, at pagkatapos ay niliwanagan ng puting ilaw (~50 μmolm-2 s-1) na ibinigay ng OSRAM 116-W halogen bulbs (RS Components, UK) sa loob ng 3 hanggang 5 araw hanggang sa lumitaw ang isang kolonya. Isang kolonya ang ginamit upang mag-inoculate ng 10 ml ng M22+ medium (41) na dinagdagan ng 0.1% (w/v) casamino acids (mula rito ay tatawaging M22). Ang kultura ay pinalaki sa ilalim ng mga kondisyon ng mababang oxygen sa dilim sa 34°C na may pag-alog sa 180 rpm sa loob ng 48 oras, at pagkatapos ay 70 ml ng kultura ang iinoculate sa ilalim ng parehong mga kondisyon sa loob ng 24 oras. Isang semi-aerobic culture na may volume na 1 ml ang ginamit upang mag-inoculate ng 30 ml ng M22 medium sa isang 30 ml universal screw-top transparent glass bottle at ini-irradiate gamit ang agitation (~50μmolm-2 s-1) sa loob ng 48 oras sa pamamagitan ng sterile magnetic force Stirring rod. Pagkatapos, 30 ml ng kultura ang iinoculate ng humigit-kumulang 1 litro ng kultura sa ilalim ng parehong mga kondisyon, na ginamit upang mag-inoculate ng humigit-kumulang 9 na litro ng kultura na inilawan sa ~200 μmolm-2 s-1 sa loob ng 72 oras. Ang mga selula ay kinunan sa pamamagitan ng centrifugation sa 7132 RCF sa loob ng 30 minuto, muling isinalin sa ~10 ml ng 20 mM tris-HCl (pH 8.0), at itinago sa -20°C hanggang sa kailanganin.
Pagkatapos matunaw, magdagdag ng ilang kristal ng deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) at dalawang Roche holoenzyme protease inhibitor tablets (Merck, UK) sa mga muling sinuspinde na selula. Sa isang 20,000 psi French pressure cell (Aminco, USA), ang mga selula ay ginulo nang 8 hanggang 12 beses. Matapos tanggalin ang mga hindi nasirang selula at hindi natutunaw na mga debris sa pamamagitan ng centrifugation sa 18,500 RCF sa loob ng 15 minuto sa 4°C, ang lamad ay pinalabas mula sa pigmented lysate sa pamamagitan ng centrifugation sa 113,000 RCF sa loob ng 2 oras sa 43,000°C. Itapon ang soluble fraction at muling isuspinde ang may kulay na lamad sa 100 hanggang 200 ml ng 20 mM tris-HCl (pH 8.0) at i-homogenize hanggang sa wala nang nakikitang mga aggregate. Ang nakabitin na lamad ay in-incubate sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) na naglalaman ng 2% (w/v) β-DDM sa loob ng 1 oras sa dilim sa 4°C na may dahan-dahang paghahalo. Pagkatapos ay i-centrifuge sa 70°C upang matunaw ang 150,000 RCF sa 4°C sa loob ng 1 oras upang maalis ang mga natitirang hindi natutunaw na sangkap.
Ang solubilizing membrane mula sa ΔpufW strain ay inilapat sa isang 50 ml DEAE Sepharose ion exchange column na may tatlong column volumes (CV) ng binding buffer [20 mM tris-HCl (pH 8.0) na naglalaman ng 0.03% (w/v) β-DDM]. Hugasan ang column gamit ang dalawang CV binding buffers, at pagkatapos ay hugasan ang column gamit ang dalawang binding buffers na naglalaman ng 50 mM NaCl. Ang RC-LH116 complex ay ni-elute na may linear gradient na 150 hanggang 300 mM NaCl (sa binding buffer) sa 1.75 CV, at ang natitirang binding complex ay ni-elute gamit ang isang binding buffer na naglalaman ng 300 mM NaCl sa 0.5 CV. Kolektahin ang absorption spectrum sa pagitan ng 250 at 1000 nm, panatilihin ang fraction na may absorbance ratio (A880/A280) na mas malaki sa 1 sa 880 hanggang 280 nm, palabnawin ito nang dalawang beses sa binding buffer, at gamitin muli ang parehong pamamaraan sa DEAE column. Sa purification. Palabnawin ang mga fraction na may A880/A280 ratios na mas mataas sa 1.7 at A880/A805 ratios na mas mataas sa 3.0, isagawa ang ikatlong round ng ion exchange, at panatilihin ang mga fraction na may A880/A280 ratios na mas mataas sa 2.2 at A880/A805 ratios na mas mataas sa 5.0. Ang bahagyang napurong complex ay pinatingkad sa ~2 ml sa isang Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) centrifugal filter (Merck, UK), at inilagay sa isang Superdex 200 16/600 size exclusion column (GE Healthcare, US) na naglalaman ng 200 mM NaCl buffer, at pagkatapos ay ini-elute sa parehong buffer sa 1.5 CV. Kolektahin ang absorption spectra ng size exclusion fraction, at i-concentrate ang absorption spectra gamit ang A880/A280 ratios na higit sa 2.4 at A880/A805 ratios na higit sa 5.8 hanggang 100 A880, at agad na gamitin ang mga ito para sa paghahanda o pag-iimbak ng cryo-TEM grid. Panatilihin sa -80°C hanggang sa kinakailangan.
Ang solubilizing membrane mula sa PufW-His strain ay inilapat sa isang 20 ml na HisPrep FF Ni-NTA Sepharose column (20 mM tris-HCl (pH 8.0) na naglalaman ng 200 mM NaCl at 0.03% (w/w)) sa IMAC buffer (GE Healthcare). v) β-DDM. Ang column ay hinugasan gamit ang limang CV ng IMAC buffer, at pagkatapos ay gamit ang limang CV ng IMAC buffer na naglalaman ng 10 mM histidine. Ang core complex ay inalis mula sa column gamit ang limang IMAC buffer na naglalaman ng 100 mM histidine. Ang fraction na naglalaman ng RC-LH114-W complex ay kino-concentrate sa ~10 ml sa isang stirred tank na may Amicon 100,000 MWCO filter (Merck, UK), diluted ng 20 beses gamit ang binding buffer, at pagkatapos ay idinagdag sa 25 ml. Sa DEAE Sepharose column, apat na CV na nakagapos sa buffer ang ginagamit nang maaga. Hugasan ang column gamit ang apat na CV binding buffers, pagkatapos ay i-elute ang complex sa walong CV sa isang linear gradient na 0 hanggang 100 mM NaCl (sa binding buffer), at ang natitirang apat na CV na naglalaman ng 100 mM binding buffer. Ang mga residual complexes na i-elute sa sodium chloride na sinamahan ng A880/A280 ratio na mas mataas sa 2.4 at ang A880/A805 ratio na mas mataas sa 4.6 na fraction ay kinonsentra sa ~2 ml sa isang Amicon 100,000 MWCO centrifugal filter, at pinuno ng 1.5 CV IMAC. Inayos ng buffer ang Superdex 200 16/600 size exclusion column, at pagkatapos ay i-elute sa parehong buffer sa 1.5 CV. Kolektahin ang absorption spectra ng mga size-exclusion fraction at i-concentrate ang absorption spectra gamit ang A880/A280 ratios na higit sa 2.1 at A880/A805 ratios na higit sa 4.6 hanggang 100. A880 ay agad na ginagamit para sa paghahanda ng frozen TEM grid o iniimbak sa -80°C hanggang sa kailanganin.
Isang Leica EM GP immersion freezer ang ginamit upang maghanda ng mga low temperature TEM grid. Ang complex ay diluted sa IMAC buffer sa A880 na 50, at pagkatapos ay 5μl ang inilagay sa isang bagong glow-discharged na QUANTIFOIL 1.2/1.3 carbon-coated copper mesh (Agar Scientific, UK). I-incubate ang grid sa 20°C at 60% relative humidity sa loob ng 30 segundo, pagkatapos ay i-blot ito para matuyo sa loob ng 3 segundo, at pagkatapos ay i-quench ito sa liquid ethane sa -176°C.
Ang datos ng RC-LH114-W complex ay naitala sa eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) gamit ang isang Titan Krios microscope, na gumagana sa accelerating voltage na 300kV, na may nominal magnification na 130,000× at enerhiya na 20 eV. Isang Gatan 968 GIF Quantum na may K2 peak detector ang ginamit upang magrekord ng mga imahe sa counting mode upang mangolekta ng datos. Ang calibrated pixel size ay 1.048Å, at ang dose rate ay 3.83 e-Å-2s-1. Kinolekta ang pelikula sa loob ng 11 segundo at hinati ito sa 40 bahagi. Gamitin ang carbon-coated area upang muling i-focus ang mikroskopyo, at pagkatapos ay mangolekta ng tatlong pelikula bawat butas. Sa kabuuan, 3130 na pelikula ang nakolekta, na may mga defocus value sa pagitan ng -1 at -3μm.
Ang datos para sa RC-LH116 complex ay kinolekta gamit ang parehong mikroskopyo sa Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, UK). Ang datos ay kinolekta sa counting mode na may magnification na 130 k, at ang laki ng pixel ay na-calibrate sa 1.065 Å na may dosis na 4.6 e-Å-2s-1. Ang pelikula ay naitala sa loob ng 12 segundo at hinati sa 48 na bahagi. Sa kabuuan, 3359 na pelikula ang nakolekta, na may mga defocus value sa pagitan ng -1 at -3μm.
Ang lahat ng pagproseso ng datos ay isinasagawa sa Relion 3.0 pipeline (42). Gamitin ang Motioncorr 2 (43) upang itama ang galaw ng beam sa pamamagitan ng dose weighting, at pagkatapos ay gamitin ang CTFFIND 4.1 (44) upang matukoy ang parameter ng CTF (contrast transfer function). Ang karaniwang mga photomicrograph pagkatapos ng mga unang yugto ng pagproseso na ito ay ipinapakita sa Figure 2. S16. Ang awtomatikong template ng pagpili ay nabubuo sa pamamagitan ng manu-manong pagpili ng humigit-kumulang 250 pixel ng 1000 particle sa isang 250-pixel frame at walang sangguniang two-dimensional (2D) na klasipikasyon, sa gayon ay tinatanggihan ang mga klasipikasyon na nakakatugon sa kontaminasyon ng sample o walang nakikitang mga katangian. Pagkatapos, isinagawa ang awtomatikong pagpili sa lahat ng microphotograph, at ang RC-LH114-W ay 849,359 na particle, at ang RC-LH116 complex ay 476,547 na particle. Ang lahat ng napiling partikulo ay sumailalim sa dalawang round ng non-reference 2D classification, at pagkatapos ng bawat pagtakbo, ang mga partikulo na nakakatugon sa carbon area, sample contamination, walang halatang katangian o malakas na nagsasapawan na mga partikulo ay tinatanggihan, na nagreresulta sa 772,033 (90.9%) at 359,678 (75.5%) (mga partikulo) ang ginagamit para sa 3D classification ng RC-LH114-W at RC-LH116 ayon sa pagkakabanggit. Ang unang 3D reference model ay nabuo gamit ang stochastic gradient descent method. Gamit ang unang modelo bilang reference, ang mga napiling partikulo ay inuri sa apat na kategorya sa 3D. Gamit ang modelo sa kategoryang ito bilang reference, magsagawa ng 3D refining sa mga partikulo sa pinakamalaking kategorya, pagkatapos ay gamitin ang unang 15Å low-pass filter upang masakop ang solvent area, magdagdag ng 6 na pixel ng malalambot na gilid, at i-post-process ang mga pixel upang itama ang Gatan K2 peak Modulation transfer function ng top detector. Para sa dataset ng RC-LH114-W, ang paunang modelong ito ay binago sa pamamagitan ng pag-alis ng malakas na densidad sa mga gilid ng mask (na hindi konektado sa densidad ng core complex sa UCSF Chimera). Ang mga nagresultang modelo (ang mga resolusyon ng RC-LH114-W at RC-LH116 ay 3.91 at 4.16 Å, ayon sa pagkakabanggit) ay ginamit bilang sanggunian para sa ikalawang round ng 3D classification. Ang mga particle na ginamit ay pinagsama-sama sa paunang 3D class at walang malakas na ugnayan sa kapitbahayan. May overlap o kawalan ng halatang mga tampok na istruktura. Pagkatapos ng ikalawang round ng 3D classification, ang kategorya na may pinakamataas na resolusyon ang napili [Para sa RC-LH114-W, ang isang kategorya ay 377,703 particle (44.5%), para sa RC-LH116, mayroong dalawang kategorya, na may kabuuang 260,752 particle (54.7%), kung saan pareho lamang ang mga ito kapag nakahanay pagkatapos ng paunang pag-ikot na may maliit na pagkakaiba]. Ang mga napiling partikulo ay muling kinukuha sa isang 400-pixel na kahon at pinipino sa pamamagitan ng 3D refining. Ang solvent mask ay nabubuo gamit ang paunang 15Å low-pass filter, 3 pixel map expansion at 3 pixel soft mask. Gamit ang per-particle CTF refinement, per-particle motion correction at ang pangalawang round ng per-particle CTF refinement, 3D refinement, solvent masking at post-processing ay isinasagawa pagkatapos ng bawat hakbang upang higit pang pinuhin ang nagresultang tekstura. Gamit ang FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) cut-off value na 0.143, ang mga resolution ng mga panghuling modelo ng RC-LH114-W at RC-LH116 ay 2.65 at 2.80Å, ayon sa pagkakabanggit. Ang FSC curve ng panghuling modelo ay ipinapakita sa Figure 2. S17.
Ang lahat ng mga sequence ng protina ay na-download mula sa UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Ginamit ang SWISS-MODEL (45) upang bumuo ng isang homology model ng RC, na naglalaman ng mga sequence ng protina ng RC-L, RC-M at RC-H at ang crystal structure ng Rba. Ang sphaeroides RC ay ginamit bilang isang template (PDB ID: 5LSE) (46). Gamitin ang tool na "fit map" sa UCSF Chimera upang iangkop ang nabuong modelo sa mapa (47), pagbutihin ang istruktura ng protina, at gamitin ang cofactor [4×BChl a (pangalan ng residue ng monomer library = BCL), 2×BPh a (BPH), isa o dalawang uri ng UQ10 (U10), isang non-heme iron (Fe) at isang 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] upang idagdag. Dahil ang QAK ay hindi magagamit sa monomer library, ito ay na-parameterize gamit ang eLBOW tool sa PHENIX (49).
Sumunod, binuo ang LH1 subunit. Sa simula, ginamit ang automatic construction tool sa PHENIX (49) upang awtomatikong bumuo ng bahagi ng LH1 sequence gamit ang map at ang LH1-α at LH1-β protein sequences bilang input. Piliin ang pinakakumpletong LH1 subunit, kunin ito at i-load sa Coot, manu-manong idagdag ang nawawalang sequence dito, at manu-manong pinuhin ang buong istruktura bago idagdag ang dalawang BCl a (BCL) at isang spirilloxanthin (CRT) [ayon sa kaugnay na Rps Ang density ng LH1 complex at ang kilalang carotenoid content. Species (17)]. Kopyahin ang kumpletong LH1 subunit, at gamitin ang UCSF Chimera “Docking Map Tool” upang i-dock sa katabing non-model area ng LH1 density, at pagkatapos ay pinuhin ito sa Coot; ulitin ang proseso hanggang sa mamodelo na ang lahat ng LH1 subunit. Para sa istrukturang RC-LH114-W, sa pamamagitan ng pagkuha ng unallocated density sa Coot, ang protina ay hinahati mula sa natitirang mga sangkap na hindi protina sa mapa ng USCF Chimera at ginagamit ang Autobuild tool upang maitatag ang paunang modelo, at ang natitirang mga subunit (protein-W) Modeling. Sa PHENIX (49). Idagdag ang anumang nawawalang mga sequence sa nagresultang modelo sa Coot (48), at pagkatapos ay manu-manong pinuhin ang buong subunit. Ang natitirang unallocated density ay umaangkop sa kumbinasyon ng mga lipid (PDB monomer library ID ng CDL = CDL, POPC = 6PL at POPG = PGT), β-DDM detergent (LMT) at mga molekula ng UQ10 (U10). Gamitin ang PHENIX optimization (49) at manual optimization sa Coot (48) upang maperpekto ang kumpletong paunang modelo hanggang sa ang mga istatistika ng modelo at ang visual na kalidad ng pagkakasya ay hindi na mapabuti pa. Panghuli, gamitin ang LocScale (50) upang patalasin ang lokal na mapa, at pagkatapos ay magsagawa ng ilang iba pang mga siklo ng pagmomodelo ng unallocated density at awtomatiko at manu-manong pag-optimize.
Ang kani-kanilang mga peptide, cofactor at iba pang lipid at quinone na nakadikit sa loob ng kani-kanilang mga densidad ay ipinapakita sa Mga Larawan 1 at 2. S18 hanggang S23. Ang impormasyong pang-estadistika ng pangwakas na modelo ay ipinapakita sa Talahanayan S1.
Maliban kung may ibang tinukoy, ang UV/Vis/NIR absorption spectra ay kinolekta sa isang Cary60 spectrophotometer (Agilent, USA) sa 1 nm intervals mula 250 nm hanggang 1000 nm at isang integration time na 0.1s.
Palabnawin ang sample sa isang quartz cuvette na may 2 mm na landas patungo sa A880 na 1, at kolektahin ang absorption spectrum sa pagitan ng 400 at 1000 nm. Ang mga pabilog na dichroic spectra ay kinolekta sa isang Jasco 810 spectropolarimeter (Jasco, Japan) sa 1 nm na pagitan sa pagitan ng 400 nm at 950 nm sa isang scan rate na 20 nm min-1.
Ang molar extinction coefficient ay natutukoy sa pamamagitan ng pagpapalabnaw ng core complex sa isang A880 na humigit-kumulang 50. Ibabad ang 10μl na volume sa 990μl binding buffer o methanol, at kolektahin agad ang absorption spectrum upang mabawasan ang BChl degradation. Ang nilalaman ng BChl ng bawat methanol sample ay kinalkula gamit ang extinction coefficient sa 771 nm na 54.8 mM-1 cm-1, at natukoy ang extinction coefficient (51). Hatiin ang nasukat na konsentrasyon ng BChl sa 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) upang matukoy ang konsentrasyon ng core complex, na siyang gagamitin upang matukoy ang absorption spectrum ng parehong sample na nakolekta sa buffer Extinction coefficient. parallel. Tatlong paulit-ulit na pagsukat ang kinuha para sa bawat sample, at ang average absorbance ng BChl Qy maximum ang ginamit para sa pagkalkula. Ang koepisyent ng pagkalipol ng RC-LH114-W na nasukat sa 878 nm ay 3280±140 mM-1 cm-1, habang ang koepisyent ng pagkalipol ng RC-LH116 na nasukat sa 880 nm ay 3800±30 mM-1 cm-1.
Ang UQ10 ay tinantiya ayon sa pamamaraan sa (52). Sa madaling salita, ang reverse phase HPLC (RP-HPLC) ay isinagawa gamit ang Agilent 1200 HPLC system. Tunawin ang humigit-kumulang 0.02 nmol ng RC-LH116 o RC-LH114-W sa 50μl ng 50:50 methanol:chloroform na naglalaman ng 0.02% (w/v) ferric chloride, at iturok ang pre-equilibrated na Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm Tunawin sa 1 ml-1 min-1 sa 40°C sa HPLC solvent (80:20 methanol:2-propanol) sa isang ×25 cm column. Magsagawa ng isocratic elution sa isang HPLC solvent upang masubaybayan ang absorbance sa 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) at 780 nm (BChl) sa loob ng 1 oras. Ang peak sa 275 nm chromatogram sa loob ng 25.5 minuto ay isinama, na hindi naglalaman ng anumang iba pang natutukoy na mga compound. Ang integrated area ay ginagamit upang kalkulahin ang molar na dami ng UQ10 na nakuha na may sanggunian sa calibration curve na kinalkula mula sa pag-iniksyon ng mga purong pamantayan mula 0 hanggang 5.8 nmol (Figure S14). Ang bawat sample ay sinuri sa tatlong replicates, at ang naiulat na error ay tumutugma sa SD ng average.
Isang solusyon na naglalaman ng RC-LH1 complex na may pinakamataas na Qy absorption na 0.1 ang inihanda gamit ang 30 μM reduced horse heart cytochrome c2 (Merck, UK) at 0 hanggang 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tatlong 1-ml na sample ang inihanda sa bawat konsentrasyon ng UQ2 at in-incubate magdamag sa dilim sa 4°C upang matiyak ang kumpletong pag-aangkop sa dilim bago sukatin. Ang solusyon ay inilagay sa isang OLIS RSM1000 modular spectrophotometer na may 300 nm flame/500 line grating, 1.24 mm inlet, 0.12 mm middle at 0.6 mm outlet slits. Isang 600 nm long pass filter ang inilalagay sa pasukan ng sample phototube at ng reference photomultiplier tube upang maiwasan ang excitation light. Ang absorbance ay minanmanan sa 550 nm na may integration time na 0.15 s. Ang excitation light ay inilalabas mula sa 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) sa pamamagitan ng isang fiber optic cable na may 90% na intensidad sa pamamagitan ng isang DC2200 controller (Thorlabs Ltd., UK) at inilalabas sa pinagmumulan ng liwanag sa anggulong 90°. Ang measuring beam ay nakaharap sa salamin upang ibalik ang anumang liwanag na hindi pa nasisipsip ng sample sa simula. Subaybayan ang absorbance ng 10 s bago ang illuminance na 50 s. Pagkatapos, ang absorbance ay sinusubaybayan pa sa loob ng 60 s sa dilim upang masuri ang lawak kung saan kusang binabawasan ng quinolol ang cytochrome c23+ (tingnan ang Figure S8 para sa raw data).
Ang datos ay pinoproseso sa pamamagitan ng pag-aangkop ng isang linear na initial rate sa loob ng 0.5 hanggang 10 s (depende sa konsentrasyon ng UQ2) at pag-average ng mga rate ng lahat ng tatlong sample sa bawat konsentrasyon ng UQ2. Ang konsentrasyon ng RC-LH1 na kinalkula ng kani-kanilang extinction coefficient ay ginamit upang i-convert ang rate sa catalytic efficiency, na ipinlot sa Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), at iniakma sa modelo ng Michaelis-Menten upang matukoy ang maliwanag na mga halaga ng Km at Kcat.
Para sa mga transient absorption measurements, ang RC-LH1 sample ay diluted sa ~2μM sa IMAC buffer na naglalaman ng 50 mM sodium ascorbate (Merck, USA) at 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). Ang ascorbic acid ay ginagamit bilang sacrificial electron donor, at ang tert-butaclofen ay ginagamit bilang QB inhibitor upang matiyak na ang pangunahing RC donor ay mananatiling nabawasan (ibig sabihin, hindi photooxidized) sa buong proseso ng pagsukat. Humigit-kumulang 3 ml ng sample ang idinaragdag sa isang custom rotating cell (mga 0.1 m ang diyametro, 350 RPM) na may 2 mm optical path length upang matiyak na ang sample sa laser path ay may sapat na oras para sa dark adaptation sa pagitan ng mga excitation pulse. Gumamit ng ~100-fs laser pulses upang palakasin ang Ti: Sapphire laser system (Spectra Physics, USA) upang ma-excite ang sample sa 880 nm sa repetition rate na 1 kHz (20 nJ para sa NIR o 100 nJ para sa Vis). Bago mangolekta ng datos, ilantad ang sample sa liwanag ng excitation sa loob ng humigit-kumulang 30 minuto. Ang pagkakalantad ay magdudulot ng QA inactivation (posibleng mabawasan ang QA nang isang beses o dalawang beses). Ngunit pakitandaan na ang prosesong ito ay maaaring baligtarin dahil pagkatapos ng mahabang panahon ng pag-aangkop sa dilim, ang RC ay unti-unting babalik sa aktibidad ng QA. Isang Helios spectrometer (Ultrafast Systems, USA) ang ginamit upang sukatin ang transient spectra na may delay time na -10 hanggang 7000 ps. Gamitin ang Surface Xplorer software (Ultrafast Systems, USA) upang paghiwalayin ang mga data set, pagkatapos ay pagsamahin at i-standardize. Gamitin ang CarpetView software package (Light Conversion Ltd., Lithuania) upang gamitin ang pinagsamang data set upang makakuha ng differential spectra na may kaugnayan sa decay, o gumamit ng isang function na pinagsasama-sama ang maraming exponents sa tugon ng instrumento upang umangkop sa single-wavelength spectral evolution sa Origin (OriginLab, USA).
Gaya ng nabanggit sa itaas (53), isang photosynthetic film na naglalaman ng LH1 complex na kulang sa parehong RC at peripheral LH2 antenna ang inihanda. Ang membrane ay diluted sa 20 mM tris (pH 8.0) at pagkatapos ay inilagay sa isang quartz cuvette na may 2 mm optical path. Isang 30nJ laser pulse ang ginamit upang pasiglahin ang sample sa 540 nm na may delay time na -10 hanggang 7000 ps. Iproseso ang data set gaya ng inilarawan para sa Rps. pal sample.
Ang lamad ay pina-pellet sa pamamagitan ng centrifugation sa 150,000 RCF sa loob ng 2 oras sa 4°C, at pagkatapos ay ang absorbance nito sa 880 nm ay muling isinalin sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) at 200 mM NaCl. Tunawin ang lamad sa pamamagitan ng dahan-dahang paghahalo sa 2% (w/v) β-DDM sa loob ng 1 oras sa dilim sa 4°C. Ang sample ay pinalabnaw sa 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) hanggang sa konsentrasyon ng protina na 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad analysis). Isinagawa ang karagdagang pagproseso mula sa naunang nailathalang pamamaraan (54), simula sa pagtunaw ng 50 μg na protina sa kabuuang 50 μl TEAB na naglalaman ng 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK). Pagkatapos ng sonication sa loob ng 60 segundo, ito ay binawasan gamit ang 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) sa 37°C sa loob ng 30 minuto. Para sa S-alkylation, i-incubate ang sample gamit ang 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) at idagdag ito mula sa 200 mM isopropanol stock solution sa loob ng 10 minuto sa temperatura ng silid. Isinagawa ang proteolytic digestion sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C mixture (Promega UK) at in-incubate sa 37°C sa loob ng 3 oras. Ang laurate surfactant ay kinuha sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 50 μl ethyl acetate at 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) at vortexing sa loob ng 60 segundo. Ang phase separation ay pinabilis sa pamamagitan ng centrifugation sa 15,700 RCF sa loob ng 5 minuto. Ayon sa protocol ng gumawa, isang C18 spin column (Thermo Fisher Scientific, UK) ang ginamit upang maingat na sipsipin at alisin ang asin sa ibabang bahagi na naglalaman ng peptide. Pagkatapos matuyo sa pamamagitan ng vacuum centrifugation, ang sample ay tinunaw sa 0.5% TFA at 3% acetonitrile, at ang 500 ng ay sinuri sa pamamagitan ng nanoflow RP chromatography na sinamahan ng mass spectrometry gamit ang mga parameter ng sistema na idinetalye dati.
Gamitin ang MaxQuant v.1.5.3.30 (56) para sa pagkilala at pagkuwantipika ng protina upang maghanap ng Rps. palustris proteome database (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Ang datos ng mass spectrometry proteomics ay idineposito sa ProteomeXchange Alliance sa pamamagitan ng PRIDE partner repository (http://proteomecentral.proteomexchange.org) sa ilalim ng dataset identifier na PXD020402.
Para sa pagsusuri gamit ang RPLC na sinamahan ng electrospray ionization mass spectrometry, ang RC-LH1 complex ay inihanda mula sa wild-type Rps. Gamit ang naunang nailathalang pamamaraan (16), ang konsentrasyon ng protina na ginawa sa mga selula ng palustris ay 2 mg ml-1 sa 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl at 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis)) DDM. Ayon sa protocol ng tagagawa, gumamit ng 2D purification kit (GE Healthcare, USA) upang kumuha ng 10 μg na protina gamit ang precipitation method, at tunawin ang precipitate sa 20 μl 60% (v/v) formic acid (FA), 20% (v/v) Acetonitrile at 20% (v/v) na tubig. Limang microliters ang sinuri gamit ang RPLC (Dionex RSLC) na sinamahan ng mass spectrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gamitin ang MabPac 1.2×100 mm column (Thermo Fisher Scientific, UK) para sa paghihiwalay sa 60°C at 100μlmin -1, na may gradient na 85% (v/v) solvent A [0.1% (v/v) FA at 0.02% (V/v) TFA aqueous solution] sa 85%(v/v) solvent B [0.1%(v/v) FA at 0.02%(v/v) sa 90%(v/v) acetonitrile TFA]. Gamit ang karaniwang electrospray ionization source at mga default na parameter sa loob ng mahigit 60 minuto, ang mass spectrometer ay nakakakuha ng 100 hanggang 2750 m/z (mass-to-charge ratio). Sa tulong ng ExPASy bioinformatics resource portal FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), i-map ang mass spectrum sa mga subunit ng complex.
Ang mga selula ay pinalaki sa loob ng 72 oras sa ilalim ng 100 ml NF-low (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) o high (300μMm-2 s-1) na liwanag. M22 medium (M22 medium kung saan hindi ginagamit ang ammonium sulfate at ang sodium succinate ay pinalitan ng sodium acetate) sa isang 100 ml na bote na may tornilyo (23). Sa limang 30-s cycle, ang 0.1 micron glass beads ay ginawang beads sa volume ratio na 1:1 upang ma-lyse ang mga selula at pinalamig sa yelo sa loob ng 5 minuto. Ang hindi natutunaw na bagay, mga hindi nabasag na selula, at mga glass beads ay tinanggal sa pamamagitan ng centrifugation sa 16,000 RCF sa loob ng 10 minuto sa isang benchtop microcentrifuge. Ang lamad ay pinaghiwalay sa isang Ti 70.1 rotor na may 100,000 RCF sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) na may 40/15% (w/w) sucrose gradient sa loob ng 10 oras.
Gaya ng inilarawan sa aming nakaraang gawain, ang immunodetection ng His tag sa PufW (16). Sa madaling salita, ang purified core complex (11.8 nM) o ang membrane na naglalaman ng parehong konsentrasyon ng RC (tinutukoy sa pamamagitan ng oxidation na binabawasan ang reduced difference spectrum at tinutugma ang load sa stained gel) sa 2x SDS loading buffer (Merck, UK) ay na-dilute nang dalawang beses. Ang mga protina ay pinaghiwalay sa isang replica na 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Ang isang gel ay kinulayan ng Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) upang i-load at mailarawan ang RC-L subunit. Ang protina sa pangalawang gel ay inilipat sa methanol-activated polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Thermo Fisher Scientific, UK) para sa immunoassay. Ang PVDF membrane ay hinarang sa 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 at 5% (w/v) skimmed milk powder, at pagkatapos ay in-incubate kasama ang anti-His primary antibody (sa Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl at 0.05% (v/v) Tween-20] sa 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) sa loob ng 4 na oras. Pagkatapos hugasan nang 3 beses sa loob ng 5 minuto sa antibody buffer, ang lamad ay pinagsama sa horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) anti-mouse secondary antibody (diluted 1:10,000 sa antibody buffer). Ini-incubate upang ma-detect (5 minuto pagkatapos ng 3 paghuhugas sa antibody buffer) gamit ang WESTAR ETA C 2.0 chemiluminescence substrate (Cyanagen, Italy) at Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Sa pamamagitan ng pagguhit ng distribusyon ng intensity ng bawat stained gel o immunoassay lane, pagsasama ng area sa ilalim ng peak at pagkalkula ng intensity ratio ng RC-L (stained gel) at Protein-W (immunoassay), sa ImageJ (57) Iproseso ang imahe. Ang mga ratio na ito ay na-convert sa molar ratios sa pamamagitan ng pag-aakalang ang ratio ng RC-L sa protein-W sa purong RC-LH114-W sample ay 1:1 at pag-normalize ng buong data set nang naaayon.
Para sa mga karagdagang materyales para sa artikulong ito, pakitingnan ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ito ay isang artikulong maaaring gamitin sa open access at ipinamamahagi sa ilalim ng mga tuntunin ng Creative Commons Attribution License. Pinapayagan ng artikulong ito ang walang limitasyong paggamit, pamamahagi, at pagpaparami sa anumang midyum sa ilalim ng kondisyon na ang orihinal na akda ay wastong binanggit.
Paalala: Hinihiling lang namin sa iyo na ibigay ang iyong email address upang malaman ng taong irerekomenda mo sa pahina na gusto mong makita nila ang email at hindi ito spam. Hindi kami kukuha ng anumang email address.
Ang tanong na ito ay ginagamit upang subukan kung ikaw ay isang bisita at maiwasan ang awtomatikong pagpapadala ng spam.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Ang mataas na resolusyon na istruktura ng light trap 1 complex sa reaction center ay nagbibigay ng mga bagong pananaw sa dinamika ng quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Ang mataas na resolusyon na istruktura ng light trap 1 complex sa reaction center ay nagbibigay ng mga bagong pananaw sa dinamika ng quinone.
©2021 American Association for the Advancement of Science. lahat ng karapatan ay nakalaan. Ang AAAS ay partner ng HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef at COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.